Среда для гипотермического хранения изолированных гепатоцитов Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам .длительного хранения изолированных гепатоцитов в условиях гипотермии.

Известно использование среды 199 для геотермического хранения гепатоцитов.

Однако эта среда не обеспечивает высокой морфофункциональной сохранности гепатоцитов.

Наиболее близкой к изобретению является среда для гипотермического хранени я гепатоцитов, включающая на 1 л трмс-НС1- буфера: сахароза 0,125 М; хлористый натрий 0,075 М; хлористый кальций 1,2 М.

Однако известная среда не обеспечивает высокой морфофункциональной сохранности гепатоцитов, что обусловлено наличием в ней NaCf, неблагоприятно влияющего на клетки.

Целью изобретения является повышение морфофункциональной сохранности гепатоцитов.

Пример. Выделение гепатоцитов проводили неферментативным методом с использованием ЭДТА и щадящей дезагрегации печени пластинчатым пестиком при возвратно-поступальном движении его со скоростью оборота вала 3000 об/мин.

Свежевыделенные клетки оценивали по степени интактности плазматической мембраны и метаболической активности последующим тестам: окрашивание клеток 0,6%-ным раствором трипанового синего в условиях 10-15-минутнрй инкубации при комнатной температуре, скорость эндогенного дыхания, содержание АТФ, степень связанности ЛДГ. После этого клетки переводили в стерильные растворы среды, разлитой в бакпечатки 5-10 мл и содержащей следующие компоненты, мас.ч: хлористый калий 0,300-0,400; хлористый магний 0,100- 0,200; хлористый кальций 0,100-0,200; фос- форнокислый калий 0,050-0,100; фосфорнокислый натрий 0,050-0,100; сахароза 70,0-100,0; альбумин 5,0-10.0; трис- HCI-буфер - до 1000 мл.

Концентрация клеток составляла (5-10) 10Ь кл/мл. бакпечатки хранили в течение 3 сут в бытовом холодильнике. ТемСО

С

vj

01 О W СП

пература раствора 4-5°С, Стерилизацию среды проводили с использованием микропористых капроновых мембран.

Результаты представлены в табл.1.

Из табл.1 следует, что предлагаемая среда обеспечивает более высокую морфо- функциональную сохранность гепатоцитов, чем известная. Это подтверждается тем, что изолированные гепатоциты э заявляемой среде хорошо переносят нормотермиче- скую инкубацию (табл.2).

ПолучейМШПрезуЛьтаты свидетельствуют о том, что предлагаемая среда позволяет сохранять структурно-метаболический статус гепатоцитов в процессе хранения их при 4°С в течение 3 сут, которые являются максимальны сроком этой системы клеток.

0

5

Формула изобретения

Среда для гипотермическогс хранения изолированных гепатоцитов включающая хлористый натрий, хлористый кальций и сахарозу, отличающаяся тем. что, с целью повышения морфофункциональной сохранности, она дополнительно содержит хлористый калий, хлористый магний, фосфорнокислый калий, фосфорнокислый натрий, альбумин при следующих соотношениях, мас.%: хлористый калий 0,300- 0,400: хлористый магний 0,100-0,200; хлористый кальций 0,100-0,200; фосфорнокислый калий 0,050-0,100; фосфорнокислый натрий 0,050-0,100; сахароза 70,0-100,0; альбумин 5,00-10,0: вода - до 1000 мл. ;

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: для повышения морфо- функциональной сохранности гепатоцитов используют среду, которая содержит следующие компоненты, г/л, трис-НС -буфера, рН 7,4: хлористый калий 0,300-0,400; хлористый магний 0,100-0,200; хлористый кальций 0,100-0,200; фосфорнокислый калий 0,050-0,200; фосфорнокислый натрий 0,050-0,100; сахароза 70,00-100,0; альбумин 5,000-10,00. 3 табл.

Метаболические параметры изолированных гепатоцитов до и после 3 сут гипотермичесхого хранения ()

Метаболическое состояние консервированных клеток после нормотермической инкубации ()

Таблица 1

Таблица 2