Способ консервирования гепатоцитов Советский патент 1993 года по МПК A61K47/00 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для консервирования клеток, выделенных из тканей.

Цель изобретения - повышение морфо- функциональной сохранности гепатоцитов.

Поставленная цель достигается тем, что в способе консервирования гепатоцитов, включающем инкубацию суспензии клеток в среде, содержащей диметилсульфоксид, с последующим ступенчатым охлаждением до температуры жидкого азота, в среду сус- пендирования добавляют CaCl2, охлаждение проводят в два этапа; на первом этапе суспензию клеток охлаждают до ()0С и выдерживают 20-60 мин, а затем помещают в жидкий азот.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для выделения гепатоцитов вскрывали брюшную полость анестезированных животных массой 200-300 г, вводили канюлю в воротную вену, надсекали нижнюю полую вену и перфузировали

печень со скоростью 25-35 мл/мин при 37°С раствором, содержащим 0,25 М сахарозу, 5 мМ KCI, 0,4 мМ КН2Р04, 1,6 мМ NaHPO, 0,8 мМ MgCla, 50 мМ трис-HCI, 4 мМ ЭДТА, рН 7,4. После окончания перфузии печень извлекали из брюшной полости, измельчали и подвергали дезагрегации с помощью вибрационного устройства в среде перфузии, где ЭДТА заменяли на 2 мМ CaCte. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр. Жизнеспособные клетки отделяли путем дифференциального центрифугирования и суспендировали в среде дезагрегации. Гепатоциты, суспендировали в среде, содержащей 250 мМ сахарозы, 5 мМ KCI, 0,4 мМ КН2Р04, 1,6 мМ NaHP04, 0,8 мМ MgCb, 50 мМ трис-HCI, 2 мМ CaCte (рН 7,4), инкубировали при 2 - 4°С с 10%-ным ДМСО, приготовленным на этой же среде, в течение 10 мин. Консервирование гепатоцитов осуществляли по следующей программе: на первом этапе охлаждали от 2 до -25° С путем погружения контейнеров с суспензией клеток в жидкость, предварительно охлажденную до -25°С, и выдерживали при этой температуре

ел

с

ы

4 ел

30 мин. На втором этапе охлаждали до - 196°С, погружая контейнеры в жидкий азот.

Морфологический анализ суспензии ге- патоцитов проводили методом окрашивания 0,2%-ным раствором трипанового синеф. Дыхательную активность определяли полярографически. Детоксикационную активность определяли по образованию р- нитрофенола при инкубации гепатоцитов при 35°С с р-нитроанизолом,

В табл. 1 представлены морфофункцио- нальные характеристики гепатоцитов, консервированных предлагаемым способом и способом прототипом.

Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что использование данного способа позволяет получить консервированные гепатоциты, дыхательная активность которых в 2 раза меньше по сравнению с прототипом. Эффективность окислительного фосфорилировэния митохондрий в составе клетки также лучше сохраняется при использовании этого способа. Особенно резкие различия между способами были выявлены при определении коэффициента стимуляции дыхания сукцикатом, который характеризует целостность плазматической мембраны клеток (сукцинат слабо проникает через интак- тную плазматическую мембрану). Клетки, консервированные предлагаемым способом, способны осуществлять детоксикацию ксенобиотиков, что позволяет использовать их для лечения печеночной недостаточности.

Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, только изменяли конечную температуру охлаждения на первом этапе.

Из табл. 2 видно, что оптимальной температурой остановки на первом этапе охлаждения является (-20}-{-28)0С. При снижении температуры сохранность изолированных ге0

патоцитов снижается почти на 30%, а при повышении - на 38%.

Пример 3. Способ осуществляли аналогично примеру 1, только изменяли время температурной остановки.

Из табл. 3 видно, что оптимальным временем остановки на первом этапе охлаждения является 20-60 мин. При уменьшении и увеличении времени остановки сохранность изолированных гепатоцитов снижается на 25-30%.

Преимущества способа.

1. Способ обеспечивает высокую мор- фо-функциональную сохранность гепатоци- 5 JOB: скорость эндогенного дыхания в 2 раза вышеЛем по прототипу, в степень стимуляции дыхания сукцинатом, как показатель интактности плазматической мембраны, в 3 раза ниже, Сохранение детоксикационной функции консервированных гепатоцитов позволяет использовать их как для изучения механизмов биотрансформации ксенобиотиков, так и для лечения печеночной недостаточности.

2. Способ проще прототипа, поскольку предусматривает двухэтапное охлаждение образца.

0

5

Формула изобретения Способ консервирования гепатоцитов, включающий инкубацию суспензии клеток в среде, содержащей диметилсульфоксид, с последующим ступенчатым охлаждением до температуры жидкого азота, отличаю- щ и и с я тем, что, с целью повышения морфо-функциональной сохранности гепатоцитов, в среду суспендирования добавляют хлористый кальций, охлаждение проводят в два этапа, при этом на первом этапе сус- пензию клеток охлаждают до (20)-(-28)°С и выдерживают в течение 20-60 мин, а затем помещают в.жидкмй азот,

Использование: биология, медицина, криобиология. Цель изобретения - повышение морфо-функциональной сохранности гепатоцитов. Сущность изобретения - гепа- тоциты инкубируют при 244°С с Ю-15%- ным диметилсульфоксидом в течение 10-15 мин. замораживают до (-20)-(28)0С, выдерживают при этой температуре 20-60 мин, затем погружают в жидкий азот и замораживают до -196°С. 3 табл.

Показатели

Исключение трипанового синего, %

Скорость эндогенного дыхания, нмоль 02 мин/мг белка

Коэффициент стимуляции эндогенного дыхания сукцинатом

Коэффициент стимуляции эндогенного дыхания разобщителем

Предлагаемый способ Способ-прототип

85,3+10,3Не определяли

8,8 + 0,64,0 ± 0,5

1,25 + 0,05

1,80 + 0,10

3,9 ± 0,1 1,65 ± 0,05

Т а б л и ц а 1

1,25 + 0,05

1,80 + 0,10

3,9 ± 0,1 1,65 ± 0,05

Продолжение табл. 1

Таблица2

ТаблицаЗ