Способ получения бактериальных суспензий Советский патент 1989 года по МПК C12N1/04 

I.

Изобретение относится к микробио-. логии, биохимии и может быть использовано для получения стабйлизирован-т ных мембран клеток микроорганизмов.

Целью изобретения является стабилизация мембран как изолированных, так и находящихся в со-ставе неразрушенных клеток бактерий различных таксономических групп.

Пример 1. Суспензию мембран Micrococcus lysodeikticus в количестве 1 мг белка/мл вносят в полярографическую ячейку объемом 1 мл. Добавляют НАДН и малат в качестве субстратов дыхания. Регистрируют скорость поглощения кислорода (контроль).

Затем в ячейку дополнительно вносят алкилрезорцин до концентрации моль,через 1 мин после внесения регистрируют дыхание суспензий. После чего добавляют алкилрезорцин до концентрации IvlQ- оль, регистрируют дыхание суспензии. Операции повторяют при внесении .алкилрёзорци- нов до концентрации 10 моль с щагом концентрации в два раза больще предыдущей .

Полученные данные приведены в табл.1, где указаны концентрации стабилизирующих агентов, вызывающие ингибирование дыхания на 50%. Концентрации алкилрезорцина от 5

О) 09 Ч

3

моль до 0, моль не вызьша подавление дыхания на 50%.

Пример 2. Культуру B.eereu выращивают- на жидкой синтетической среде следующего состава, г/л: 1,0; КС1 0,2; MgS04 7H,fO 0,2; CaClj 0,002; глюкоза 4; мясо- пептонный бульон 10% (об/об) при аэрации 1л воздуха (1 л среды) до стадии перехода вегетативных клеток стационарную фазу роста. Суспензию клеток B.,cereus с ОП 2,0 вносят в полярографическую ячейку объемом I мл. Опыт проводят согласно пример

Проведенные исследования показывют, что при внесении моно- и диапки резорцинов с насыщенным .алкильным радикалом длиной от 4 до 10 атомов

гую до конечной концентрации 4-С 2,510 моль. Стабилизирующий агент вносят в суспензию вегетативных клеток в фазу замедленного роста (ОП 2,0), через 1 ч после внесения стабилизирующего агента клетки микро- скопируют. При рефрактометрическом определении степени рефрактильности клеток после внесения 4-С, с конечной концентрацией 0, Ми 2, установлено, что клетки приобретают степень рефрактильности (-п) аналогичную бактериальным зндоспорам

С аи ДОС пор. П вегет. k«

эндоспор- - вегет. кл .SA кл. ). Полярографическое определение дыхания клеточной суспензии показывает отсутствие поглощения кислорода,, т.е. полное ингибиро

Изобретение относится к микробиологии, биохимии и может быть исполь- зовано для получения стабилизировад- ных мембран клеток микроорганизмов. Целью изобретения является стабилизация мембран как изолированных, так и находящихся в составе неразрушенных клеток бактерий различных таксономических групп (что приводит к стабилизации клеток бактерий), В суспензию клеток бактерий и мембран микроорганизмов вносят стабилизирующий агент в концентрации (0,2-7,0) Ю Моль. В качестве стабилизирующего агента используют алкилрезорцины с насыщенными алкильными радикалами длиной от 4 до 10 атомов углерода, находящимися во 2-,4- или 5-м положении в бензольном кольце. Стабилизированные суспензии клеток бактерий и мембран микроорганизмов различных таксономических групп.хранятся в течение 0,5-2,0 лет при температуре 1-25°С. 4 табл. (Л

углерода, находящимися во 2-, 4- или 20вание ферментов ЭТЦ. На протяжении

5-м положении в бензольном кольце в2 лет при хранении полученных суспенконцентрации 0,2-7,0 моль, взий при температуре от 1 до 25°С

суспензию изолированных мембран, гакактивность ЭТЦ не выявляется. Клетки

и клеток бактерий происходит ингиби-при микроскопировании в фазовом контрование ферментов ЭТЦ, что свидетель- 25раете не теряют высокой степени

ствует об их стабилизации (табл.).

Пример 3. В суспензию мембран М. lysodeikticus вводят гидрофобный зонд пирена до конечной концентрации 15 мкМ. Во флуориметрическую кювету помещают суспензию мембрач в количестве 0,2 мг белка/мл. Регистрируют спектр флуоресцентности пирена при возбуждении (335 нм). Из соотношения интенсивности флуоресцентности эксимеров (470 им) и мономеров (393 нм) оценивают параметры экси- меризации (контроль). В суспензию мембран с введенным зондом пирена

ю

вносят 5-С

стве 0,2-1 ,0 «Ю моль. Проводят измерения аналогично контрольному варианту.

Данные приведены в табл.2.

апкилрезорцин в количе- 40 зию стабилизированных мембран хранят

в течение 6 мес при 1°С.- С периодичностью в Г мес проверяют оксидазную активность ферментов ЭТЦ при использовании в качестве субстрата малат.

Из полученных результатов следует, 45 также определяют оптическую плотчто параметр эксимеризации пирена снижается по мере увеличения концентрации алкилрезорцина. Алкилрезорцин существенно снижает латеральную диффузию липидов в мембране, что свидетельствует о стабилизации липидов в мембране.

Пример 4, Культуру B.eereus выращивают на жидкой синтетической среде, состав которой приведен в примере 2,

В одну часть суспензии B.eereus вводят алкилрезорцин 4-С(, с конечной концентрацией О.ЗМО моль, а др /светопре-ломления и сохраняют свою целостность. Оптическая плотность клеточных суспензий за время хранения не меняется, что свидетельствует об 0 отсутствии деградационных процессов.

В табл.3 приведены условия стабилизации суспензии мембран М.lysodeikticus при внесении стабилизирующих агентов - алкилрезорцинов (4-С , 5-С(о),

Пример 5. В суспензию мембран М, lysodeikticus с количеством 2,0 мг белка/мл вносят 4-С до конечной концентрации 0,5 Ю М. Суспен5

ность суспензии.

На протяжении всего периода хранения активность ЭТЦ не выявляется. gQ СП суспензии не снижается. Это свидетельствует о стабилизации и сохранности мембранных препаратов.

В табл.4 даны условия стабилизации суспензий мембран B.cereus при eg внесении стабилизирующих агентов- алкилрезорцинов (4-С , 5-С ().

Пример 6. Условия проведения опытов приведены-в табл. 3. О стабильности суспензий мембран судят по параметрам, описанным в примере 5, определения проводят с той жа периодичностью, данные соответствуют вышеприведенным результатам.

Пример 7. Опыты проводят аналогично примеру 5, но с суспензией мембран B.cereus. Условия проведения опытов приведены в табл.4. Параметры, свидетельствующие о стабильности суспензии мембран B.cereus, определяют в соответствии с примером 5, с той же периодичностью.

Результаты опытов идентичны данным опыта примера 5.

Таким образом, предлагаемый способ получения стабилизированных су-спен- зий биологических мембран позволяет стабилизировать как изолированные мембраны, так и находящиеся в составе неразрушенных клеток бактерий, что В последнем случае приводит к стабилизации клеток бактерий, стабилизи- ровать мембраны вне зависимости от

Апкилрезорцины, имеющие алкильные радикалы с длиной менее 4 -х атомов углерода, не эффективны в указанном диапазоне концентраций стабилизирующего агента.

таксономического положения бактерий, из которых выделены мембраны,и хранить стабилизированные суспензии биологических мембран и клеток бактерий длительное время (0.,5-2,0 года) в широком интервале температур от 1 до 25 С.

Формула изобретения

Способ получения бактериальных суспензий путем введения стабилизи- руюцего агента, отли-чающийс я тем, что, с целью стабилизации мембран как изолированных, так и находящихся в составе неразрушенных клеток бактерий различных таксономических групп, в .качестве .стабилизирующего агента используют моно- и диалкилрезорцины с насыщенными апкиль- ными радикалами длиной атомов углерода, находящимися в 2-,4- или 5-м положениях в бензол,ьном кольце,

в концентрации (0,2-7,0) -10 моль.

Таблица 1

Концентрация

5-CJ, -Ю М О 0,2 0,3 0,8 1,0

Таблица 3

Примечание, В указанных условиях суспенаин сохраняют стабильность в течение 6 мес.

Т а б ли ц а 2

Таблица 4

П р и м е ч а. и и е. В указанных условиях 30 суспензии сохраняют стабильность в течение б нес.