Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к альфа-фетопротеину человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/06 C12P21/08 

оэ

00

Изобретение относится к гибри- домной технологии и медицине и может быть использовано для иммуноло- кализации первичного рака печени. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculusL., продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ), способные связываться с альфа-фено- протеином человека (АФП), Итамм получают путем гибридизации клеток селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной очищенным препаратом АФП9 с клетками мышиной миеломы Х-63, Ag 8.653. Гибридома депонирована под номером ВСКК (II) 347D и обозначена F2-84. Клетки гкбридомы культивируют в среде ДМЕМ или RF11I 1640, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 100 мкг/мл гентамицина при 37 С в присутствии 5% СОл. Пассирование 1 раз в 3-4 дня4 Продуктивность штамма 10-20 мкг/мл. в культуральной жидкости и 5 мг/мл в асцитной жидкости. МонАТ, продуцируемые штаммом, относятся к IgG классу и к § 1 подклассу и проявляют сродство к АФП от больных с первичным раком печени. $

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и медицине и может быть использовано для иммунолокали- зации первичного рака печени.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых .клеток животных Mus musculus L., продуцирующих моноклональные антитела, способных связываться с альфа-фотопротеином (АФП) человека.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/c иммунизируют очищенным препаратом АФП человека Антиген выделяют из смеси сывороток больных с гепатоцеллюлярным раком

и тератобластомой методом афинной хроматографии с использованием кроличьих антител к АФП, конъюгированных с CNBr-активированной сефарозой 4В„ Полученный препарат смешивают t:1 с полным адъювантом «Ьрейнда и каждой мыши вводят 15 мкг АФП в объеме 0,3 мл в шесть точек; подкожно на спине (4 точки по 0,05 мл) и внутримышечно- в задние ноги (2x0,05 мл). Через месяц мыши вводят 75 мкг АФП без адъюванта Фрейнда внутривенно (0,2 мл) и внутрибрюшинно (0,2 мл).. На четвертый день после второго введения антигена берут селезенку, и суспензию

§ -4

сгпленоцитов гибридизуют г мышиное миеломой X-63.Ag 8.653. Для этого смесь спленоцитов и MI селомы (6,5:1) в виде осадка инкубируют в 3 мл 50%-ного полиэтиленгликоля (М.в. 1500) в течение 2 мин. Обработанную смесь клеток высевают в две 96-луночные пластины без фидера из расчета 4x10° спленоцитов в лунку или 4,6x10 смеси клеток в лунку, Клетки культивируют в среде с добавлением 20% лошадиной сыворотки, 2 мМ гиютамича, 100 мкг/мл гентамицпна. Селекцию гибридных клеток проводят в культу- ральной среде в присутствии гипоксан- тина (13,6 мкг/мл), аминоптерина (0,19 мкг/мл) и тимидина (3,9 мкг/мл) Появление колонии гибридных клеток зарегистрировано на 7-й день после слияния. На 13-й день после слияния множественные колонии (3-5 на лунку) вырастают в 100% засеянных лунок, Скрининг проводят иммуноферментным методом с использованием конъгагата кроличьих антител к IgG мыши с перо- ксидазой хрена. В 99% лунок в супер- натантах обнаружена специфическая анти-АФП активность. Клонирование и субклонирование позитивных гибридом проводят методом лимитирующих разведений, осуществляя посев гибридом в количестве 3,1 и 0,5 клеток в лунку с заранее приготовленным фидером. В качестве (оидера используют клетки перитонеалыюго экссудата

мышей BALB/c (5x1Оэ клеток в лунку) Клонирование проводят па культуральной среде, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки. При реклонитровании отмечалось 100% позитивных клонов.

Полученный штамм гибридных клеток депонирован под тюнером BCKK(II) К 347D, обозначен К.-84.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства.

Гибридому культивируют в среде (рН 7,2) ДНЕМ или KPMI-1640, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ гнютамина, 100 мкг/мл гентамицина, при 37°С в присутствии 5% СО (в пластинах) или без СО (в плотно закрьп пи посуде). Для выра- щиванйя штамма мо кно использовать -стеклянную или пластиковую посуду Во флаконы емк чмыо 25 см3 з асевают в 7 мл ростовой среды 5x10 -10 кле

ток штамма F2-84. Пассирование проводят один раз в 3-4 дня чзй же дозой клеток (без подсчета клеток их рассеивают из одного флакона на три). Титр антител в культуралъ- ной среде при определении иммунофер- (ментным методом - 2x10 . Для культивирования in vivo мышам BALB/c, сенсибилизированным

пристаном (О,

мл

внутрибрюнинно)

5

0

5

0

5

0

5

0

5

за 7 дней до прививки гибридом, вводят внутрибрюшинно 5x10 -10 клеток штамма F2-84 в 2 мл среды RPMI с гентамицином. Асцитическую жидкость забирают у живых мышей по мере ее накопления,, повторяя забор асцита у одной и той же мыши не менее 3 раз, Асцитный штамм перевивают на свежих мышей (5x10 -10 клеток на мышь), проводя не более трех пассажей. В пулах асцитов, полученных от разных животных и в разных взятиях, титр антител при определении иммуноферментным методом - 10 .

Продуктивность штамма о В 1 мл кулъ- туральной ереiibi содержится не более 10-20 мкг антител, а в асцитической жидкости - не менее 5 мг/мл антител.

Контаминация, Контаминация бактериями и грибами в штамме не обнаружена .

Криоконсепвнрование. Клетки штамма ресуспендируют в среде для замораживания, состоящей из эмбсиональ- ной телячьей сыворотки, ДМЕМ или RPMI--1640 и диметилсульфоксида (5:4:). 5x10 клеток штамма смешивают с 1 мл такой среды на холоде в пластиковых пробирках, для чего последние держат на льду и сразу же помещают в хранилище с жидким азотом после программного замораживания материала о

Характеристика целевого продукта.

МонАТ, продуцируемые штаммом F2-84, относятся к IgG классу и к У 1 подклассу мышиных иммуноглобулинов. Константа связывания антител штамма F2-84 с АФП равна 1,4-хЮ9 л/моль - определение проведено жидкофазным конкурентным радиоиммунологическим методом.

Взаимодействие МонАТ с АФП может быть определено иммуноферментным и радиоиммунологическим методами, а также методом смешанной преципитации в геле. МонАТ F2-84 способно связываться с АФП, находящимся в раство- |

ре и иммобилизованным на твердой Лазе, а также и в том случае, когда само МонАТ F2-84 прикреплено к носителю, например пластику. По методу двойной иммунодиффузии в геле МонАТ F2-84 АФП не преципитирует. При аналзе с АФП различных видов млекопитающих МонАТ F2-84 реагирует только с АФП человека и по результатам имму ноферментного анализа обладает практически одинаковым сродством к АФП от больных с первичным раком печени с тератобластомами и к АФП эмбрионального происхождения. i

Пример 1, Использование МонАТ F2-84 в смеси с МонАТ С2-84 на твердой фазе дпя твердофазного конкурентного радиоиммунологического анализа.

Твердой подложкой служит поверхность полихлорвиниловых пластин. Для иммобилизации МонАТ в лунках инкубируют смесь асцитических жидкостей F2-84 и С2-84 в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) рН 7,4-7,5 (200 мкл), при комнатной температуре в течение 9-13 ч. Конечное разведени асцитических жидкостей F2-84 к С2-84 в лукках равно 1:5000. После удаления содержимого лунки промывают двукратно ЗФР, содержащим 1-2% лошадино сыворотки (ЗФР-ЛС). Блокировку свободных участков полихролвинила проводят с помощью третьей порции ЗФР- ЛС, которую оставляют в лунках на 1,5-3 ч при комнатной температуре. После 2-3-кратной промывки ЗФР-ЛС или водопроводной водой лунки с иммобилизованными МонАТ F2-84 + С2-84 используют в качестве твердой фазы.

В приготовленные лунки последовательно вносят 90 мкл ЗФР-ЛС и 90 мкл смеси (1s) разведений стандартного препарата АФП с меченным иодом,АФП (8000-10000 имп/мин в лунку). Для определения величины максимального связывания метки (Во) в лунку вносят по 135 мкл ЗФР-ЛС и 45 мгл метки. Содержимое лунок перемешивают. После инкубирования при комнатной температуре в течение 15-17 ч содержимое лунок отсасывается в сборник радиоактивных отходов, лунки промывают 3-5 раз водопроводной водой и высушивают на воздухе. Из пластины вырезаю лунки и в них с помощью У-счетчика определяют скорость сч ета (имп/мин). Определив для каждого разведенния

стандартного препарата АФП величину BX/BQ х100%, строят калибровочную кривую. При использовании смеси МонАТ

i i

F2-84, + С2-84 в качестве твердой Лазы определяемая концентрация АФП находится в диапазоне от 3 до 2000 нг/мл.

Пример 2. Использование МонАТ F2-84 для сравнительного эпитопного анализа любых других МонАТ к АФП.

В сравнительном эпитопном анализе МонАТ, проводимом любым иммунологическим методом, используется основное

5 свойство МонАТ - реагировать с уникальной для него детерминантой антигена. Если МойАТ различают разные детерминанты (эпитопы) на антигене, то в большинстве случаев, если эти

0 эпитопы не представляют стерических помех для одновременного связывания двух антител, при анализе парных смесей МонАТ иммунологические реакции регистрируют различную эпитопную спе5 цифичность по усилению реакции связывания с антигеном.

Анализ проводят следующим образом. Лунки 96-луночной пластины инкубируют в течение 1,5 ч при 37°С с раствором

0 АФП (100 мкл) в конц.. чтрации 0,3 мкг/мл на забуференном физиологическом растворе (ЗФР) рН 7,2. Свободные валентности пластика забивают 0,5% сывороточным альбумином человека на ЗФР

5 с 0,05%-ным Твином-20 (200 мкл). Затем лунки в дубликатах инкубируют в течение 1,5 ч при комнатной температуре со 100 мкл каждого МонАТ по отдельности или смеск двух МонАТ, приготов-

0 ленной 1:1. Для этого берут культу- ральны е жидкости в разведении 1:20, а смесь двух МонАТ готовят так, чтобы каждое МонАТ в смеси также было в разведении 1:20. В этом разведении

5 каждое МонАТ находится в избытке по отношению к АФП на пластинке. После отмывания несвязавшихся белков водопроводной водой и ЗФР в лунки вносят по 100 мкл конъюгата кроличьих антй0 тел к IgG мыши с пероксидазой хрена. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 1,5 ч. В отмытые лунки вносят по 100 мкл раствора 5-аминосалициловой кислоты

5 (0,8 мг/мл,-рН 6,0), и через 45 мин измеряют оптическую плотность раствора в -каждой лунке при 450 км на миниридере. Учитывают среднее значение для двух параллельных лунок и вычисляют индекс аддитивности (ИА) Величина ИА характеризует способность двух МонАТ одновременно связываться с антигеном, т.е. с различными его эпитопами.

Анализ показывает, что МонАТ F2-84 D10-84 и С2-84 в парных смесях дают ощутимый прирост в реакции связывания с , что свидетельствует об их одновременном взаимодействии с анти

геном. Следовательно, сравниваемые МонАТ связываются с разными эпитопа- .ми АФП.

Формула и. зобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Hus rnusculus L. BCKK(II) № 347D, продуцирующий мо- ноклональные антитела к альфа-фето- протеину человека.