Способ получения изолированных гепатоцитов Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии, экспериментальной и химической медицине.

Целью изобретения является повышение морфо-функциональной сохранности гепатоцитов.

П р и м е р 1. Для получения гепатоцитов используют печень, извлеченную из трупов людей, скоропостижно умерших от острой сердечно-сосудистой недостаточности со сроком ишемии не более 1,5-2,0 ч. Вес печени 1500-1700 г. Перфузию печени проводят следующим образом. Нижнюю полую и печеночные вены пересекают между двумя лигатурами, портальную вену канюлируют. На начальном этапе нерециркуляторную перфузию проводят безкальциевым, охлажденным до +4°С раствором Коллинза, объемом 5,0 л под давлением 100-150 мм вод.ст., рН 7,4-7,5, в течение 10 мин. Затем проводят перфузию 2,0 л раствора Хенкса без

кальция при температуре перфузата в момент начала перфузии +37°С и постоянной оксигенации. После этого печень помещают в термостатированный раствор Хенкса и продолжают рециркуляторную перфузию этим же раствором, но с 1 мМ ЭДТА при постоянной оксигенации раствора в течение 30 мин. Скорость перфузии на всех этапах -250-300 мл/мин. После окончания перфузии печень освобождают от капсулы, измельчают на холоде (2-4°С) ножницами в охлажденной сахарозной среде следующего состава, мМ: сахароза 250; КС1 5; N32HP04 0,4; КН2Р04 0,4; MgCI2 0.8 мМ; ЭДТА 1;СаС12 2,5; HEPES 10; альбумин 1%, рН 7,5-7,4. Дезагрегацию осуществляют с помощью вибрации при частоте 50 Гц в течение 90 с. Полученную суспензию фильтруют через два слоя нейлона, после чего гепатоциты промывают 2-3 раза стандартным раствором Хенкса при центрифугировании 3-4 мин 1000 об/мин. Полученный

fc

О

ел о

VI

о

осадок клеток в соотношении 1:10 заливают средой 199 во флаконы емкостью 250,0 мл и 500,0 мл и хранят в холодильнике при +4°С. В 1,0 мл полученной взвеси содержится в среднем 2- клеток.

Морфологический контроль суспензии проводят электронно-микроскопически.

Электронно-микроскопический анализ изолированных гепатоцитов показывает хорошую сохранность плазматической мембраны, митохондрий наружной мембраны, эндоплазматического ретикулума с рибосомами и т.д.

Функциональную активность полученных гепатоцитов определяют по включению 14С-гидролизата белков хлореллы.

Гепатоциты включают 14С-гидролизат белков хлореллы более интенсивно, чем по известному способу, что свидетельствует о сохранении белоксинтезирующей системы клеток на более высоком уровне.

Результаты белоксинтезирующей активности гепатоцитов, п 5-6,даны ниже.

Одним из наиболее чувствительных тестов, позволяющих адекватно судить о сохранности полученных гепатоцитов, является определение мембранного потенциала, которое проводят с помощью потенциал-зависимого флуоресцирующего зонда-катиона ДСМ +/5/. Концентрирование зонда в клетках обусловлено трансмембранным потенциалом цитоплазматической и митохондриальной мембран. Снижение суммарной интенсивности флуоресценции зонда в клетках полученным известным способом свидетельствует о более выраженной деполяризации плазматической мембраны, увеличении протонной проницаемости клеток. Интенсивность флюоресценции ДМС+ в гепатоцитах, п 5-6, приведена в табл.2

Таким образом, заявляемый способ позволяет получить гепатоциты с более высоким уровнем морфо-функциональной сохранности,чем прототип.

П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но с различными концентрациями CaCl2 в среде дезагрегации.

Как видно из таблицы, добавка CaCl2 в среду дезагрегации в концентрации 2,5 мМ позволяет получить гепатоциты, включающие 14С-гидролизат белков хлореллы наиболее интенсивно. Уровень флуоресценции ДСМ+ свидетельствует о высоком мембранном потенциале.

Функциональные показатели гепатоцитов, полученных с использованием в среде

дезагрегации CaCl2 в различных концентрациях, п 5-6, даны в табл.3

Таким образом, из проведенных экспериментов следует, что предлагаемый способ повышает морфо-функциональную сохранность изолированных гепатоцитов. Формула из-обретения Способ получения изолированных гепатоцитов, включающий перфузию печени раствором Хенкса и последующую дезагрегацию в сахарозной среде, отличающий- с я тем, что, с целью повышения морфофун- кциональной сохранности гепатоцитов, перфузию проводят в три этапа: вначале охлажденным раствором Коллинза, далее

раствором Хенкса, а затем раствором Хенкса с добавлением 1 мМ ЭДТА при постоянной оксигенации, а дезагрегацию проводят в присутствии хлористого кальция в количестве 2,5 мМ.

Таблица1

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии, экспериментальной и клинической медицине. Целью изобретения является повышение морфофункциональной сохранности гепатоцитов. Для этого печень перфузируют охлажденным до 4°С раствором Коллинза, затем при постоянной окси- генации раствором Хенкса в два этапа. На втором этапе в раствор Хенкса вводят 1 мМ ЭДТА. Дезагрегацию осуществляют в сахарозной среде, содержашей 2,5 мМ хлористого кальция. 3 табл.

Таблица 2

Таблица 3