Способ определения фосфора в биологических объектах Советский патент 1993 года по МПК G01N21/78 

Изобретение относится к лабораторным методам анализа и предназначено для

лэЈ

ораторных и клинических исследований

в области сельского хозяйства, медицины, ветеринарии,зоотехнии,

. Наибольшее распространение колориметрическими способами определения фосфора являются: способ с использованием эйкрногена хлористого олова, малахитового зеленого, гидрохинона (амидола) или вана- до-йолибдатный способ.

Определение фосфора с эйконогеном им0ет чувствительность 0,2 - 2,0 мкмоль фосфора, однако способ трудоемкий (пред- вар тельное осаждение белка, центрифугирование, термостатирование) и длительный.

Способ с применением хлористого олова требует для анализа 0,1 мл сыворотки крови, достаточно трудоемкий и длительный (1 ч на пробу).

Способы определения фосфора в кормах еще более длительные и трудоемкие, затраты времени на их выполнение составляют - 24 часа.

Для определения фосфора в сыворотке крови заслуживают особого внимания микрометоды, позволяющие определять исследуемый элемент в объемах 0,02 - 0,05 мл сыворотки. Наиболее доступным и легковыполнимым является способе использованием молибдата аммония и малахитового зеленого, позволяющий без предварительы ел

XI

кого осаждения белков определять фосфор в 0,02 мл сыворотки крови. Этот способ является наиболее близким по технической сущности и принят за прототип. Сущность способа заключается в том, что в присутствии неорганического фосфора молибденовая кислота образует фосфорномолибденовую гете- рополикислоту, которая, реагируя с основным красителем малахитовым зеленым, дает зеленовато-синее окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству фосфора. Белок не мешает проведению данной реакции, поэтому депротеинизациго не проводят, для обеспечения коллоидной устойчивости образовавшегося комплекса в раствор добавляют твин-20.

Недостатки способа, принятого за прототип, следующие: неустойчивость окраски холостой и опытной пробы во времени, вследствие чего снижается точность определения; необходимость приготовления нового цветного реактива каждые 2-3 недели, что достаточно трудоемко.

Целью предлагаемого изобретения является сокращение длительности способа, повышение точности и чувствительности его.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения фосфора в биологических объектах путем обработки анализируемой пробы цветореагентом, содержащим соль молибденовой кислоты, малахитовый зеленый и минеральную кислоту с последующим фотометрированием раствора, согласно изобретению, в качестве соли молибденовой кислоты используют молибденовокислый натрий, а в качестве минеральной кислоты - серную кислоту при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Малахитовый

зеленый0,10-0,15 Молибденовокислый натрий 2,8-3,0 Кислота серная 12,5-17,5 Вода дистиллированная Остальное Наиболее существенным преимуществом заявляемого способа является повышение точности определения содержания общего или неорганического фосфора за счет стабилизации окраски полученной фос- форно-молибденовой гетерополикислоты во времени и чувствительности за счет использования молибденовокислого натрия. Кроме того, при использовании данного способа производительность труда лаборанта при определении фосфора повышается в 1,2 - 1,5 раза как за счет уменьшения количества операций при подготовке пробы

к анализу, так и за счет увеличения количества проб на одну серию определений (до 30

- 50 вместо 5-8).

Срок годности цветного реактива составляет, по крайней мере, несколько месяцев (реактив хранился 3 месяца без снижения качества).

Способ осуществляется следующим образом: 0,5 г малахитового зеленого растворяют в 250 мл дистиллированной воды, одновременно.растворяют 14,5 г молибде- новокислого натрия двухводного в 250 мл 25%-ной серной кислоты. Оба раствора смешивают, дают отстояться и фильтруют. Цвет

5 готового реактива желто-коричневый.

Построение калибровочной кривой. 439.03 мг высушенного до постоянной массы однозамещенного фосфорнокислого калия (КНгРО/О растворяют в 1 л

0 дистиллированной воды. Концентрация фосфора в основном растворе составляет 100 мг/л. Для приготовления рабочего раствора к 10 мл основного раствора прибавляют 990 мл дистиллированной воды, получая

5 концентрацию фосфора 1 мг/л. Берут 0,3; 0,6; 0,9 и 1,2 мл рабочего раствора, содержащих соответственно 0,3; 0,6; 0,9; и 1,2 мкг фосфора, доводят дистиллированной водой до 1,5 мл, добавляют 2 мл цветореагента и

0 через 10-20 мин колориметрируют при 600

- 650 нм. Строят график, где по оси абсцисс отмечают концентрацию фосфора в мкг, по оси ординат - экстинцию калибровочных проб.

5 Ход определения: 0,01 мл сыворотки крови вносят в 1,5 мл дистиллированной воды, добавляют 2 мл цветореагента и через 10 - 20 мин колориметрируют при 600

- 650 нм против холостого опыта без сыво0 ротки крови. Толщина рабочей части кюветы - 5 мм.

Для определения фосфора в органах или тканях к навеске ткани (1 г) приливают 10 мл концентрированной серной кислоты и

5 минерализуют до обесцвечивания, объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл. Для определения фосфора берут 0,025 - 0,050 мл раствора и дальнейшие операции проводят так же, как и при опре0 делении фосфора в сыворотке крови. В табл.1 показано определение оптимального соотношения компонентов.

Из табл.1 следует, что наиболее оптимальными соотношениями компонентов яв5 ляются: малахитовый зеленый - 0,10 - 0,15%; молибденовокислый натрий 2,8 - 3,0%; кислота серная 12,Г - 17,5%,

При сравнении устойчивости цветного реактива, приготовленного на растворах с серной и соляной кислотами, установлено

(табл.2), что в то время как реактив с соляной кислотой постоянно менял свою окраску во времени в присутствии твина-20 или без Него, реактив с серной кислотой был полностью устойчив в течение всего исследуемого Промежутка времени. Использование твина-20 в цветном реактиве с соляной кислотой замедляло интенсивность развития Окраски, но не устраняло ее. В цветном реактиве с серной кислотой нет необходимо- сти применить твин-20 в качестве стабилизатора. В табл.2 показано сравнение устойчивости цветного реактива с различными кислотами.

При сравнении точности обнаружения фосфора с помощью цветного реактива с различными кислотами установлено, что При использовании цветореагента с соляной кислотой ошибка в точности определения на 11-й и 30-й мин составила 34%, в то время как при использовании серной кисло- }гы данные в указанном временном интерва- ;ле совпали.

; Замена молибденовокислого аммония ;на молибденовокислый натрий привела к

повышению чувствительности способа в 2,0 - 2,5 раза без снижения точности определения фосфора.

Для сравнительного изучения предложенного способа с прототипом было определено количество общего фосфора в 5 опытных образцах сыворотки крови кур в тканях яйцевода и яичника индеек-несушек.

Как видно из табл.3, совпадение результатов при использовании предлагаемого способа через 10 и 20 мин измерения составляет практически 100%, в то время, как в прототипе через 20 мий эта величина составляла 80-83% от количества фосфора, измеренного через 10 мин. Совпадение результатов при использовании обеих способов через 10 мин после приготовления растворов во всех случаях удовлетворительное (4,5% для сыворотки крови кур и 0,45 - 3,91% для тканей яйцевода).

Способ прост в использовании, хорошо воспроизводим и не требует сложного оборудования и дефицитных реактивов.

Использование: аналитическая химия. Сущность: смешивают исследуемую пробу с цветореагентом, состоящим из соли молибденовой кислоты, малахитового зеленого, минеральной кислоты с последующим фото- метрированием раствора, в качестве соли молибденовой кислоты используют молиб- деновокислый натрий, а в качестве минеральной кислоты - серную кислоту, при следующем соотношении компонентов, мас.%: малахитовый зеленый 0,10 - 0,15; натрий молибденовокислый 2,8 - 3,0; кислота серная 12,5 - 17,5, вода дистиллированная остальное. 3 табл. ел с

Ф ормула изобретения

Способ определения фосфора в биологических объектах путем обработки анализируемой пробы цветореагентом, , содержащим соль молибденовой кислоты, малахитовый зеленый, минеральную кислоту и воду с последующим фото метрировани- ем раствора, отличающийся тем, что, с целью сокращения длительности способа, повышения точности и чувствительности

его. в качестве соли используют молибденовокислый натрий, в качестве минеральной кислоты - серную кислоту при следующем соотношении компонентов мас.%: Малахитовый

зеленый0,10-0,15 Молибденовокислый натрий 2,8-3,0 Серная кислота 12,5-17,5 Дистиллированная вода Остальное

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3