СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПЕРВИЧНЫХ И ВТОРИЧНЫХ МЫШЕЧНЫХ ДИСТРОФИЙ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии.

В медицине в настоящее время известно несколько способов определения активности ферментов в крови как теста для выявления пораженных клеток мышечной ткани человека.

Одним из таких способов является определение кераинфосфокиназы (КФК) сыворотки крови.

Метод основан на измерении оптической плотности реакционной смеси при 340 нм, являющейся мерой накопления восстановленной формы НАДФ. Последняя образуется в стехиометрическом соотношении с количеством креатина и АТФ, образующихся в обратной креатинкинакиназной реакции (креатинфосфат + АДФ). Введение в реакционную смесь сопрягающих ферментов гексакиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогенаэы и некоторых их субстратов достигается образование одной молекулы НАДФН из молекулы АТФ. Регистрацию оптической плотности производили на анализаторе скоростей реакций LKB 8600 (Швеция), ферментативную реакцию производили при 37^oC. Аликвоту анализируемого образца (не более 0.1 мл) смешивали в измерительной кювете 1 мл рабочего раствора, в состав которого входили все компоненты реакционной смеси, за исключением креатинфосфата при автоматическом режиме работы прибора каждая кювета находилась в течение 30 минут в термостатированном (37^oC) туннеле анализатора, после чего попадала в измерительное положение, в котором в нее добавлялось 0.1 мл раствора креатифосфата время регистрации оптической плотности составляло 2-3 минуты продолжительность начального нелинейного участка кинетической кривой ("лаг-период") зависело от уровня определяемой активности креатинфофокиназы и активности сопрягающих ферментов в реакционной смеси и не превышало обычно 30 секунд, после чего ход изменения оптической плотности соответствовал кинетике нулевого порядка. Конечные концентрации компонентов реакционной смеси: креатинфосфат 35 мМ, АДФ 1 мМ, АМФ 10 мМ, ацетат Mg 20 мМ, гюкоза 20 мМ, НАДФ 0,82 мМ, дитиотрентол 6,5 мМ, 0,1 Мтрис-НЦИ-буфер, pH 7,0.

Количество смеси сопрягающих ферментов гексоиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогенаэы, вводимое в реакционную среду, подбирали для каждой новой смеси. С этой целью к рабочему раствору без сопрягающих ферментов, содержащему КФК в концентрации 20 Ед/л добавляли увеличивающиеся количества смеси гексокиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и определяли минимальное количество этой смеси, увеличение которого не приводило более к росту измеряемой активности КФК. В реакционную смесь для измерения общей активности КФК вводили такое количество сопрягающих ферментов, которое было вдвое больше минимального. Реакционную смесь без сопрягающих ферментов и дитиотрейола хранили не более 2-х месяцев при температуре не более -40^oC, реакционную смесь со всеми компонентами хранили не более 3-х суток при 5^oC [В.Н.Малахов. В.Н.Тищенко, Н. И.Эфрон, Е.А.Чухрий и В.А.Исаченков. Изучение свойств изоферментов креатинфосфокиназы человека. - Биохимия, 1977 г. , М.: Наука,- т. 7, с. 1221-1231].

Другим способом определения мышечной дистрофии является метод Эннора и Розенберга. В основу определения КФК положен метод Розенберга и Эннора [Ennor A. , Rosenberg Н. Btochem J. 1954, v. 57, р. 203], согласно которому об активности фермента судят по нарастанию количества креатина. Креатин определяют при помощи цветной реакции с а-нафталом и диацетиленом. К смеси 0,1 м трис-буфер, pH 7,2 (0,25 мл), бидистилированная вода (0,25 мл), 0,006 М раствор фосфокреатина (0,1 мл) добавляют 0,1 мл сыворотки крови; в контрольную пробу вместо сыворотки добавляют воду. Пробы ставят на водяную баню при температуре 37^oC на 3 минуты, затем добавляют по 0,06%-ного раствора АДФ и инкубируют 30 минут. Для осаждения белков добавляют 0,2 мл 5%-ного водного раствора гидрата окиси бария, 0,2 мл 5% сернокислого цинка. Через 20 минут пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. К 1 мл надосадочной жидкости прибавляют 1 мл свежеприготовленного 1%-ного раствора а-нафтола (100 мг а-нафтола растворяют в 10 мл щелочного раствора, содержащего 10% Na₂CO₃ и NaOH) и 0,5 мл свежеприготовленного 0,4%-ного водного раствора диацетила. При этом необходимо строго соблюдать последовательность добавления реактивов. Пробирки помещают на 20 минут в темноту для развития окраски, после чего калориметрируют на ФЭК-М с зеленым фильтром. Для определения активности КФК была построена калибровочная кривая со стандартным раствором креатина (от 1,31 до 13,1 мкг). За единицу активности фермента принимали активность 0,1 мл сыворотки крови, которое образует 1 мкг креатина при данном условии опыта. [Л.П. Гринио, А.В.Консисторум. Исследование КФК в сыворотке крови у больных с прогрессивной мышечной дистрофией. - Вопросы медицинской химии. 1964 г., т. 10, вып. 1, с. 70-73].

Также о процессе дистрофии можно узнать, пользуясь определением лактат дегидрогеназы и ее изоферментов - наиболее исследованной к настоящему времени изоферментной системы. Лактатдегидрогеназа (L-лактат: НАД + оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.27) - ЛДГ. Известно 5 изоферментов ЛДГ 1-5.

Фирма "Lachema" (ЧССР) поставляет в нашу страну удобный набор реактивов "LD" для определения общей активности ЛДГ и ее фракций по редоксииндикаторному методу [Amador Е., Reinstein Н., Bennoti N. - Amer. J. Clin. Рath. 1965, v. 44, p. 62], основанному на восстановлении йоднитротетразолил фиолетового в красный формазан за счет окисления НАДН₂, который восстанавливается в ходе превращения лактата в пируват. В качестве промежуточного акцептора водорода используется N-метилфеназоний метасульфат (ФМС). Скорость ферментативной реакции прямопропорциональна интенсивной окраски накапливающегося красного формазана. Процентную долю активности мочевиностабильных фракций находят после осуществления конкурентного ингибирования изоферментов ЛДГ_4-5 мочевиной в конечной концентрации 2 моль/л. В качестве активности субстрата при определении общей активности ЛДГ используют раствор молочнокислого лития 0,2 моль/л (субстрат 1 набора). При использовании же субстрата 2 (молочнокислый литий мочевины) определяют активность мочевиностабильных фракций фермента. Учитывая отсутствие стабильности развивающейся окраски, фотометрию следует производить, по возможности, точно соблюдая для каждой пробы время, проходящее от момента внесения в пробирку 0,1 мHCl до начала фотометрии. Размах варьирования нормальных величин каталитической активности общей ЛДГ в сыворотке крови по нашим данным 50-100 Ме/л. что соответствует 0,8-1,7 ммоль/сл/мккат/л. [З.Д.Капитонова. Н.Ю.Корягина, Р.А.Зарембский. Некоторые рекомендации по использованию химических реактивов фирм "Lachema" (ЧССР) и "FERMOGNOST" (ГДР) для определения общей активности лактатдегидрогеназы и ее мочевиностабильных фракций. Лабораторное дело, М.:Медицина, 1985, N 4, с. 248-250.]
Недостатком первого метода является трудоемкость производимых операций, большое количество реагентов, необходимость поддерживать постоянную температуру (37^oC), термостатирование. Хранение реакционной смеси без сопрягающих ферментов и дитиотрейтола - не более 2-х месяцев при температуре -40^oC, реакционную смесь со всеми компонентами хранили не более 3-х суток при температуре 5^oC.

Для выполнения необходима длительная затрата времени.

Недостатком второго метода является достаточная трудоемкость операций, большое количество реагентов, необходимость соблюдать последовательность добавления реактивов в пробирку, необходимость затемнения, необходимость поддержания определенного температурного режима, длительная затрата времени.

К недостаткам третьего метода относятся длительность процедур, постоянный температурный режим, необходимость в четком выполнении операций, большая ошибка в показаниях при нечетком исполнении, необходимость вести фотометрию, точно соблюдая определенные интервалы внесения реактивов.

Наиболее близким к предлагаемому нами методу является редоксиндикаторный метод, так как он является наиболее часто употребляемым в неврологической практике в течение длительного времени. Он является наименее трудоемким по сравнению с первым и вторым методами. Существует удобный набор реактивов "LD" для определения общей активности ЛДГ и ее фракций.

Нами предлагается следующий способ определения степени поражения поперечно полосатых мышц у больных с первичными и вторичными прогрессирующими мышечными дистрофиями (ПМД): при помощи определения миоглобина сыворотки крови. Для определения концентрации миоглобина в сыворотке крови человека с помощью реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) существует набор "СКРИНМИО", выпускаемый Горьковским НИИЭМ [А.П.Голиков, О.А. Авилов, А.А. Берестов. Экспресс-методы определения миоглобина в ранней диагностике инфаркта миокарда: Методические рекомендации. - М., 1986].

Способ применения: для проведения реакции удобно использовать микротитратор "Такачи" или автоматические пипетки соответствующего объема. Реакции производятся в лунках 96-луночных микропланшетов, желательно с U-образным дном. Содержимое ампул с эритроцитарным реагентом и несенсибилизированными куриными эритроцитами растворяют в 2.5 мл, а стандарт - в 1 мл забуференного физиологического раствора pH 7,2 (ЗФР). Ампулы тщательно встряхивают для получения гомогенной взвеси. По ходу работы следует периодически перемешивать реагент.

Количественное определение миоглобина в сыворотке.

Исследуемую сыворотку разводят в 5 раз ЗФР (к 0,4 мл ЗФР прибавляют 0,1 мл сыворотки), после чего делают ряд последовательных двухкратных разведений в 0,025 мл ЗФР в лунках планшета по общепринятой методике. Для этого во все лунки вносят по 0,025 мл ЗФР. Затем в первые лунки рядов вносят по 0,025 мл исследуемой сыворотки и стандарта (таким образом в первых лунках исследуемая и стандартные сыворотки разведены в 10 раз). Содержимое первых лунок перемешивают и переносят с помощью автоматической пипетки или дозатора микрогитратора "Такачи" во вторые лунки 0,025 мл смеси, затем из второй в третью и так далее из последней лунки выливают 0,025 мл смеси. Для выявления возможной стандартной агглютинации в две лунки планшета вносят по 0,025 мл ЗФР, после чего во все лунки добавляют по 0,025 мл эритроцитарного реагента. Содержимое лунок тщательно перемешивают путем осторожного встряхивания и оставляют при комнатной температуре на 40-60 минут. При титровании исследуемой сыворотки концентрация миоглобина в последней лунке с ярко выраженной агглютинацией эритроцитов соответствует реальной чувствительности реагента, определяемой по вышеописанной методике. После этого определяется концентрация миоглобина в цельной сыворотке с учетом всех предшествующих двухкратных разведений в лунках планшета и исходного разведения сыворотки.

Например. В исследуемой сыворотке последняя лунка с гемагглютинацией соответствует разведению 1:64, что соответствует 1 нг/мл миоглобина, поэтому содержание миоглобина в исходной сыворотке равно 1•64•10 нг/мл, где 1 - чувствительность реагента (нг/мл), 64 - разведение в лунках (обратный титр), 10 - разведение исходной сыворотки.

Оценка результатов реакции
Реакцию считают положительной, если в лунках с исследуемой сывороткой так же, как и в лунке со стандартом (содержащей миоглобин), наблюдается полная гемагглютинация, т. е. эритроциты равномерно распределяются по дну лунки. Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации эритроцитов, эритроциты оседают на дно, образуя в центре "пуговку" или с ровным краем. При наличии в исследуемой сыворотке гемагглютинации во всех лунках ряда необходимо увеличить исходное разведение до 1:100 или выше.

Комплект рассчитан на 80 анализов сывороток больных или 800 скрининг-тестов и состоит из: 8 ампул, содержащих сенсибилизированные аффинноочищенными F(ab) 2 фрагментами антител к миоглобину куриные эритроциты. 2 ампулы со стандартом, содержащим 80 нг/мл миоглобина. Срок годности 1 год с момента изготовления. Хранить при температуре 4-10^oC. Разведенный эритроцитарный реагент без бактериостатика хранить при температуре 4-10^oC не более 3-х дней, стандарт - 1 месяц. Сыворотка больных хранится в морозильной камере длительное время. (Разработка и авторское сопровождение иммунохимической лаборатории ННИИЭМ г. Нижний Новгород, ул. Грузинская, 44 НПК "Препарат"), а также: "Определение миоглобина в биологических жидкостях. Клиническое значение". Сборник научных трудов.- Обнинск: НИИМР АМН СССР, 1990.

Пример
Нами было обследовано 24 больных с первичными мышечными дистрофиями. К ПМД данной категории относились больные с формами Дюшена, Ландузи-Дежерина и Эрба-Рота и 24 человека с вторичными мышечными дистрофиями: невральной амиотрофией Шарко-Мари, спинальными амиотрофиями Кугельбергера-Веландера, Верднига-Гофмана.

По группе первичных мышечных дистрофий M_ср1 = 168±4,4. По группе вторичных мышечных дистрофий М_ср2 = 106±2,6, при n = 24 в обоих случаях. Коэффициент Стьюдента в данном случае между этими группами составил - 12 (p < 0,001).

Таким образом, взяв у больного кровь из вены в течение 40 минут, можно получить результат, и имея средние показатели миоглобина по первичным и вторичным ПМД, соотнести полученные данные с диагнозом, т.к. очень часто в неврологической практике трудно на первых этапах клинического обследования определить к какой группе ПМД относится данная патология.

Также у группы больных с ПМД Дюшена (35 человек) и с ПМД Шарко-Мари (35 человек) была взята кровь из вены для обследования методом, основанном на измерении оптической плотности (1 способ). В данном случае определялась КФК сыворотки крови. Эти же больные были обследованы на содержание миоглобина в сыворотке крови. Корреляция между данными была рассчитана по формуле:

где n - число парных корреляционных рядов,
d - разность между порядковыми номерами,
p - первичных ПМД с формой Дюшена составила - +0,80
p - вторичных ПМД с формой Шарко-Мари составила - +0,87.

Достоверность Коэффициента корреляции проверяли, вычисляя его ошибку по формуле:

где p - коэффициент корреляции,
n - число пар корреляции.

По группе ПМД первичных mp составила ± 0.14.

По группе ПМД вторичных mp составила ± 0,2.

Таким образом, применяя данный метод, мы получаем достоверный результат, который характеризует состояние мышечной системы у больных с ПМД первичной и вторичной форм.

Если цифры результата анализа больного находятся в пределах 100 нг/мл, то можно думать о вторичной ПМД, где первично поражается не мышечная, а нервная система; мышечная система страдает вторично. Если результат превышает 160 нг/мл больного стоит относить к группе первичных мышечных дистрофии.

Наш метод также как и первый метод (определение КФК путем измерения оптической плотности) характеризует состояние мышечной системы, но наш метод гораздо проще в исполнении: нет очень больших затрат времени - до 40 минут, не нужно иметь дорогостоящее оборудование (достаточно набора "СКРИНМИО" и физраствор для разведения реагентов, не нужно поддерживать постоянную температуру для проведения опыта как в первом, втором и третьем способах. Анализ может быть проведен у постели больного. Получаемые результаты выражаются в целых числах, их удобно использовать в расчетах. Сыворотки хранятся в морозильной камере и нет необходимости использовать их по мере поступления. Можно накопить достаточное количество и произвести анализ одновременно всех образцов. Также пользуясь набором "СКРИНМИО" возможна постановка скрин-теста (при массовом обследовании - 800 человек), в случае положительной реакции гемагглютинации следует проводить количественное определение содержания миоглобина. Таким образом, учитывая приведенное выше, можно широко пользоваться новой методикой путем определения миоглобина в сыворотке крови при помощи РПГА при определении первичных и вторичных мышечных дистрофий в неврологической практике.

Список сокращений:
АДФ - аденозин-5 дифосфат
АТФ - аденозин-5 трифосфат
КК - креатинкиназа
КФК - креатинфосфокиназ
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
НАД - никотинамидадениндинуклеотид
НАДФ - никотиамидадениндинуклеотидфосфат окисленный
НАДФН₂ - никотиамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
ПМД - прогрессирующие мышечные дистрофиик

Способ может быть использован в медицине для диагностики первичных и вторичных ПМД (прогрессирующих мышечных дистрофий). Определяют миоглобин сыворотки крови при помощи реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). При концентрации миоглобина 168±4,4 нг/мл диагностируют первичную мышечную дистрофию, а при концентрации 106±2,6 нг/мл - вторичную мышечную дистрофию. Способ является более быстрым, дешевым, не требующим большого количества реагентов и постоянных температурных режимов. Таким образом, использование данного метода позволит внедрить более простой и качественный способ определения состояния нервно-мышечной системы при первичных и вторичных МД в неврологической практике.

Способ диагностики первичных и вторичных мышечных дистрофий путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что с помощью набора "СКРИНМИО" посредством реакции пассивной геммагглютинации определяют миоглобин и при его концентрации 168±4,4 нг/мл диагностируют первичную мышечную дистрофию, а при концентрации 106,0±2,6 нг/мл - вторичную мышечную дистрофию.