Способ получения изолированных клеток печени Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

1

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине.

Целью изобретения является повышение функциональной активности изолированных клеток печени.

Пример 1. Перфузию печени животных весом 200-250 г проводят in situ. Для этого вскрывают брюшную полость анестезированных животных вводят инъекционную иглу в воротную вену и закрепляют лигатурой,а нижнюю пблую вену надсекают в месте ответвления правой почечной вены для оттока перфузата. На первом этапе отмывку печени от . крови проводят раствором Локка (рН 7,6) в течение 10- 15 мин при температуре раствора 37°Ci, Состав раствора Локка, г/л;

Хлористый натрий 9,00

Хлористый калий0,42,

(Л

Лимоннокислый натрий 7,90 Двууглекислый натрий 0,30 Глюкоза1,80

Дистиллированная вода Остальное Раствор пропускают со скоростью 25 мл/мин в течение 10-15 мин (объем 250-350 мл). На втором этапе перфузию проводят раствором Локка, в который вводят 2 мК ЭДТА (рН 7,4).

Перфузию осуществляют с той же скоростью, расход перфузата 600- 700 мл. Общее время перфузии 30- 40 мин. После окончани перфузии печень извлекают из брюшной полости, измельчают ножницами в сахарозной среде, содержащей 1,2 мМ.

Состав среды дезагрегации, г/л: Сахароза86,000

Хлористый калий 0,372 Фосфорнокислый калий однозамещенный 0,054 Фосфорнокислый натрий

ел |

двузамещенный

Хлористьш магний Хлористьш .кальций

Альбумин

Дистиллированная вода

Дезагрегацию осуществляют, с помощью вибрационного устройства при час- готе 50 Гц в течение 60 с, Получен- 1ую суспенз.ию фильтруют через нейлон и проводят очистку первичной суспензии гепатоцитов серией отмывок для удаления поврежденных клеток. После этого полученные клетки ресуспендиру- ют в среде 199 с таким расчетом, что- бы получилась оптимальная концентрация 1-3x10 кл/мл (объем 150-200 мл).

Колич ество неповрежденных клеток определяют методом окраски трипано- вым синим (0,4%).

Функциональную активность (уровень эндогенного дыхания, стимуляции эндогенного дыхания 1-5 мМ сукц1;1на- том, содержание адениннуклеотидов) определяют как евежевьщеленных клеток, так и после культивирования (в суспензии).

j Результаты опытов по определению выхода гепатоцитов (п 10) приведены в табл. 1.

Данные, представленные в табл. I, свидетельствуют о том, что предлагаемый способ позволяет получить жизнеспособные клетки печени, которые не теряют своей функциональной активности и после культивирования в суспен :зии в среде 199.

: Клетки, получаемые по известному способу, прокрашиваются трипановым синим на начальных этапах культиви- рования.

I В табл. 2 предстэвле1-1ы биохимические показатели функциональной полноценности клеток (п 10), полученных по изв-естному и по предлагаемому спо собам.

Из табл. 2 видно, что уже на этапе вьщеления клетки характеризуются высоким эндогенным дыханием (в 5,2 раза превышает данные известного спо соба). Дыхание не изменяется в процессе двухчасового культивирования в условиях суспензии. Сукцинат (1-5 мМ в норме., не проникающей через плазматическую мембрану, в 1,6 раза меньше стимулирует эндогенное, дьжание по сравнению с известным способом. Куль

тивирование клеток, полученных по изобретению, не изменяет степень стимуляции эндогенного дыхания сукцина- том. Коэффициент дыхательного контроля сукцината (VC,KU,/V энд превышает 1,33 у свежевьщеленных, в то время как для культивированных клеток он несколько ниже.

У полученных гепатоцитов при культивировании способность сохранять высокое содержание АТФ значительно возрастает и достигает величин, харак- . терных для пеуфузируемой печени, что также является подверждением высокой функциональной активности получаемого материала.

Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но с тем от- личием, что перфузию печени осуществляют только раствором Локка (без добавления ЭДТА на втором этапе) (табл. 3).

Из табл. 3 видно, что перфузия печени раствором Локка, не содержащим хелатирукщего агента ЭДТА, приводит к значительно меньшему выходу функционально полноценных клеток (в расчете на влажный вес печени).

Пример 3. Способ осуществляо

g

0 gg

5

ют аналогично примеру 1, но с тем отличием, что дезагрегацию клеток проводят в сахарозной среде, используемой в прототипе (без CaCl,).

Результаты приведены в табл. 4 (п 4).

Из табл. 4 видно, что при дезагрегации клеток в среде, используемой в известном способе, количество жизнеспособных кпеток резко снижается.

Формула изобретения

Способ получения изолированных клеток печени, включающий перфузию органа с последующей.его дезагрега- цие й в сахарозной среде с помощью вибрации, отличающийся тем, что, с целью повышения функциональной активности клеток, перфузию органа проводят в два этапа, раствором Локка, причем на втором этапе в раствор Локка вводят ЭДТА в количестве 2 мМ, а среда дезагрегации содержит хлористый кальций в количестве 1,2 мМ.

Таблица I

Известньй Предлагаемьм

586117 236120

Известньй2,321 - 0.3

4,8tO,3 Т а.б лица 3

ка одиоэтапно 78,5±0,8 81±2,5 Предлагаемый 236,012,0 9И2,О

9810,4. 91±2,0

3tO,5 9411,8

Таблица 2

2,06

Таблица 4

5,8tO,7 236±2 ,0

75 ±3,0

9112,0