Способ получения @ -кетоглутаровой кислоты Советский патент 1991 года по МПК C12P7/50 C07C51/41 

Изобретение ОТНОСИТСЯ к микробиологической про Ы11 ленности и касаеу- ся способов выделения of. -кетоглута- ровой кислоты, (oi. -КГК), которая может быть использована в медицине, в пищевой и химической промышленное- . ти.

. Цель изобретения - повышенлэ выхода и упрощение лрсцесса получения об -КГК.. .

Способ заключается в следующем. Фильтрат культуральной жидкости обрабатывают бентонитом и активирован- ным углем, фильтр 1от и полученный раствор припускают через катионит .. КУ-2-8 в И liopMe. Элюат концентрируют до содержа1И1п сухих веществ 20-24% вес/об,, затем добавляют 40л- ный раствор КОН в интервале рИ 3,1- 3,3, снова концентрируют до содержания сухих веществ 32-33% и охлаждают. Кристаллы отфильтровывают, промывают небольшим количеством воды и этанола и сушат. Получают техническую мо- i нокалиевую сольoi-КГК с содержанием ; основного вещества 78-81% и выходом 66-73% (в пересчете на lOOZ-Hoe вещество). Технический продукт растворяют в воде, добавляют разбавленную (1:1) серную кислоту в количестве, эквивалентном содержанию основного вещества Затем раствор упариJCD 00

314

вают до минимального объема, добав-. ляют ацетон, этилацетат и прокаленный сульфат магния. Выдерживают ч и фт-шьтруют, Полученный раствор охлаждают и к нему при перемеши вании добавляют холодный петролейный эфир, кристаллизуют ei КГК при 4- 6 С в течение 24-28.ч. Получают чистую oL -КГК с содержанием основного вещества 99-100% и выходом 82-89% (в пересчете на монокалиевую с.опъ, Общий выход oi -КГК составляет 55-65% (от :исходного),

. При титровании концентрированных водных растворов (3-4 М). синтетической oi-КГК растворами КОН..соответствующей молярной концентрации нами бьшо найдено( что расход КОН эквивалентен образованию монокалиевой. соли при рН 3,1-3,2, При величине

рН 2р1 отвечающей -КГ,.лишь 60% кислоты превращается в coJ|:| /i при рН 256 и 289-3,0 соответс ненно 80 и 90-95%, При концентрации oi -КГК 2М (« 300 г/л) монокалиевая соль бы ла выделена с выходом. 76j44%, Осаж- дается эта соль иэ водных, растворов без кристаллизационной, воды,.

. Методом ПМР-спектроскопии. установлено,, что монокалиевая.соль о,{, -КГК, в водных растворах не образует лактол и в значительно мень- . .шей. степени чем сама аЛ -.КГК noABepr жена.процессу гидратации. Степень гидратации ее при рН.3,2 соС;Тавляет 9%. (мольных) и при разбавлении . (0,5-2М) практически не меняется, что обеспечивает,высокий стабильный выход монокалиевой соли. При меиьшиХ значениях рН (2,1; 2,6 и 2,9-3,0) количество гийратной формы oi -КГК .составляет 235,15 и 11% (мольных) соответственно. Несмотря на то, что, при рН 2,9-3,0 ot -icrk содержит всего 1t% гидратной формы и на 90-95% превращается в монокалиевую ооль, последняя в этих условиях плохо, кристаллизуется (несколько суток), и выход ее снижается до 50%, так .как иаличне свободной кислоты препятет- .вует полному осаждению соли,

При значениях рН больших, чем 3,3, содержание гидратной формы , уменьшается и становится исчаэаняде- малым при рН .4, вблизи рК ot-КГК (,7 ед.рН), Выход монокалиевой соли в этом случае снижаетс за счет образования .более раствори- ной дикалиевой соли.

0

В

0

6

ei -КГК известна в свободном виде, но кристаллизуют ее.из органических растворителей, так как в водных растворах она подвержена таутомерным превращениям. Однако прямая экстракция si -КГК из подкисленной, культ.у- ральной жидкости органическими растворителями, например диэтиловым эфи ром, этилацета.том, циклогексаноном не позволяет получить чистую oi -КГК, поскольку в культуральной жидкости всегда присутствуют другие органические вещества, экстрагирующиеся вместе с об -КГК| К тому же степень экстракции зависит от концентрации -КГК и от посторонних примесей,

об-КГК из культуральной жидкости выделена в виде водорастворимой моно- калиевой соли, что позвол1шо избавиться от органических примесей, за исключением пировипоградной кислоты. (ПВК),. ПВК является побочным продуктом микробиологического синтеза 9i -КГК и образуется наряду с ней в соотношении 6:1 и менее. Но в условиях получения монокалиевой соли ei -КГК ПВК самоконденсируется в не идентифицированный продукт кислого характера с более.высокой молекулярной массой и соосаждается (1.2-14%) с ,монокалиевой солью.oi -КГК, Однако при добавлении, серной кислоты п эквивалентном количестве по отноше- .ншо к.монокалиевой соли об -КГК про- дукт самоконденсации ПВК не переходит в свободную кислоту и не экст-. рагируется ацетоном и этилацетоном вместе с об -КГК, Подкисление. серной, а не соляной кислотой,.приводит к образованию сульфата калия, который нерастворим в органических раство - рителях,... .

. Применение бентонита наряду с активированным.углем для обесцвечивания фильтрата культуральной жидкости привело к удалению большей части сульфат-иона,.содержащегося в культуральной жидкости до 8 -.г/л,

Способ .иллюстрируется следукщими примерами, . . .

Пример К К фильтрату культуральной жидкости (объем 200 мл), полученной выращиванием дрожжей Candida lipolytica 579 (ВКМ Y-2402) is УаггохЛ.а (Candida lipolytica) ВКМ Y-24023 в минеральной среде с жидким парафином и содержащей 40,00 г/л oL -КГК и 6,10 г/л ПБК, добавляют бентонит и активированный уголь по

0

40

45

50

2% объемных каждого компонента.Перемешивают, оставляют на 2-3 ч и фильтруют. . Фильтрат пропускают через катионит КУ-2-8 (Н форма), который промывают AHCTHjmnpoBaHHoft .водой

до рН 3)0, Кислый элюат упаривают при 60-70°С до содержания сухих веществ масД/об, Дрефрак- тометрический метод), затем при перемешивании приливают 40%-ный раствор КОН до рН 3,1 и снова упаривают до содержания сухих веществ 32-33%, охлаждают и кристаллизуют монокалиевую соль oi КГК, Кристаллы отфильт- ровьгоают, промывают на фильтре -1- 2 мл холодной воды, затем 10 мл этанола и высупгивают. Получают 9,22 г технической монокалиевой соли х1 -КГК с содержанием основного вещества 80,12% (энзиматический метод), содержание ПВК 2,30% (в пределах энзи- матического метода). Выход монокалиевой соли составляет 73,28% (в пересчете на 100%-ное вещество),

Техническую соль растворяют в 100 мл воды и к раствору добавляют 2,35 мл разбавленной (1:1 об,/об,) серной, кислоты (плотность 1,465г/.см содержание 835,7 г/л). Раствор упа- ривают при пониженном давлении до минимального объема- 1,5 мл (вязкий сироп с кристаллами солей). К сиропу добавляют 5-6 мл ацетона, перемешивают до однородной суспензии, припивают 18-20 мл этилацетата, вновь перемешивают и вносят 2 г прокаленного сульфата магния, сушат 1-2- ч, периодически взбалтывая. Отфильтровывают осадок, емкость гфо-.. мывают дважд1 1 по 5-6 мл этилацетата и фильтруют через тот же фильтр при. пониженном давлении. Полученный раствор охлаждают, и к нему при интен

сивном переме иивании добавляют 80- 90 мл холодного петролейного эфира с т.кип, 70-100°С, Кристаллизуют oi .-КГК в течение 24-48 ч при 4гб С периодически перемешивая, Кристаплы отфильтровызают, промывают на фильтре 8-10 мл петролейного эфира п сушат до постоянного веса сначала в вакууме 2-3 ч, затем в сушильном шкафу.при температуре не вьш1е 100 С, Получают 5,21 т of. -КГК .с содержанием основного вещества 100,82% (энзиматический метод) , Выход oL -КГК составляет 88,91% .(в пересчете на монокалиевую соль); Элементнь й анализ.

, 30 А609986

Найд.но , %: С ,14; Д1,19; Н 4,131 4,11, Вычислено для CjIigOj-, % С 41,10, Н 4,14, Т,пл, 109-110 с, - Общий выход чистой об-КГК составляет 65,12% (от исходного), Пример 2, Аналогично приме- , ру 1 осаждают монокалиевую соль об-КГК, но при рП 3,2 и получают

10 8,87 г технической мопокалиевой соли . oi -КГК с содержанием основного веще- ства 81,43% (энзиматический метод), содержание ПВК 2,80%. Выход монокалиевой соли составляет 71,66%. Из

15 технической соли получают 5,10 г

oi.-КГ К с содержанием основного вещества 99,85% и выходом 88,87%, Элементный анализ. Найдено,%: С 41,09, 41,15, Н.4,12, 4,10, Т.пл, 109-111 С.

20 Общий выход чистой с, -КГК составляет 63,62% (от исходного),

П р и м.е р 3, Аналогично npi-tne- ру 1 осаждают монокалиевую соль об-КГК, но при.рН 3,3 и получают

25 6,56 г технической монокалиевой соли . ui -КГК.с содержанием оановногб вещества. 78,.16% (знзикатический метод), .содержание ПВК 3,70%, Выход монока- лиесой соли составляет.66,37%. Из технической, соли получают 4,43 г об-КГК с содержанием основного веще-- ства 98,96% и выходом 82,61%,

Общий выход чистой (xS -КГК составляет 54,80% (от исходного).

Таким образом, согласно предлагаемому способу получают чистую 6-КГК (99-100%) с выходом 55-65% без дополнительной перекристаллизации. Для .получения чистой oi -КГК .технический .продугс т дважд -) перекристал- лизовывают.

35

40

Формула изобретения

Способ получения od -кетоглутаро- .вой кислоты, включающий очистку куль- туральной .Ж1-ЩКОСТИ путем обработки ее на катионите в форме и обесцвечивание, концентрт1рование раствора с последующим выделемкем и кристаллизацией целевого продукта, о т- л и чающийся тем, что, с целью повышения выхода препарата и упрощения процесса получения, обесцвечивание проводят перед обработ- . кой .культуральной жидкости на катионите, в качестве культурпльпой жидкости используют фильтра, полученный, при культиБировапии дро.кжей

Ya.rrowia (Candida), lipolytica BKM . .Y-2402D на минеральной среде с яидкими парафинами, а Bbweneime осу- ществляют путем добавления гвдроксИ да калия с установлением рН 3,1 3,3 и Получением монокалиевой соли ci -кб.тоглутаровой кислоты, ее вы делением и последующим переводом

в свободную кислоту путем добавления серной., кисло ты в эквивалентном коли- честве, концентрирование раствора, проведение.процесса экстракции смесью ацетона, и.этилацетата, отделение целевой фракции, ее обезвоживам-- ние, при этом кристаллизацию осущест- вляют петролейным эфиром.

Изобротс-;11ие относится к области биотехнологии и касается получения ci -кетоглутаропоГ кислоты ( of -КГК) и мож.т быть тспользопаио в микробиологической и химической промышленности и в медчп ине. Целью изобретения является повышение выхода препарата и упрощетгие процесса получения oi. -КГК . Изобретение позволяет повысить, выход чистой (99-100%) об -КГК до 55-65. Для этого фильтрат куль- туральной жидкости обрабатыиают активированным углем и бентонитом для удаления окрашипаюших примесей, .и сульфат - ионов, затем катионитом КУ-2-8 (И форма) для удаления неорганических катионом. Элюаты концентрируют, осаждают oi -КГК в виде монокалиевой соли в интервале рИ 3,1- 3,3 с последующим переводом ее п свободную кислоту добавлением серной кислоты в эквивалентном количестве, экстрагируют оС -КГК смесью ацетона с этилацетатом и кристаллизуют добавлением петролеГпюго эфира (т,кип. 70-100 С). ю