СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦЕФАЛОСПОРИНА С Советский патент 1970 года по МПК C07D501/12 A61K31/545 C07D501/28 C12P35/06 C12P35/06 C12R1/745 

i;

Известен способ выделения цефалоспорина С из ферментационных растворов, содержащих его вместе с цефалоспорином N, заключающийся в том, что очищенный ферментационный раствор пропускают через катионит, содержащий сильнокислые группы в Н -форме, доводя рН до 2,8-4, отделяют катионит от подкисленной среды и пропускают через анионит для полного отделения неорганических анионов, в частности хлоридов, используя для анионита соли слабых алифатических насыщенных одноосновных кислот.

При работе иа ионообменниках большая часть цефалоспорина С уничтожается.

Для уменьшения потерь цефалоспорина С предложен способ, при котором цефалосиорин С выделяют из разбавленного водного раствора, в особенности ферментационной жидкости, в форме производного, который является особенно способным к переработке в сильнодействуюшле против бактерий соединения, отводящиеся от 7-аминоцефалоспорановой кислоты, например от 7-фенилацетиламинцефалоспорановой или 7-тиеннлацетиламиноцефалоспорановой кислоты.

подвергают обработке тринитробензолсульфокислотой или смесью пикрилхлорида и сульфита металла, а затем известным способом выделяют полученный при этом N-тринитрофенилцефалоспорин С.

Способ может быть использован и для очистки сырого цефалоспорина С; растворяют сырой продукт в воде или другом растворителе и раствор обрабатывают как описано. Также этот способ можно применять и для очистки производных цефалоспорина С, имеющих свободную аминогруппу в боковой цепи, например сложных эфиров цефалоспорипа С. Если новый способ применяется для очистки содержащегося в ферментационных растворах цефалоспорина С, реакцию можно проводить в культуральном фильтрате или непосредственно в полученной при ферментации культуральной жидкости.

Реакцию с тринитробензолсульфокислотой проводят при комнатной температуре рН 7-10, предпочтительно от 8,5 до 9. Прибавляют тринитробензолсульфокислоту в твердой или растворенной форме при перемещивании

почтительно, подвергая пикрилхлорид реакции обмена с сульфитом , например сульфитом натрия, калия или аммоиня. Раствор может быть употреблен без дальнейшей переработки.

Трнннтробензолсульфокислогу можно получать непосредственно в растворе, содержанием дефалоснорин С, нрибавляя к раствору, например, никрилхлорид и сульфит натрия.

По окончании реакции pri доводят до I-3, предпочтнтельно 1,8-2 и отделяют тринитрофенилцефалоснорин С путем экстракции при помощи не смешиваемого с водой растворителя или смеси растворителей. Например при помош,и не смешиваемого с водой спирта, в особенности низшего алканола с 4-6 атомами углерода - н-бутилового, амилового спирта, например л-амилового, дг-гексилового спирту, 2-этил-н-бутилового. или бензилового, или сложного эфира, в особенности сложного низшего алкилэфира низших алкановых кислот-уксусной, пропионовой, масляной, например сложного бутилового эфира уксусной кислоты. А также при помошп не смешиваемого с водой кетона, в особенности динизшего алкилкетона, например диэтилкетона, метилизобутилкетона; или незамещенного или замещенного, в особенности хлорированного, углеводорода, нанример хлорированного алкана - метиленхлорнда, хлороформа, этиленхлорида; или смесей этих растворителей.

Далее органический экстракт обрабатывают водой при рН 5-6 и снова экстрагируют тем органическим растворителем ири рН 1,8-2 с последующим выделением целевого продукта известным снособом.

Пример 1. К 370 л культуральной жидкости, содерл ащей цефалоспорин С, ирпливают раствор из 2,72 кг щавелевой кислоты в 10 л воды и 0,9 л раствора одинаковых по объему частей воды и концентрированной серной кислоты, обеснечнвая рН 3. После прибавления 8 кг «целатома (диатомовой земли) массу фильтруют через фильтр-пресс. Прозрачный фильтрат (320 тг) содержит 1,57 г цефалосиорнна С на 1 л. Влажный остаток па фильтре (62 кг) отбрасывают.

Фильтрат приливают к раствору 920 г 2, 4, 6-тринитробензолсульфоновокислого натрия с рП 7,5, который получают, растворяя 796 г безводного сульфита натрия в 3,35 л деионизированной воды, прибавляя 1 кг льда и раствор 1,425 кг, пикрилхлорида за 15 мин в 4,35 л ацетона при перемешивании. рП смеси растворов доводят при перемешивании до 9,0 концентрированным раствором едкого натра. Реакционную массу выдерживают в течение 4 час при температуфе 26°С и рН 8,5-8,7. Прозрачный красный реакционный раствор, содержащий 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорнн С, экст.рагируют при рН 1,5-2,0, которое устанавливают 5н. серной кислотой посредством противоточного экстрактора метилизобутилкетонов. Получают 190 л экстракта метилизобутилкетона. Его экстрагируют при помощи противоточпого экстрактора 0,2М фосфатбуфером с рН 8. Получают 95 л водного экстр.акта с рП 6. Из него экстрагируют 2, 4, 6трищггрофенилцефалосиорин С еще раз мещлпзобутилкетоном при рП 2.

Полученные 50 л органического раствора экстрагируют при рН 6 трилады, употребляя но 4 л воды. Полученный так водный экстракт (12 .л) охлаждают от О до 4°С, доводят рН до 2,0 6н. соляной кислотой, отсасывают

остаток и промывают его ледяной водой. После сушки остается 751 г сырого 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорина С. Пз фильтрата получают еще 269 г продукта. Тонкослойная хроматограмма на силикагеле

в системе н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (75 : 7,5 : 21) показывает для 2, 4, 6-трипптрофенилцефалоспорина С относительно пикриновой кислоты, как сравнительного вещества, R. 0,51. Наряду с этим, обнаружить пятна снльнее или слабее полярных 2, 4, 6-тринитрофенилсоедииений.

Превращение ироизводного в 7-аминоцефалоснорановую кислоту (7-АСА) проводить следующим образом.

А. 200 г сырого 2, 4, 6-трипигрофенилцефалоспорина С суспендируют в 2 л метилизобутилкетона и приливают раствор 200 г дифенилдиазометана (полученного окислением бензофепонгидразоиа двуокисью марганца) в 600 лл

метилизобутилкетопа. После 1,5 час краснофиолетовый раствор вливают в 10 мл петролейпого эфира. При этом осаждается сырой слолчпый дибеизгидрнлэфир 2, 4, 6-тринитрофепилцефалоспорина С в виде светло-желтого порошка. Осадок отсасывают на нутч-фильi pe, промывают петролейным эфиром н сушат в вакууме при . Продукт показывает в тонкослойной хроматограмме на силикагеле в системе толуол - ацетон (8 :2) нри рП 0,53.

Выход 280 г диэфира чистотой в 44%, в соответствии с выходом 62% относительно имеющегося в культуральном фильтрате цефалоспорина С.

Б. 9,6 г полученного по пункту А сложного

дибензгидрнлэфира растворяют в 260 мл абсолютного метиленхлорида. После охлаладеиия раствора до -18°С приливают 5 мл безводного пиридина и после этого прикапывают при перемешивании в течение 10 мин раствор

7,8 г фосфорпентахлорида в 100 Л1Л абсолютного метиленхлорида. Перемешивают еще 45 мин при температуре от -12 до -10°С и после этого приливают в течение 5 мин 64 мл охлажденного до -10°С метанола. Раствор

перемешивают 40 мин при -10°С и затем 1 час при +10°С. После этого приливают при перемешивании 110 мл 2н. соляной кислоты. Разделяют фазы и экстрагируют водную фазу 100 мл метиленхлорида. Объединенные фазы

метпленхлорпда осторожно испаряют в вакууме. После сушки в глубоком вакууме получают смолистый коричневый остаток сырого сложного бензгидрплэфира 7-аминоцефалоспораповой кислоты (7-АСА). ряют в 5 мл анизола, приливают при охлаждеппп 14 мл трифгоруксуспой кислоты, оставляют реагировать У мин при 20-30 С и после этого ириливают охлажденную до -10°С смесь 25 мл триэтиламина и 180 мл метанола, рН lU7o-Hou водной суспензии составляет 2,3. Доводят рН до 3,5 триэтилампном (6 мл, охлаждают до -18С и реакционную смесь эставляют кристаллизоваться. Кристаллический осадок отделяют отсасыванием на нутче, промывают метанолом, метиленхлоридом и диэтилэфиром и сушат в глубоком вакууме. Получают 7-аминоцефал0спорановую кислоту с чистотой 83,3%. Выход 1,62 г (63,5%, считая па дибеизгидрилэфир 2, 4, 6-тринитрофенилцефалосиорина С). Пример 2. К, 10 ./г культурального фильтрата с содержаиием 1340 м& цефалосиорина С иа 1 тг и 190 мг азота, входящего в состав первичных аминогрупп на 1 л, полученного фильтрацией ферментационного раствора при ириОавлении 2% делатома как посредника фильтрации, вносят 60 г 2, 4, 6-тринитробензолсульфокислоты и после установления рН Ь,7 выдерживают 2 час при том же значении pil. После этого приливают к реакционному раствору 250 г «гифлосуиерцеля и доводят рИ при перемешивании с концентрированной соляной кислотой до 4,3. Желтый осадок отсасывают на нутч-фильтре вместе с «гифлосуперцеля. К прозрачному фильтрату приливают 3 л сложного уксусного эфира, рН значение доводят до 2 соляной кислотой, фазы разделяют и слегка эмульгированную фазу сложного уксусного эфира осветляют фильтрацией в ирнсутствии 50 г «гифлосуиерцеля. Ьодпую фазу экстрагируют еще трижды, употребляя по 1 л сложного уксусного эфира. К объединенным экстрактам сложного уксусного эфира приливают 1 л воды и значение рН доводят до 6,5 раствором едкого натра. Фазы разделяют. Фазу сложного уксусного эфпра экстрагируют еще трилады при рП 6,0, уиотребляя ио 0,5 л эфира. К объединенным водным экстрактам прнливают 1 л сложного уксусного эфира и рП доводят до 2,0 соляиой кислотой. Фазы разделяют и водную фазу экстрагируют еще , употребляя по 0,5 л сложного уксусного эфира. Объедииепные экстракты уксуспого эфира промывают дважды, употребляя ио 0,3 л насыщенного раствора хлористого натрия, сущат безводным сульфатом натрня и концентрируют до 0,5 л. К этому концентрированному раствору 2, 4, 6-трииитрофенилцефалосиорииа С ириливают при слабом охлаждении 0,2 л 47,5%-ного раствора дифеиплдиазометана в петролейном эфире. После выдержкп в теченпе 45 мин при комнатной температуре осаждают сложный дибензгидрилэфир 2, 4, 6трииитрофенилцефалосиорина С внесением в 3,5 л иетролейного эфира. Осадок отсасывают на нутч-фпльтре и сушат при 40°С в вакууме. ся в культуральном фильтрате цефалоспорина С). П р и мер 3. 11,76 г пикрилхлорида суспендируют в 36 мл к-бутанола и прибавляют раствор 6,6 г безводного сульфита натрия в 72 мл воды. После 30-минутиого неремешивания рН 6,5 красную реакционную смесь, содержащую 15 г натрневой соли 2, 4, 6-тринитробензолсульфоновой кислоты, ириливают к 6 л водного раствора обогащенного цефалоспорина С (вычислеииое содержание натрпевой соли цефалоспорина С 12,3 г; содержание азота, входящего в состав иервичных аминогрупп, 1,9%). Доводят рН до 9 раствором едкого натра и йотом держат его в течение 1 час при 8,5-8,7. После этого ириливают к реакционную раствору 1 л смесн н-буталацетата-н-бутанола (1:1) и доводят рН до 2,0 соляной кислотой. После 10 мин разделяют фазы. Водную фазу экстрагируют еще дважды, уиотребляя по 500 мл смеси w-буталацетата - н-бутанола. Объединяют органические экстракты, доводят рН до 5,5 раствором едкого натра и экстрагируют их 300, потом 200 и, наконец, 100 мл воды. Все водные растворы еще раз экстрагируют ири рН 2 указанной выще смесью н-бутилацетата - н-бутанола (100 мл, потом дважды 50 мл) и органические экстракты еще раз ири рН 5,5 водой (100 мл, потом дважды 50 мл). К 200 мл водного раствора прибавляют 10 г «гифлосуиерцеля, охлаждают до О-4°С и доводят рН до 1,8-2,0 2н. соляной кислотой. При этом осаждается 2, 4, 6-тринитрофенилцефалосиорин С. Его вместе с посредником фильтрации отсасывают иа нутч-фильтре, промывают ледяной деионизированной водой и сущат 15 час при 40С. Выход 18,07 г 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорина С на 10 г «гифлосуперцеля. В тонкослойной хроматограмме на силикагеле в той же самой системе, как в иримере 1, кроме R 0,51, видны еще иятна сильнее полярных и меньше полярных тринитросоединений. Продукт можно нереводить в сложный дибензгидрилэфир следующим образом. Полученный нродукт суспендируют в 180 мл н-бутилацетата п вводят 36 г дифенилдиазометаиа в 180 мл н-бутаиола. Суспензию перемешивают 3 час, «гифлосуперцель отсасывают и ирозрачпый фильтрат выливают в 1800 мл петролейного эфира (т. кип. 50-70°С) в течение 20 мин. Отсасывают на нутч-фильтре светло-желтый осадок сырого сложного дибензгидрилэфира 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорииа С, промывают иетролейным эфиром и сущат его при 40°С в вакууме. Выход 24,7 г (66%, т. е. 65,3%, считая на имеющийся в исходном растворе цефалосиорин С). Пример 4. Растворяют 17,3 г пикрилхлорида в 35 мл н-бучилацетата, вводят раствор 9,8 г безводного сульфита натрия в 60 мл воды и сильно перемешивают в течение 15 мин. Фаза бутилацетата ири этом становится бесриевой соли 2, 4, 6-трибензолсульфокнслоты,- интенсивно красной. Приливают красный раствор к 6 л сырого, содержащего цефалоснорин С водного раствора (вычислено 2 г, содержание нервичных аминогрупп 1,3%), доводят рН до 9 раствором едкого натра и перемешивают 2 час нри рН 8,5-8,7. Процесс ведут аналогично примеру 3. Получают 21,8 г сырого 2, 4, 6-тринитрофенилцефалосиорина С на 40 г «гифлосуперцеля.

Этернфицирование в сложный эфир посредством 43,6 г дифенилдиазометана аналогично примеру 3 получают 28,65 г сложного дибензгидрилэфира 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорина С (55%, т. е. 64,6% от теоретического).

Предмет и з о б р е т е и и я

Способ выделен я цефалоснорина С, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, разбавленный водный раствор, содержащий цефалоспорин С, например культуральную жидкость, подвергают обработке тринитробензолсульфокислотой или смесью иикрилхлорида и сульфита металла при рН 7-10,

полученный при этом N-тринитрофенилцефалоспорин С выделяют известным способом, например путем экстракции органическим растворителем, не смещиваемым с водой, таким как спирт, сложный эфир, или смесью этих

растворителей при рН 1-4.