Рекомбинантная плазмидная ДНК pTUR1-6 для идентификации межиндивидуального полиморфизма ДНК человека и способ ее получения Советский патент 1989 года по МПК C12N15/00 

10

20

о вариабильным reHONMbiM участкам еловека.

Рекомбинантная плазмидная ДНК TVRl-6 состоит из фрагмента генома еловека, вектора, реплицирующегося E.coli.

Плазмида отличается от известных геномным фрагментом ДНК человека, меющим три внутренних уникальных сайта рестрикции: EcoRI, HindiII, BamHIи ограниченного Pstl-сайтами с разных концов.

Плазмида pTVRl-6 состоит из следующих элементов: плазмидной ДНК вектора pBR 322 размером 4,36 т.п.о., Pstl-геномного фрагмента человека размером около 2,7 т.п.о., содержа- щего последовательно сцепленные сайты рестрикции: Pstl-EcoRI-Hindlll- BainHI-Pstl,

Молекулярный размер плазмиды pTVRl-6 равен 7,1 т.п,о.

Способ .клонирования и селекции рекомбинантной плазмиды имеет следую- 25 щие особенности,

Выделение геномных фрагментов ДНК человека осуществляют прямым клонированием их в плазмидный вектор без обычного принятого предварительного клонирования геномной ДНК в фаговых библиотеках.

Трансформацию полученных рекомби-. нантных плазмид во всех случаях осу- ществляют в гесА штаммах,

От&ирают рекомбинантные плазмиды,. ДНК, содержащие фрагменты ДНК низко- или умереннокопийные в геноме человека в два этапа: первый - отбор клонов, не дающих сигнгша при коло- ни-гибридизации с Р-меченой тотальной ДНК человека; второй - отбор из этих клонов методом (Iot -гибридиза- ции последовательностей ДНК, копий- ность которых не превышает 1000 на гаплоидный геном человека.

15

25 40

30

Регистрацию полиморфизма проводят гибридизацией отобранн 1х плазмид на Mspl-переварах ДНК от трех индивидов, представляющих популяции,, длительное время генетически изолированные друг от друга,

Рекомбинантные плазмиды, дающие межиндивидуальный Mspl-полиморфизм, используют для анализа полиморфизма ДНК, гидролизованной по различным рестриктаэам от 2-3 индивидов и: обычной смешанной популяции.

10

20

25

3760

Затем межиндивидуальный полиморфизм устанавливают на пробах ДНК от большого числа людей, гидролизо- ванных по сайтам рестрикции, для которых на стадии 5 выявляется наиболее выраженная межиндивидуальная вариабельность.

Клонирование геномных фрагментов непосредственно в плазмидные вектора и проведение трансформаций и размножения получаемых рекомбинантных плазмид в гесА штаммах E.coli позволяют добиться стабильного клонирования 15 высокополиморфных фрагментов ДНК. Повторяющиеся или высокополиморфные структуры ДНК нестабильны или вовсе не клонируемы в гесЛ штаммах E.coli, Отбор клонов, копийность которых : не превышает 1000 на гаплоидный геном, позволяет выделять рекомбинантные плазмиды. дающие картину гибридизации с рестрицированной ДНК человека в виде дискретных полос.

Гибридизация с переваров ДНК по Mspl-сайтам, имеющим в своем составе динуклеотид CG, повышенно мутабильный в геноме, и использование проб человека от генетически изолированных групп повышают вероятность идентификации межиндивидуального полиморфизма.

Пример 1, Плазмидную ДНК pBR 322 и ядерную ДНК человека под- 25 вергают гидролизу рестриктазой PstI, образовавшиеся фрагменты соединяют ДНК-лигазой, полученной смесью трансформируют клетки E.coli штамм НВ101 (гесА ) , Трансформанты высевают на 40 среду с Тс, Выросшие клоны пересевают параллельно на среду с Тс и среду с Ар, Отбирают клоны, растущие на Тс, но не растущие на Ар. Эти клоны содержат рекомбинантные плазмидные 4g ДНК. Несколько сотен клонов, содержащих рекомбинантные плазмидные ДНК, высевают на фильтры и колони гибриди- Зируют с Р-меченой тотальной ДНК человека.

Отбирают клоны, не дающие сигнала на радиоавтографе, т,е. не гибридизи- рукщиеся с высокоповторяющейся фракцией генома человека, Рекомбинантные плазмиды из нескольких отобранных eg таким образом клонов метят и

dot гибридизируют с пятнами ДНК на фильтрах: 5 мкг тотальной ДНК человека и разведениями pBR 322 от до 10 мкг. Клоны, копийность которых

30

50

не превышает 100 копий на геном, гибридизируют с Mspl-гидролизатом тотальной ДНК человека от трех индиви: дов. При гибридизации одного из клонов (pTVRl-6) обнаружено, что все три индивида отличаются,друг от друга по распределению рестриктных фрагментов.

фильтр переносят на бумагу с 3 мм, насыщенную буфером (0,36 М NaCl, 20 мМ NaH,jPO,pH 7,4 и 2 мМ ЭДТА, рН 7,4), и сушат при комнатной температуре колониями вверх. даК фиксируют на фильтре нагреванием под вакуумом в печи при в течение 30 мин.

Изобретение, относится к области генетической инженерии и генетики . человека и может быть использовано для определения высоких межиндивидуальных различий ДНК человека. Цель изобретения - создание рекомбинантной ДНК для определения межиндивидуального полиморфизма по вариабильным геномным участкам человека. Новые ре- комбинантные плазмиды ДНК pTVRl-6 состоят из фрагмента ДНК человека и Изобретение относится к области генетической инженерии и генетики человека и может быть использовано для определения высоких межиндивйду- альных различий ДНК человека с помощью полученных рекомбинантных плаз- мидных ДНК, что обеспечивает возможность его применения в медицинской, популяционной генетике и в криминалистике. . ДНК-полиморфизм активно используется при проведении генетического анализа человека: в пренатальной вектора PBR 322. Фрагмент геномной ДНК человека размером 2,7 .о содержит последовательно сцепленные сайты рестрикции: Pstl-EcoRI-Hind III- BamHI- Pstl. Рекомбинатная плаз- мида позволяет идентифицировать высокий межиндивидуальный полиморфизм проб ДНК человека. При зтом практически каждый индивид имеет специфическое распределение рестриктных фрагментов, гомологичных данной рекомбинантной плазмидной ДНК. В то же время распределение таких фрагментов идентично в ДНК из разных тканей одного и того же индивида. Т.аким образом, изобретение может быть использовано для идентификации высокой неж- индивидуальной вариабильности ДНК человека, которую можно эффективно проводить на любых клеточных тканях, содержащих ДНК от разных лкщей, с -.целью установления принадлежности ткани конкретному человеку. 2 с.п. ф-лы. .диагностике, картировании групп сцепления генетических локусов, непрямой локализации групп генов, ответственных за наследственные болезни изучении роли рекомбинаций в канцерогенезе. Наиболее перспективными в таком анализе считаются клонированные фрагменты ДНК, характеризующиеся межиндивидуагаьным полиморфизмом по длине фрагментов (ДД рф.) . Целью изобретения является создание рекомбинантных ДНК для определения межиндивидуального полиморфизма С О) 4 О) СО VI Oi

В дальнейшем анализируют ДОК 2-4 индивидов, гидролизованных по EcoRI BamHI, PstI, Sad, EcoSl, Bglll, Hindlll рестриктным сайтам. Наиболе выраженный полиморфизм выявлен при использовании Pstl-рестриктазы.

Оптимальные условия электрофорез при этом: длинная разгонка в 0,5%- ной агарозе для разрешения близко расположенных фрагментов (от 2,7 до 5 т.п.о.).

Исследование Pstl-гидролизатов ДНК 20 чело.век показывает, что все они отличаются друг от друга по длине и (или) копийности рестриктных фрагментов, гибридизирующихся с pTVRi-6. Подобная картина соблюдаетс и для pRTRl-6, содержащей тот же геномный фрагмент человека.

Пример 2. Рекомбинантная ппазмидная ДНК pTVRl-б.

Для проведения гибридизации бактериальных колоний E.coli клоны E.coli содержащие в векторе pBR 322 случай- .ные PstI рестриктные фрагменты ДНК .человека, растят на чашках с агаром в присутствии Тс. Колонии переносят одновременно на агар с Тс в контрольной чашке и на идентичные места на круглый нитроцеллюлозный фильтр диаметром 8,5 см, лежащий на поверхности агара с тетрациклином (Тс) во второй чашке. После подращивания колоний при 37°С 15 ч. контрольную чашку хранят при в перевернутом положении, а бактерии на нитроцеллюлозном фильтре лизируют. Для этого каждый фильтр помещают на поверхность бумаги 3 мм, пропитанной 10% SDS на 3 мин, затем на второй лист бумаги 3 мм, насьш1енный денатурирующим раствором (0,5 М NaOH, 1,5 MNaCl), на 5 мин. Далее фильтр переносят в нейтрализующий раствор (1,5 NaCl, 0,5 М трис-HCl, рН 8,0) на 5 мин. Обломки клеток с поверхности фильтра осторожно стирают ватой, смоченной в 5% SpS. Эта процедура необходима для снижения неспецифической фоновой гибридизации с колониями. Далее .

10Непосредственно перед гибридизацией фильтры с фиксированными ШК инку- ;бируют 5 ч при в предгибридиэа- ционном растворе, содержащем 50%-ный формамид, (0,75 М NaCl,

15 0,075 М цитрата натрия, рН 7,0),

50 мМ NaH-tPO, рН 6,5, 350 мМ 0,1% поливинилпироллидона, 100 мкг гепарина, 0,5% саркозил, 200 мкг/нп полиАднк.

20 Для проведения гибридизации фильтры вынимают из предгибридизационного раствора и помещают в чашки, содержащие на каждый фильтр по 1 мл гибри- дизационного раствора, имеющего тот 25 же с.остав, что и предгибридизационная смесь с добавлением лишь Р-меченой .тотальной ДНК человека.

Для получения меченой пробы в раствор, содержащий 0,5 мкг плацентар- 30 ной ДНК человека, 50 мМ трис-НС1, (рН 7), 7,5 мМ MgCl, 10 мМ ДТТ, добавляют даКазу I до концентрации 2 XIО - 10 мкг/мл, один из Р-дез- окситрифосфатов с удельной активнос- 35 тью НО TBg/ммоль (3000 Ки/ммоль), 20 нМ каждого из немеченых предшественников ДНК-дезокситрифосфатов и 5 е.а. ДНК-полимеразы I. Реакционную смесь, имеющую конечный объем 100 мкг 0.инкубируют 20 мин при комнатной температуре и 2 ч при 10°С. Удельная активность меченых препаратов составляет 6,8x10 имп/мин/мкг. На каждый фильтр суммарно наносится 4-10 имп/ 5 /мин меченого препарата ДНК.

Гибридизацию проводят при 42°С 14 ч. Затем фильтры отмывают в двух сменах bSSC, 0,5% ЗД5 при комнатной температуре, в двух сменах 0,5i SSC, 0 0,1% ЗД5 при в течение 2 ч. Г льтры высушивают и помещают на экспозицию с рентгеновской пленкой РМ-1 с усиливающими экранами. Время экспозиции составляет 2 сут. 5 После проявления пленку с сигналами гибридизации сравнивают с контрольной чашкой. Каждую из нескольких сотен колоний на чашке, соответствую щих клонам, которые не дают сигнала

10

15

20

25

ijia радиоавтографе, засевают в 5 мл 1в-бульона с тетрациклином (15 мкг/мл) а ночь при 37°С и вьщеляют плазмидп ую ДНК щелочным методом.

Далее оценивают размеры Pstl- Ь(;тавок ДНК человека, содержащихся в выделенных рекомбинантных плазмидах. Для этого 1 мкг плазмиды расщепляют Is ста:ндартных условиях.

Эндонуклеазой рестрикции PstI гидро- лизуют 1 мкг плазмидной ДНК в буфере, содержащем 10 мМ трис-НС 1, ЮмМ MgCl, 10 мМ 2-керкаптоэтанола. Инкубируют при 37°С 1 ч. Полученные фрагменты |делят электрофорезом в 0,7%-ной ага- озе и сравнивают с маркерными Pstl- фрагментами ДНК фага. Длина Pstl- ;зставки рекомбикантной плазмиды )TVRl-6, определенная таким образом, )авняется примерно 2,7 т,п.о. По 0,1 мкг каждой из рекомбинантных шазмид метят в тех же условиях, :1 оторые описаны для мечения тотальной дак человека в примере 2. Исключение состоит в том, что ДНК-ПОЛИмерр- :зу I вносят в реакционную смесь лишь через 30 мин после.добавления ДНК-азы IE , с целью предотвращения включения (в начале полимеразной реакции зо дезокситрифосфата в хромосомную ДНК и,coll, следовые количества которой всегда присутствуют в плазмидных препаратах ДНК, вьщеленных щелочным методом. 1о HMn/MHij меченой плазмидной ЩК используют для dot -гибридизации t дак в пятнах. Оценивают копий- jrtocTb клонированных фрагментов ДНК fe геноме человека и их эволюционную Консервативность,

i ВоС -фильтры готовят следующим Ьбразом.

В пробирки, содержащие по 5 мкг |геномной ДНК человека зеленой мар ..тышки, крысы, быка, а также плазмид- ной ДНК pBR 322 концентрацией , , 10-i, 10 , ICr мкг/мл ДНК, Добавляют 0,1 объема ЗМ NaOH. Инкубируют 1 ч при , Охлаждают до ,гО-25°С и добавляют юдин объем 2М NfH j(pH 7,0). Пробы полностью, но небольшими порциями, с подсушиванием раскапывают на нитроцеллкхпозные фильтры. Dot -гибридизацию с Р-ме- чеными рекомбинантныки пла.змидами проводят в условиях, описанных,для колони -.гибридизации (1фимер 2). , |0тмывку фильтров проводят в трех сменах 0,, 0,1% 5Д8 при 67 с.

1463760 8

Сравнивая интенсивность сигнала пятка ДНК человека с сигналами в разведениях pBR 322, оценивают процентное содержание клонированного фрагмента в ДНК человека и, в пересчете на длину ставки, его копийность в геноме. Одновременно по присутствию или отсутствию сигнала в ДНК животных определяют распространение клонированных фрагментов ДНК в различных . таксономических группах.

После проведенных этапов селекции pTVRl-6 выделяют как рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент с копийностью не. б олее 100 на гаплоидный геном (в расчете на полноразмерную копию 2,7 т,п.о.) и представленный у всех анализированных животных,

Рекомбинантные плазмиды, содержа- щие фрагменты, копийность которых не превьппает 100 на гаплоидный геном, гибридизируют с Mspl- гидролиз атами . лейкоцитарной ДНК от трех индивидов, относящихся к генетическим изолятам, Mspl-рестрикцию 10 мкг ДНК от каждого индивида проводят в стандартных условиях. Реакционная смесь содержит 10 мМ трис-HCl, .10 мМ MgCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 10 мкг ДНК, 3% ед. акт (е,а,) фермента. Инкубацию v осуществляют 10 ч при . Фракционируют ДНК электрофорезом в 0,7%-ном агарозном геле 14 ч при U 50 В, I 30 шА, Перенос ДНК на нитроцеллю- лозный или нейлоновый фильтр проводят по методу Саузерна,,

Условия мечения рекомбинантных плазмидных ДНК и гибридизацию проводят, как описано для dot -гибpидизa35

40

45

4- 50

55

ции в примере 1. На фильтр размерами 13 ч 5 см наносят 3 мл гибридизационной смеси с суммарной радиоактивной активностью 0,2 мкг плазмидной ДНК 8 «10 имп/мин. В этих условиях при гибридизации pTVRl-6 - зонда обнаруживают, что все три индивида отличаются друг от друга по распределению некоторых Mspl-рестрик- тных полос. Таким образом, с помощью pTVRl- б-плазмиды выявляют межиндивидуальный полиморфизм ДНК.

Пример 3, Высокий межиндивидуальный полиморфизм человека, выявляемый с помощью pTVRl-6-рекомбинант- ной плазмиды.

По 20 мкг плацентарной ДНК от 2-3 индивидов из смешанной популяции расщепляют EcoRI, Hindlll, BamHl,

Условия мечения рекомбинантных плазмидных ДНК и гибридизацию проводят, как описано для dot -гибpидизa

ции в примере 1. На фильтр размерами 13 ч 5 см наносят 3 мл гибридизационной смеси с суммарной радиоактивной активностью 0,2 мкг плазмидной ДНК 8 «10 имп/мин. В этих условиях при гибридизации pTVRl-6 - зонда обнаруживают, что все три индивида отличаются друг от друга по распределению некоторых Mspl-рестрик- тных полос. Таким образом, с помощью pTVRl- б-плазмиды выявляют межиндивидуальный полиморфизм ДНК.

Пример 3, Высокий межиндивидуальный полиморфизм человека, выявляемый с помощью pTVRl-6-рекомбинант- ной плазмиды.

По 20 мкг плацентарной ДНК от 2-3 индивидов из смешанной популяции расщепляют EcoRI, Hindlll, BamHl,

9

Pstl, Bggll, Mval, EcoSl, Sad - эн донуклеазами рестрикции в стандартн условиях, как описано в примере 1, варьируя в зависимости от использув МОго фермента лишь содержание NaCl от О до 50 или 100 мМ. Фрикциониров ние рестриктных фрагментов, их перенос на фильтры и гибридизацию проводят как описано для Mspl-гидролизо- ванных проб ДНК (пример 1), - Р- мечение pTVRl-6-штазмиды осуществляют с помощью ник-трансляции аналогично примеру 2. Анализ полученных радиоавтографов показывает, что про- бы любых гидролизатов ДНК от разных индивидов отличаются друг от друга по обшей картине распределения рестриктных фрагментов, гомологичных pTVRI-6 плазмидной ДНК. Наиболее от- четливо межиндивидуальные различия видны при сравнении Pstl-рестриктных фрагментов ДНК. Идентификацию этих фрагментов от 20 индивидов, гомологичных pTVRI -6- плазмидной ДНК прово- дят в условиях блот-гибридизации, как описано для рестриктных гидроли- затов ДНК в примерах 2 и 3. При этом фильтр размерами 20x20 см помещают 15 мл гибридизационного раствора,.

содержащего 0,3 мкг P-pTVRl-6-ДНК с активностью АПО имп/мин. В таки же условиях проводят гибридизацию VpTVRl-6 ДНК с Pstl-гидролизованны

ми пробами ДНК, выделенными из разных зв еловека. гомологичных этому фрагтканей от одного и того же индивида. Демонстрируют, что распределение Pstl-рестриктных фрагментов ДНК, гомологичных pTVR 1-6-зонду, различно у двух любых сравниваемь}х индивидов, 40 идентично в разных тканях от одного и того же индивида. Эти данные позволяют использовать pTVRl-6-ШIaзмид- ную ДНК в качестве зонда в кримина- -. листике для идентификации индивиду- 45 альной принадлежно сти проб клеточной ткани, а также в популяционном и медико-генетическом анализе человека.

Из примеров 1-3 следует, что выделена рекомбинантная ппазмида, позво- 50 ляюшая идентифицировать межиндивидуальный полиморфизм проб ДНК человека, гидролизуемых любой эндонуклеазой рестрикции. При этом каждый индивид - имеет специфическое распределение55

Pstl-рестриктных фрагментов, гомоломенту; уникальные сайты рестрикции: Pstl, EcoRI, Hindlll, BamHI,PstI; ген устойчивости к ампициллину Amp ; круг хозяев: Escherichia coli.

10

гичных данным рекомбинантной плазмидной ДНК. В то время как распределение таких фрагментов идентично в ДНК из разных тканей одного и того же индивида.

Таким образом, изобретение может быть использовано для идентификации высокой межиндивидуапьной вариабельности ДНК человека. Такую идентификацию можно эффективно проводить на любых и не обязательно одних.и тех же клеточных тканях, содержащих ДНК, от разных людей с целью установления принадлежности ткани конкретному .человеку.

Изобретение может найти применени в криминалистике, медицине, а также в популяционной генетике для определения возможного генетического родства и расстояния между исследуемыми группами людей.

Формула изобретения

менту; уникальные сайты рестрикции: Pstl, EcoRI, Hindlll, BamHI,PstI; , ген устойчивости к ампициллину Amp ; круг хозяев: Escherichia coli.

2. Способ получения рекомбинантной плазмидной дак pTVRl-6, заключающийся в том, что рестриктные фрагме.нты генома клонируют в плазмидный вектор pBR 322, трансформируют полученной рекомбинантной плазмидой гесА щтаммы E.coli, размножают, отбирают клоны, не дающие интенсивного сигнала с меченой тотальной ДНК человека, отби рают клоны, копийность которых не превышает 1000 копий на гаплоидный геном и которые гибридизируют с ДНК разных животных, затем отбирают плазмидную ДНК pTVRI-6, дающую межиндивидуальный полиморфизм при гибридизации с Mspl и Pstl-рестриктными переварами ДНК нескольких индивидов.