Способ получения изолированных клеток печени Советский патент 1987 года по МПК C12N5/00 

113

. Изобретение относится к биотехнологии, и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине.

Цель изобретения - увеличение выхода жизнеспособных клеток печени с повьт енной степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования,

Способ получения изолированных клеток печени иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Вскрывают брюшную и грудную полости декапитированной крысы массой 200 г„-нижнюю полую вену перевязьгоают вьше места ответвления правой почечной вены и перевязывают дистальнее лигатуры, нижнюю полую вену надсекают в месте впадения ее в предсердие. В просвет сосуда вводят инъекционную иглу и с помощью перистальтического насоса проводят промывание печени 200 мл промывного раствора Хенкса без кальция и глюкозы. Печень извлекают из грудной полости и разрезают на кусочки размером 1-3 мм, затем переносят в сосуд устройства, содержащий 10 мл раствора состава 250 мМ сахарозы, 5 мМ КС1, 0,4 мМ КН2Р04, 0,4 мМ NaHaP04 , 2 мМ дитиотреитола, 1 мМ ЭДТА, 0,8 мМ MgClj и 1% альбумина. рН раствора 7,А

Далее включают электродвигатель и дезагрегируют кусочки печени при возвратно-поступательном движении пестика с частотой 50 Гц и амплитудой 5 мм..

Дезагрегирование осуществляют в течение 60 с. Полученную суспензию клеток фильтруют через 4 слоя нейлона и осаждают при 1500 об/мин в течение 1,5 мин. Полученные клетки дваясды промьгоают раствором.

Жизнеспособность клеток определяют по их окрашиванию в 0 2%-нoм растворе витального красителя Т15ипанового синего.

Предлагаемый 2,32+0,3 10,9+0,9 4,8±0,3 4,2

04262

. Подсчет жизнеспособных клеток осуществляют в камере Горяева,

Результаты опытов по определению выхода жизнеспособных гепатоцитов, 5 представлены в табл. 1. Выход жизнеспособных клеток п 7.,

Т а б л ,и ц а

Известный

50,0+2

240±40 92+1,2

Предлагаемый 58,0+2

586+17 98+0,4

Данные, представленные в табл. 1 , показывают, что выход жизнеспособных клеток печени по предлагаемому способу увеличивается на 6% по сравнению с известным.

Сопряженность дыхания и фосфорилирования исследуют полярографичес- ки, определяя скорость эндогенного

дыхания (V-j, ), скорость эндогенного дыхания,- стимулированного разобщитеем 2, 4-динитрофенолом (V ДНФ), скорость окисления сукцината-субст- рата в норме не проникающего через

плазматическую мембрану (,)Результаты опытов по эффективности окислительного фосфорилирования получаемых клеток печени представле- ны в табл. 2. (Сопряжение окисления и фосфорилирования п 6).

Таблица 2

313

Данные, представленные в табл. 2 свидетельствуют, что полученные клетки характеризуются прочным сопряжением процессов дыхания и фосфорилиро- вания (отношение А,2, что в 2,2 раза выше, чем в известном способе). Косвенная оценка проницаемости плазматическор мембраны клеток по скорости окисления непроникаюшего субстрата сукцината свидетельствует о меньшей проницаемости плазматической мембраны по сравнению с известным способом (отношение V, /Vj, равно 1,8 по предлагаемому и ч,3 по извест ному способам).

П р и м е р 2. Способ осуществляют, как описано в примере 1. Время

Формула изобретения

Способ получения изолированных клеток печени путем извлечения органа, его перфузии, дезагрегации и отделения целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью

Редактор И.Сегляник

.Составитель М.Серова Техред М.Ходанич Корректор С.Шекмар

Заказ 1868/26Тираж 500 Подписное

ВНИИГТИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва,.Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

04264

дезагрегации 30 с и 90 с, а частота вибрации 70 Гц и 90 Гц.

Результаты исследований представлены в табл. 3-4. 5ТаблицаЗ

15

Таблица 4

повьппения выхода жизнеспособных клеток с повышенной степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования, дезагрегации подвергают предварительно измельченную печень, а дезагрегацию проводят с помощью вибрации с частотой 50-90. Гц в течение 30-90 с.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине. Целью изобретения является увеличение выхода жизнеспособных клеток печени с повышенной степенью сопряжения дыхания и фосфори- лирования. Предложенный способ получения изолированных клеток печени заключается в том, что извлекают печень декапитированного животного, после перфузии органа растворок енкса без кальция и глюкозы, затем печень разрезают на кусочки размером 1-3 мм и осуществляют дезагрегацию путем вибрации частотой 50-90 Гц в течение 30-90 с. Данный способ позволяет получить 98% жизнеспособных клеток печени (при общем количестве 58 млн. клеток на 1 г печени) с высокой степенью сопряжения дыхания и фосфорили- рования (отношение скорости эндогенного дыхания, стимулированного разобщителем 2,4-динитрофенолом, к скорости эндогенного дыхания составляет 4,2). 4 табл. (Л U ю у