Способ определения размера фотосинтетической единицы в клетке фототрофного объекта Советский патент 1992 года по МПК G01N21/25 

Изобретение относится к области экспериментальной биохимии и физиологии фототрофных микроорганизмов, а именно к методам определения структурно-функциональных характеристик их фотосинтетического аппарата, и может быть использовано для диагностических целей в фотобиотехнологии производства биомассы клеток бактерий с направленными изменениями эффективности утилизации световой энергии.

Наиболее близок к предлагаемому способ определения размеров фотосинтетических единиц в хлоропластах растений, включающий измерение в образцах кривых светового насыщения реакций окисления воды и фотовосстановленных переносчиков электронов с выделением и поглощением

кислорода при облучении микросекундными вспышками.

Однако применение этого способа затруднено тем, что фототрофные бактерии существенно отличаются от растений по физиологическим и биохимическим свойствам, а также структуре фотосинтетического аппарата. Большинство типов фототрофных бактерий неспособны окислять воду с выделением кислорода, в качестве основного фотосинтетического пигмента синтезируют бактериохлорофилл с иными по сравнению с хлорофиллом растений спектральными свойствами, причем включающие этот пигмент комплексы фотосинтетических единиц в свою очередь проявляют большую вариабельность по спектральным свойствам в sasncHMqcTH or вида бактерий и условий среды при выращивании

VI 00 4 00 vj vj

Целью изобретения является расширение функциональных возможностей способа за счет селективного определения физиологически активного бактериохлоро- филла.

Сущность предлагаемого способа определения размеров фотосинтетических единиц бактерий основана на возможности возбуждения специфической фотореакции посредством функционально сопряженного с реакционными центрами светособираю- щегобак ерШх Ло рофй 1ла ля гТбследую1це- го расчёта искомой величины по измеряемым параметрам этой реакции.

Выбор процесса фотоингибирования дыхания клеток бактерий как специфического показателя активности фотореакции обусловлен тем, что у этих микроорганизмов энергетика фотосинтеза и дыхания тесно взаимодействует при участии ряда общих мембранных комплексов и промежуточных продуктов реакций. Поэтому функционально активные комплексы фотосинтетических единиц, в которых при возбуждении квантами света произошло разделение и стабилизация зарядов, влияют на перенос электронов в дыхательной цепи и, следовательно, на скорость поглощения кислорода клетками бактерий в аэробных условиях.

Зависимость относительной величины фотоингибирования дыхания от энергии вспышки света микросекундной длительности (в течение этого времени возможно только однократное разделение зарядов в реакционных центрах) должна соответствовать теории одноударного попадания а ми- шень квантов света и описываться экспоненциальным уравнением:

Y - 1 - ехр(- 2Е), (1)

где Y - относительная величина фотоииги- бирования дыхания клеток на одиночную вспышку света; 2- оптическое сечение поглощения фотосинтетической единицы; Е - энергия вспышки света.

Размеры фотосинтетических единиц по числу содержащихся в них молекул бактери- охлорофилла (N) рассчитывают из соотношения:

N 2 сг,

(2)

где сг- оптическое сечение поглощения молекулы бактериохлорофилла при данной длине волны возбуждающего света.

Длину волны возбуждающей вспышки света выбирают, чтобы обеспечить максимальную точность определения размеров фотосинтетической единицы. С этой целью эффективность реакции фотоингибирования дыхания измеряют в спектральной области, где коэффициент экстинции бактериохлорофилла, во-первых, имеет малую величину и, следовательно, минимальны эффекты неравномерного поглощения света клетками, во-вторых, этот коэффициент слабо зависит от видовых или адаптивных изменений состава пигмент-белковых комплексов мембран бактерий.

Переходный процесс фотоингибирования дыхания у клеток бактерий на одиночную микросекундную вспышку света протекает за короткое время (несколько секунд), а величина скорости реакции сравнительно мала, причем зависит не только от энергии вспышек света, но и темновых интервалов между ними, а также физиологических условий в среде (в частности, от концентрации кислорода). Поэтому к системе регистрации скорости газообмена кислорода у образца бактерий предъявляются

повышенные требования в отношении чувствительности, быстродействия и стабильности условий среды. Эти необходимые характеристики обеспечивает специальная модификация полярографического устройства для измерения концентрации кислорода в растворах.

Расположение клеток бактерий на горизонтальной поверхности платинового электрода в пределах диффузионного слоя

реакции электровосстановления кислорода локализует минимальный объем раствора (несколько десятков микролитров), в котором происходят изменения равновесной концентрации кислорода, пропорциональные скорости биологического процесса.

Этот принцип устройства полярографической ячейки повышает на несколько порядков ее чувствительность и уменьшает инерционность. Вместе с тем, для того, чтобы предотвратить лимитирование дыхания бактерий недостатком кислорода и переход их к анаэробному метаболизму, необходимо стабилизировать толщину диффузионного слоя и оптимальную локальную концентрацию кислорода в месте расположения клеток. С этрй целью в объеме полярографической ячейки над мембраной, фиксирующей образец в тонком слое раствора на платиновом электроде, оставляют воздушную газовую фазу (электрод сравнения должен располагаться в буферном растворе ниже этого уровня, чтобы обеспечивалась электрическая замкнутость цепи). Кроме того ограничивают концентрацию клеток в образце, чтобы они в среднем образовывали

монослой на измерительном электроде (этому условию обычно соответствует оптическая плотность образца не более 0,1-0,2 в области максимума поглощения).

Оптимальную длительность темновых интервалов между микросекундными вспышками света, которая о пр еДёлМет точность сравнения измеряемых полярографических сигналов, оценивают по времени затухания осцилляции величины фотоинги- бирования дыхания на отдельные вспышки при установлении равновесия редокс-со- стояния цепи переносчиков электронов в мембранах бактерий.

Способ осуществляется в следующей последовательности:

1.Образец суспензии клеток бактерий помещают на поверхность платинового электрода в слое 0,5 мм с оптической плотностью 0,1-0,2.

2.Полярографическую ячейку частично заполняют буферным раствором, чтобы обеспечивался электрический контакт между парой электродов, но оставался слой воздуха над целлофановой мембраной, фиксирующей образец на платиновом электроде.

3.Записывают полярографические сигналы фотоингибирования потребления кислорода клетками бактерий под воздей- ствием микросекундных вспышек света насыщающей энергии в области 800-900 нм, а также вспышек света известной ненасыщающей энергии в области 700 нм стемновы- ми интервалами 2 мин.

4.Измеряют соотношения амплитуд этих сигналов для расчета размеров фотосинтетических единиц в клетках бактерий.

Способ реализуют на модульной установке, включающей полярографическое ус- тройство с системой регистрации тока электровосстаиовления кислорода и импульсный источник освещения 4. В качестве стабильного источника импульсов света микросекундной длительности с достаточно высокой энергией и широким спектром излучения используют строботрон ИСШ-100- ЗМ. Необходимую спектральную область возбуждения измеряемой фотореакции выделяют интерференционным светофильт- ром или комбинацией граничных светофильтров. Энергию монохроматической вспышки света измеряют радиационным термоэлементом РТН-20 С.

Пример 1. Культуры пурпурных бактерий Rhodobacter capsulatus и Rhodo-0 spirillum rubrum выращивают 2 сут в безкис- лородной жидкой среде с малатом (составы Хатнера и Ормеруда) при 28°С и непрерывном освещении 2000 лк от ламп накаливания.

На поверхность платинового электрода площадью 30 мм2 микро.пипеткой наносят 20 мкл суспензии клеток бактерий, образующей слой 0,65 мм с оптической плотностью 0,1-0,2 при 880 нм, и фиксирую его целлофановой мембраной. Полярографическую ячейку заполняют раствором 0,05 М KCI и 0,05 М фосфатного буфера рН 6,8 до уровня нижней границы этой мембраны, оставляя над ее внешней поверхностью до оптического окна слой воздуха. Регистрируют ток электровосстаноблШия кислорода на платиновом электроде при потенциале -0,6 В относительно хлорсеребряного электрода сравнения.

Образец последовательно освещают микросекундными вспышками света в спектральной области 800-900 нм (энергия вспышки 4х1015 квантов/см2) и 700 нм (1,87x10 квантов/см ) с темновыми интервалами 2 мин и записывают полярографические сигналы импульсов тока обратимых изменений концентрации кислорода в слое клеток бактерий. Для повышения точности измерений отношения амплитуд этих сигналов воспроизводят несколько повторностей воздействия этих пар вспышек света.

По величине отношения амплитуд сиг- Налов фотоингибирования дыхания на вспышке ненасыщающей (в области 700 нм) и насыщающей для этого процесса энергии (в области 800-900 нм) рЗссчитывают оптическое сечение поглощения фотосинтетической единицы бактерий при 700 нм, используя логарифмированную форму уравнения 1.

Например, в образце клеток R capsu latus зарегистрирована относительная величина сигнала фотоингибирования дыхания на вспышку света в области 700 нм равная 0,19. Расчет оптического сечения поглощения фотосинтетической единицы:

а -1п(,19)/1,87хЮ14 о 1, см2 11,2 А02,

Согласно известным данным, оптическое сечение поглощения молекулы бакте- риохлорофилла в пигмент-белковых комплексах мембран бактерий составляет при 700 нм 0,21 А . Подставляя эту величину в уравнение 2, рассчитывают размеры фотосинтетической единицы:

N 11,2/0,31 53

В сериях измерений из п.ти биологических повторностей на различных культурах клеток Rhodobacter capsulatus эта величина составляет 51+6, а в клетких Rhodosplnllum rubrum мо лекул бактериохлорофилла.

В аналогичных измерениях на культуре бактерий Rhodopseudomonas palustrls штамма АБ, выращенных при низких (200 л к) и высоких (20000 лк)освещенностях, размеры фотосинтетических единиц составляют 104+13 и 41+4 молекулы бактериохлорофил- ла.

Таким образом, способ позволяет диаг- ностировать видовые различия и адаптивные изменения под действием факторов внешней среды размеров фотосинтетических единиц в клетках фототрофных бактерий.

Предлагаемый способ определения размеров фотосинтетических единиц в клет- ках фототрофных бактерий имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с известным спектроскопическим методом, основанным на измерениях стехиометриче- ских соотношений двух различных фракций бактериохлорофилла. Во-первых, измерительная процедура сводится к экспериментальному определению только одного численного параметра вместо двух, что упрощает и ускоряет проведение анализов об- разцов. Во-вторых, определяемый параметр не зависит от присутствия в образце функционально негативного бактериохлорофилла, что повышает точность измерений по сравнению с известным спо- собом. Высокая селективность предлагаемого способа к диагностированию

структурнофункциональных свойств пигментного аппарата физиологически активных клеток позволяет использовать его для прижизненного экспресс-анализа биомассы фототрофных микроорганизмов в фото- биотехнологических реакторах. Формула изобретения Способ определения размера фотосинтетической единицы в клетке фототрофного объекта, предусматривающий облучение клетки микросекундными вспышками света, регистрацию физиологического параметра клетки и расчет размера фотосинтетической единицы по формуле, отличающийся тем, что, с целью расширения функциональных возможностей способа за счет селективного определения физиологически активного хлорофила, перед облучением объекта суспензию клеток помещают на поверхность платинового электрода в тонкослойной полярографической ячейке с воздушной газовой фазой над мембраной, фиксирующей суспензию клеток, облучение клеток осуществляют последовательно светом длиной волны 700 нм и 800-900 нм ненасыщающей энергией 1-5.10 квантов/ см2 и более Ю1 квантов/см2, соответственно с темновыми интервалами от 2 до 5 мин, после чего регистрируют сигналов фотоин- гибирования дыхания у клеток, а в качестве физиологического параметра используют соотношение амплитуд сигналов.