Способ ранней диагностики тяжелой формы вирусного гепатита В Советский патент 1992 года по МПК G01N33/49 

1

(21)4823495/14 (22) 07.05.90 (46)07.10.92. Бюл. №37

(71)1-й Ленинградский медицинский институт им. акад. И.П.Павлова

(72)М.В.Юнева и Т.В.Антонова

(56) С.Н.Соринсон Вирусные гепатиты, Л., Медицина, 1987, с.263

(54) СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ТЯЖЕЛОЙ ФОРМЫ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В

(57) Использование: для диагностики заболевания до развития полной клинической картины. Цель: повышение точности диагностики. Сущность изобретения: определяют уровень малонового диальдегида в крови и активность супероксиддисмутазы в эритроцитах. При значении их соотношения более 0,225 диагностируют тяжелую форму заболевания. Положительный эффект изобретение позволяет своевременно назначать адекватную терапию, является технически несложным, доступным тестом для практических лабораторий.

Изобретение относится к медицине а именно к инфекционным болезням, и может быть использовано для ранней диагностики тяжелой формы вирусного гепатита В /ВГВ/.

Известен способ диагностики формы тяжести ВГВ клинический - по выраженности синдромов интоксикации и желтухи. Данный способ субъективен и ретроспективен. Для биохимической диагностики формы тяжести заболевания используют уровень билирубина в крови. Однако этот показатель не является достоверным при наличии безжелтушных и холестатических форм ВГВ.

Целью данного способа является повышение точности.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе ранней диагностики тяжелой формы вирусного гепатита В, включающем биохимическое исследование крови, согласно изобретению, определяют уровень малонового диальдегида /МДА/, активность супероксиддисмутазы в эритроцитах /СОДэ/ и их соотношение и при значении соотношения более 0,225 диагностируют тяжелую форму заболевания.

Уровень МДА отражает состояние процессов липопероксидации и описывает тяжесть состояния на момент обследования Активность СОДэ также является критерием, отражающим состояние системы анти- оксидантной защиты на момент обследования.

Проведенные исследования показали, что соотношение уровня МДА и активности СОДэ возможно использовать для ранней диагностики тяжелой формы ВГВ, так как это соотношение описывает как состояние системы антиоксидантной защиты, так и ее взаимосвязь с процессами липопероксидации

Критерии ранней диагностики были установлены ретроспективно, при анализе 110 больных ВГВ легкой, среднетяжелой и тяжелой формами заболевания, статистически обработаны.

Способ может быть осуществлен следующим образом: определение активности СОДэ производится общеизвестным спосоСО

С

Iх1

О XI

N ю

00

бом (Fried К. Enzematic and non-enzymatic assay of superoxid dismutase. Biochemie, 1975, 57, p.637 - 660). Метод основан на способности СОД ингибировать реакцию восстановления тетразолия нитросинего (ГНС) в присутствии НАД.Н и феназинмета- сульфата(ФМС).

Кровь брали натощак из локтевой вены в пробирку, содержащую 0,04 мл раствора гепарина (1 мл гепарина 40.000 ед. разводили 10 мл физиологического раствора). После отбора плазмы эритроциты тщательно отмывали, Для этого 2 мл осажденных эритроцитов осторожно смешивали с 10 мл физиологического раствора. Смесь центрифугировали 10 мин при 2000 оборотах в 1 мин, после чего удаляли надосадочную жидкость и 2 - 3 мм верхнего слоя надосадка. Эту процедуру повторяли 2 или более раз, до полного очищения надосадочной жидкости. Для определения активности СО.Цэ сначала осаждали гемоглобин. Для этого к 1 мл предварительно отмытых и гемолизирован- ных эритроцитов добавляли 0,4 мл смеси хлороформа с этанолом (3:5). После тщательного перемешивания на ледяной бане и центрифугирования в охлажденном роторе в течение 15 мин при 10 000 оборотах в 1 мин в бесцветном прозрачном надосадке определяли активность фермента. 0,05 мл супернатанта добавляли в инкубационную смесь, содержащую 0,1 мл ФМС, 0,2 мл ТНС, 2,6 мл буфера фосфатного (рН 7,8), В контрольных пробирках содержались те же компоненты смеси, за исключением препарата фермента. Запускали реакцию добавлением 0,1 мл НАД.Н. Оптическую плотность исследуемых проб измеряли при длине волны 540 нм, Для расчета активности СОДэ сначала вычисляли процент торможения реакции восстановленного ТНС (%) в опытной пробе на 1 мин:

Т% Ю0%.

Дк

Для пересчета полученного выражения в единицы активности СОД использовали формулу

е.а.СОД

JTJL 50

К,

где К - коэффициент разведения, равный 200 для эритроцитов.

За условную единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимое для снижения оптической плотности

в ходе восстановления ТНС в опытной пробе на 50%.

Определение МДА производили методом С.Г.Конюховой, А.Ю.Дубикайтис,

5 Л.В.Шабуневич. Роль активации перекис- ного окисления липидов в патогенезе зкспе- риментального перитонита (Бюлл. экспер.биол. и мед., 1989, № 5, с.557 - 559). Принцип спектрофотометрического опреде0 ления МДА в биологических средах основан на способности этого продукта перекисного окисления липидов при высокой температуре и кислом значении рН образовывать с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) окрашен5 ный триметиновый комплекс.

0,2 мл плазмы разводили 0,8 мл деиони- зированной воды, добавляли 1,0 мл 0,6% ТБК на ледяной уксусной кислоте, после чего помещали в кипящую баню на 30 мин до

0 появления окраски, Затем, после добавления 4н.КОН - 1,0 мл, и 2,0 мл изопропанола, центрифугировали, а затем спектрофото- метрировали верхнюю фазу при длине вол- ны 532 нм. Показатель экстинкции

5 переводили в нмоль/л умножением на рас- счетный коэффициент 160,2.

Затем определяли соотношение МДА/СОДэ и при значении более 0,225 диагностировали тяжелую форму вирусного

0 гепатита В.

Показатели коэффициента у больных различными формами тяжести ВГВ приведены в табл.1.

При ретроспективной оценке тяжести

5 заболевания при выписке больного из стационара течение заболевания было расценено как легкое у 23, среднетяжелое у 57, тяжелое у 30 больных.

При индивидуальном анализе группы

0 больных тяжелой формой заболевания было обнаружено, что у 24 из них на момент обследования, т.е. в 1 - 3 дни желтушного периода, состояние расценивалось как удовлетворительное или средней тяжести.

5 Явления интоксикации были не выражены, а показатели билирубина соответствовали легкой и среднетяжелой формам ВГВ. Однако по полученным показателям у этих больных можно было предположить развитие

0 тяжелой формы заболевания, В результате динамического наблюдения за больными было установлено, что к 8 - 14 дню пребывания в стационаре состояние ухудшилось, нарастали явления интоксикации, повыша5 лись показатели билирубина. У 6 больных ВГВ течение заболевания трактовалось как тяжелое от момента поступления.

Таким образом, у 24 больных ВГВ из 30

оказалось возможным предположить развитие тяжелой формы заболевания еще до развития полной клинической картины, что составило 80% от всех обследованных тяжелой формой ВГВ, что отражено в табл,2,

Пример. Больной Т., 22 лет, И.Б. № 25094, Поступил с жалобами на общую слабость, неприятные ощущения в эпигаст- ральной области. Болен около недели: появилась головная боль, лихорадка (37,0 - 37,3°С), общая слабость, боли в эпигаст- ральной области,потемнела моча. Желтуш- ность кожи и склер заметил накануне поступления в стационар. В момент поступления состояние расценено как относительно удовлетворительное. Желтушность кожи и склер умеренные. Пульс 60 уд./мин, АД 120/70 мм рт.ст. Легкие без инфильтра- тивных изменений; язык обложен белым налетом, влажен. Живот мягкий, безболезненный. Печень пальпировалась на 2 см ниже края реберной дуги, в основном за счет левой доли, плотно-эластической консистенции. Спленомегалия. Основные биохимические показатели: выявлен HBsAg, билирубин 78мкмоль/л, АлАТ25,8ммоль/ч-л, сулемовый титр 1,9 мл, тимоловая проба 6,8 ед., протромбиновый индекс 78%. Соотношение МДА/СОДэ составило 0,226. Такой показатель соотношения позволял предположить развитие у больного тяжелой формы вирусного гепатита В. На 17 день состояние больного несколько ухудшилось: наросла желтуха, усилитель боли в эпигастральной области, тяжести в правом подреберье, уменьшилась в размерах печень - выступала на 1 см из-под края реберной дуги. На 18 день состояние больного тяжелое - вялый, беспокоит головокружение, тошнота, ано- рексия, больной раздражителен, негативно относится к лечению Пульс 86 уд./мин, АД 100/60 мм рт.ст. Живот мягкий, болезненный в эпигастрии и в правом подреберье. Край печени выступает на 0,5 см из-под реберной дуги, плотный, болезненный. Спленомегалия. Основные лабораторные данные: билирубин 190 мкмоль/л, АлАТ 60 ммоль/ч-л, сулемовый титр 2,0 мл, тимоловая проба 2,2 ед., протромбиновый индекс 60%.

Проводилась стандартная терапия тяжелой формы вирусного гепатита. Состояние больного постепенно улучшалось. Больной был выписан из стационара на 73 день в удовлетворительном состоянии при нормализации биохимических показателей.

П р и м е р 2 Больной М., 18 лет, И.Б. № 11458. Поступил в больницу с жалобами на умеренную слабость, снижение аппетита. Болен окопо недели: ухудшился аппетит, появилась слабость, тошнота, ноющие боли в правом подреберье, потемнела моча. В

момент поступления в стационар состояние расценено как относительно удовлетворительное, Желтушность кожи и слизистых умеренная. Пульс 74 уд/мин, АД 120/80 мм

рт.ст. Язык влажен, слегка обложен белым налетом. Живот мягкий, чувствительный при пальпации 6 Правом подреберье. Печень пальпировалась на 1,5 см ниже края реберной дуги. Основные биохимические

0 показатели: HBsAg положительный, билирубин 98 мкмоль/л, АлАТ 40,5 ммоль/ч. л, , сулемовый титр 1,46 мл, тимоловая проба 5,6 ед., протромбиновый индекс 62%. Коэффициент соотношения МДА/СОДэ составил

5 0,175, такой показатель коэффициента предполагает легкое течение заболевания. На 7 день пребывания больного в стационаре состояние его значительно улучшилось, аппетит нормализовался, желтуха значи0 тельно уменьшилась, пальпация живота безболезненна, печень уменьшилась в размерах. Проводилась базисная терапия. Больной выписан из стационара на 18 день в удовлетворительном состоянии при нор5 мализации клинико-биохимических показателей, Диагноз при выписке: Острый вирусный гепатит В, HBsAg положительный, легкая форма.

П р и м е р 3. Больной Г., 30 лет, И.Б.

0 № 3505. Поступил с жалобами на общую слабость, недомогание, темную мочу, ахо- личный стул. Болен в течение последних двух недель. При госпитализации состояние расценено как относительно удовлетвори5 тельное, выявлена умеренная желтушность кожи и слизистых, гепатомегалия Основные биохимические показатели: HBsAg положительный, билирубин 117 мкмоль/л, АлАТ 48,4 ммоль/ч- л, тимоловая проба 67,9

0 ед , сулемовый титр 2,0 мл, коэффициент соотношения МДА/СОДэ составил 0,176. Такой показатель коэффициента предполагает развитие у больного среднетяжелой формы заболевания. Больной получал стан5 дартную терапию. Состояние больного постепенно улучшалось. Больной был выписан из стационара на 48 день болезни в удовлетворительном состоянии, при нормализации клинико-биохимических показателей. Диаг0 ноз при выписке: Острый вирусный гепатит В, HBsAg положительный, форма средней тяжести.

П р и м е р 4. Больной М , 42 лет, И.Б № 24127. Поступит в стационар с жалобами

5 на тошноту, плохой аппетит, общую слабость, головную боль. Болен в течение недели: появилось недомогание, слабость, разбитость, плохой аппетит, тошнота, повторная рвота, появилась желтушность кожи и слизистых. При госпитализации

состояние расценено как среднетяжелое. Желтуха средней интенсивности, язык обложен, влажен. Пульс 90уд./мин, АД 115/80 мм рт.ст. Живот мягкий, чувствительный в эпигастральной области. Печень на 3 см вы- ступает из-под края реберной дуги. Основные биохимические показатели при поступлении: билирубин 210 мкмоль/л, АлАТ 38,5 ммоль/ч-л, HBsAg положительный, сулемовый титр 1,5 мл, тимоловая про- ба 1,4 ед., протромбиновый индекс 72%, коэффициент соотношения МДА/СОДэ составил 0,392. Такая величина коэффициента предполагает развитие тяжелой формы вирусного гепатита В. На 15 день заболевания состояние больного внезапно ухудшилось - появилось головокружение, слабость, кошмарные сновидения, эйфория, головная боль, пропал аппетит, наросла желтуха, сократились размеры печени. Основные би- охимические показатели: билирубин 390,3 мкмоль/л, АлАТ 24,5 ммоль/ч - л, протромбиновый индекс 67%. Получал стандартную терапию тяжелой формы вирусного гепатита. Состояние больного по- степенно улучшалось. Больной был рыписан из стационара на 76 день болезни в удовлетТаблица 1 Показатели коэффициента соотношения МДА/СОДэ у больных ВГВ

Таблица 2

Коэффициент соотношения МДА/СОДэ и уровня билирубина у больных тяжелой формой

ВГВ

ворительном состоянии при нормализации клинико-биохимических показателей. Диагноз при выписке: острый вирусный гепатит В, HBsAg положительный, тяжелая форма.

Таким образом, способ позволяет осуществить диагностику тяжелой формы вирусного гепатита В на ранних стадиях заболевания, еще до развития полной клинической картины в 80% случаев,

Положительный эффект заявляемого изобретения:

повышается точность диагностики до 80%;

можно своевременно назначить адекватную, соответствующую форме тяжести терапию.

Формула изобретения

Способ ранней диагностики тяжелой формы вирусного гепатита В путем биохимического исследования крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, определяют уровень малонового диальдегида и активность супероксиддис- мутазы в эритроцитах и диагностируют тяжелую форму заболевания при значении отношения первого ко второму более 0,225.