Способ выделения ацетоина Советский патент 1980 года по МПК C12D13/00 

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу выделения ацетоина из культуральной жидкости микроорганизмов - продуцентов.

Ацетоин - СНзСОСНОНСНз (З-окси-2бутапон, ацетилметилкарбинол) наряду с продуктом его окисления диацетилом является важным ароматическим фактором ряда пищевых продуктов, влияющим на их качество. Он встречается в хлебе, масле, молоке, сырах, ниве, кофе, какао, меде, специях и т. д.

Ацетоин и диацетил вносят в маргарин и другие отвержденные растительные масла для придания им запаха сливочного масла.

Ацетоин также используется в пищевой и витаминной промышленности в качестве антиоксиданта - вещества, предохраняющего масла, жиры и растворимые витаминные препараты от окисления.

Ацетоин образуется в .культуральной жидкости некоторых микроорганизмов 1, 2. Однако в культуральной жидкости ацетоин обнаруживали аналитически и из среды не выделяли.

Получают ацетоин обычно путем химического синтеза.

Известен способ выделения ацетоина из раствора, предусматривающий экстракцню органическим растворителем с последующим упаривапием 3. При этом ацетоии выделяют из химической реакционной смеси. Все операции проводят в токе азота, что усложняет аппаратурное оформлеиие процесса и увеличивает потери ацетоина, обладающего высокой летучестью, за счет уноса газом. Полученный продукт представляет собой ацетоин, который быстро окисляется воздухом и не подлежит длительному хра10 нению.

Целью изобретения является увеличение срока хранения конечного продукта и упрощение процесса.

Указанная цель достигается тем, что в

15 качестве исходного раствора используют культуральную жидкость микроорганизмов- продуцентов, при этом перед экстракцией культуральную жидкость обрабатывают серной кислотой для удалеиня иримесей,

20 а после упаривания продукт кристаллизуют в присутствии гранулированного цинка. В качестве продуцентов ацетоина используют бактерии Aerobacter (Enterobacter) cloacae ИНМИ-30, или Erwinia corotovora ВКМ

25 В-567, или Aerobacter (Enterobacter) aerogenes ВКМ В-887, выращенные па углеводных средах.

Способ осуществляют следующим образом. Бактерии указанных видов культивируют

30 на минеральной питательной среде с глюкоЗОЙ или мелассой в качестве источники углерода. При этом в культуральной жидкости накапливается 17-19 г/л внеклеточного ацетоина. Культуральную жидкость, освобожденную от клеток, обрабатывают концентрированной серной кислотой. При этом осаждаются побочные продукты, препятствующие выделению ацетоина. Необходимо использовать именно серную кислоту, так как только ею переводятся в осадок основные мешающие цримеси, другими кислотами примеси не есаждаются. Осадок отделяют и ацетоин экстрагируют эфиром. Кислый экстракт сущат црокаленным потащом. Потащ, имея щелочную реакцию, одновременно осущает и подщелачивает экстракт. Подщелачивание экстракта необходимо, потому что щелочная среда предотвращает окисление ацетоина в диацетил при дальнейшем нагревании. Упаривание эфира проводят при атмосферном давлении и температуре бани не выше 45-50°С. Эфир удаляют полностью. Остаток после упаривания экстракта еще содержит примеси, избавиться от которых с помощью разгонки невозможно из-за летучести ацетоина. С целью выделения ацетоина из остатка используют его свойство образовывать кристаллический димер, который получают в присутствии гранулированного цинка. Идентификацию нолученного ацетоина проводят методами газожидкостной хроматографии, ИК-, ЯМР-спектроскопии, определением точки плавления и элементного состава. Пример 1. Штамм Aerobacter (Enterobacter) cloacae ИНМИ-30 выращивают в пробирках на мясо-цецтонном агаре (МПА) при 26°С. Через 48 ч роста культуру с МПА пересевают в колбы емкостью 250 мл, содержащие 50 мл питательной среды. Пересев проводят 1 мл суспензии бактерий, полученной смывом 48-ч культуры с МПА стерильной водопроводной водой из расчета 1 пробирка на 16 колб, содержащих по 50 мл среды. Состав жидкой питательной среды, вес. %: Глюкоза10,0 NH4C10,6 КП2РО40,1 MgSO40,03 СаСОз3,4 Дистиллированная водаОстальное рН среды до и после стерилизации 6,9. Стерилизацию солевой среды без глюкозы и СаСОз проводят в автоклаве при М6°С (3/4 атм). Глюкозу в виде 50%-ного раствора в дистиллированной воде стерилизуют в автоклаве при (1/2 атм), СаСОз расфасованный по 1,7 г в сухих пробирках, стерилизуют сухим жаром при 170°С. Раствор мелассы и СаСОз вносят в колбы с основной болевой средой перед засевом её бактериями. Ферментацию проводят при непрерывном перемещивании на качалке, 220 об/мин, 26°С в течение 5 суток, после чего центрифугированием биомассу отделяют от жидкой среды. 200 мл культуральной жидкости с содержанием ацетоина 17 г/л обрабатывают 5 мл концентрированной серной кислоты и помещают в холодильник для формирования осадка. Образовавшийся аморфный осадок отфильтровывают на стеклянном фильтре N° 4 и промывают эфиром. Фильтрат вместе с промывным эфиром переносят в делительную воронку и энергично встряхивают в течение 5 мин. Экстракцию производят многократно диэтиловым эфиром. Образующуюся эмульсию разрушают фильтрованием через стеклянный фильтр № 4. Объединенный, эфирный экстракт нейтрализуют и сушат прокаленным поташом. Поташ отфильтровывают и промывают на фильтре абсолютным эфиром. Фильтрат и промывной эфир объединяют, упаривают при 50°С до прекращения выделения паров эфира. В остаток вносят 3 гранулы цинка. Смесь помещают в морозильную камеру холодильника на сутки. Образовавшиеся бесцветные кристаллы димера ацетоина отжимают на фильтре, перекристаллизовывают из ацетона и сушат в вакуумном эксикаторе над PoOs и парафином. Выход ацетоина 1,88 г (55,3%). Пример 2. Штамм Erwini corotovora BKM В-567 выращивают в пробирках на картофельном агаре при 26°С. Через 48 ч роста культуру с картофельного агара пересевают в колбы емкостью 250 мл, содержащие 50 мл питательной среды с мелассой в качестве источника углерода. Состав жидкой питательной среды вес. %: Меласса20,0 NH4C10,5 КН2Р040,1 MgSO40,03 СаСОз3,4 Дистиллированная вода Остальное Пересев проводят 1 мл суспензии бактерий, полученной смывом 48-ч культуры с картофельного агара, стерильной водопроводной водой из расчета 1 пробирка на 10 колб, содержащих 50 мл среды. Далее аналогично онисанному в примере 1 получают Культуральную жидкость с содержанием ацетоина 13 г/л 200 мл. Культуральную жидкость обрабатывают аналогично описанному в примере 1. Выход ацетоииа 1,38 г (53,1%). Пример 3. Фермента11ию щтамма Aerobacter (Enterobacter) aerogenes ВКМ-В-887 проводят аналогично описанному в примере 1, а экстракцию культуральной жидкости с содержанием ацетоина 18,5 г/л проводят непрерывно. Остаток посЛе упаривания с внесенным Ё него цинком перемешивают магнитной мешалкой при охлаждении (баня с ацетоном и сухим льдом) в течение 2 ч. Затем смесь помеш,ают в холодильник. Выход ацетоина 1,68 г (45,3%). Описанный способ позволяет осушествить выделение ацетоина из культуральной жидкости, полученной ферментацией микроорганизмов - продуцентов ацетоина. Препарат, полученный микробиологическим синтезом, выделяют химически чистым, в виде кристаллического димера. Он более устойчив к хранению, чем жидкая форма ацетоина и может быть использован в пишевой и витаминной промышленности. Возможность проведения всех операций выделения без тока азота упрошает и удешевляет процесс, одновременно исключая потери ацетоина за счет уноса.

Формула изобретения

1. Способ выделения ацетоина из раствора, предусматриваюший экстракцию его органическим растворителем с последуюш,им упариванием, отличаюш,ийся тем, что, с целью увеличения срока хранения конечного продукта и упрош,ения процесса, в качестве исходного раствора используют культуральную жидкость микроорганизмовпродуцейтов, при этом перед экстракцией культуральную жидкость обрабатывают серной кислотой для удаления примесей, а после упаривания продукт кристаллизуют в присутствии гранулированного цинка.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют бактерии.

Aerobacter (Enterobacter) cloacae ИНМИ-30.

3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют бактерии Erwinia corotovora ВКМ В-567.

4.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют бактерии Aerobacter (Enterobacter) aerogenes ВКМ В-887.

5.Способ по пп. 1, 2, 3, 4, отличающийся тем, что микроорганизмы-продуценты выращивают на углеводных средах.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.,Патент Японии № 48-14952, кл. 36/2/D 23, опублик. 1973.

2.Авторское свидетельство СССР № 200414, кл. А 23С 15/02, 1967.

3.Меррей А., Уильяме Д. Л. Синтезы органических соединений с изотопами углерода, ч. 2, М., ИЛ., 1962, с. 47.