Способ определения активности холестеролэстеразы Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/44 G01N27/26 

со со ел

О5

Изобретение относится к электрохимическим методам анализа материалов путем измерения тока при электролизе с использованием ферментов, конкретно к способу определения активности холе сте рол э с те разы, и может быть использовано в промьшшенности для определения холестеролэстеразы, а также в диагностических целях в медици-

; не.

Цель изобретения - упрощение спо; соба.

i Способ предусматривает взаимодей- I ствие холестеролэстеразы с субстра- I том - холестериловым эфиром непредельной высшей кислоты в фосфатном буферном растворе в присутствии холе стёролоксидазы и определение активности по величине скорости измене- НИН измеряемого параметра, при взаимодействии холестеролэстеразы с субстратом проводят электролиз реакционной смеси в присутствии рабочего электрода,, покрытого трехслойной за- щитной мембраной, при +05,6 В отн. Ag/AgCl электрода сравнения, а активность холестеролэстеразы оцределя

ют по скорости увеличения анодного тока.

В качестве рабочего электрода используют плат 1новый электрод, в качестве буферного раствора - 0,05 М фосфатньй буфер, рН 7,0-9,0, в качестве субстрата - холестерололеат,

В интервале рН 7,0-9,0 раствора обеспечивается чувствительность измерений, а в более кисльос средах- уменьшается каталитическая активност холестеролоксидазы и уменьшается чувствительность способа..

Концентрация холестеролоксидазы составляет 0,33-0,5 ед/мл концентрация холестерололеата 5-10 мМ. Ниже указанных пределов концентраций наблюдается зависимость тока от концентраций холе.стеролоксидазы и холе- стерололеата, в то время как при определении ток ячейки должен полность отражать только активность холестеролэстеразы. Использовать более высокие концентрации экономически невыгодно и нецелесообразно.

Протекают следующие превращения:

Изобретение относится к электрохимическим -методам анализа с использованием Лерментов и может быть использовано в промьппленности при обнаружении холестеролэстеразы в средах ее выращивания, а также в диагностических целях в медицине. Цель изобре- тения - упрощение способа определения активности холестеролэстеразы. Способ заключается в том, что при взаимодействии холестеролэстеразы с субстратом осуществляется электролиз реакционной смеси в присутствии холе- стеролоксидазы, платинового электрода, покрытого трехслойной мембр иой, при 0,6 В отн. Ag/AgCl электрода сравнения, а определение активности проводится по скорости увеличения анодного тока в ячейке. Способ является пригодным для анализа окрашен- ; ных, непрозрачных сред микробиологи- ческой промышленности. 3 табл. с (Л

Холестерололеат + -------- :--- --- --- Холестерин + Олеиновая кислота

холестеролэстераза Холестерин -ь О, -225§ 12Р23° ИДНа Холестенон + ,

Электрохимическое окисление на Pt электроде при 0,6 В отн. Ag/AgCl;электрода сравнения генерирует анодный ток. Скорость увеличения анодного тока пропорцион ьна скорости образования перекиси водорода, которая пропорциональна скорости гидролиза холестерололеата, т.е. пропорциональна, активности холестеролэстеразы. Угол кинетической кривой отражает скорость гидролиза холестерололеата..Способ осуществляют следующим образом j , .

В измерительную ячейку, содержащую 1 мл буферного раствора, погружают электрод, вводят 0,02 мл холесте- рололеата, 0,02 мл холестеролоксидазы. Регистрируют стационарный ток в течение 0,5-1 мин, затем вводят 0„02 мл исследуемого раствора, содержащего холестеролэстеразу и регистрируют увеличение анодного тока в течение 3-4 мин, рассчитывают ферментативную активность , исходя из тан

генса угла наклона кинетической кривой увеличения тока в течение первых 3-4 мин. Из экспериментально полученной величины Д 1д „ , нА/мин и ответа электрода на стандартную концентрацию холестерина (40 мкМ) .в отсутствии холестерололеата и холестеролэстеразы вычисляют скорость ферментативной реакции (скорость образования холестерина в ячейке в мкмоль/мин)

и удельную активность холестеролэстеразы из трех параллельных измерений. Удельную активность препарата (Е/МГ) можно вычислить также из построенного калибровочного графика

(концентрация фермента - скорость ферментативной реакции). После измерения тока ячейка в течение 1,5 мин промывается буферным раствором, после чего можно проводить следующее измерение .

Пример 1, Определение зависимости величины тока от концентрации холестеролоксидазы.

Электролиз проводят в присутствии 0,2 Mi I холестерина в ячейке в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,2 и разных количеств холестеролоксидазы. ,

Полученные данные приведены в

табл. 1.

Данные показывают, что зависимость тока от концентрации холестеролоксидазы наблюдается до 0,33 ед/мл., JQ

Пример 2, Определение зависимости величины изменения тока от концентрации холестерололеата.

Электролиз проводят в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,5, в присутствии 5 ,5 ед/гет.холестеролоксидазы, О,14 ед/мл холестеролэстеразы и разных количеств холестерололеата.

Данйые приведены в табл. 2. Из табл. 2 видно, что минимальная 20 концентрация холестерололеата в ячейке должна быть 5 мМ.

Пример 3. Определение активности холестеролэстеразы.

Электролиз проводят, как в приме- 25 ре 2, в присутствии 7 м холестерололеата, 0,45 ед/мл холестеролоксидазы. Вводятся разные объемы раствора холе-- стеролзстеразы и записываются кинетические кривые изменения тока. о

Для вычисления скорости ферментативной реакции устанавливают величину, тока при использовании стандартного раствора холестерина (40 мкМ), которая была равна 33,3 нА. При введении в ячейку 10 мкл (20 мкг) исследуемого раствора холестеролэстеразы изменение тока составляет 5,2 нА/мин. Из этих данных вычисляют скорость ферментативной реакции: 40 мкМ - 33,3 нА, X - 5,2 нА/мин, х 6,24 мкМ/мин (в л), или, 6,24 мкмоль/мин в 1,0 мл -(в ячейке). Следовательно, 6,24 ед холестеролэстеразы было в 10 мкл рбраз- .с ца, а в 1 мл препарата было 0,624 ед. фермента. Поскольку исследуемый образец содержал 2 мг/мл белка, то удельая активность фермента, вычисленная з одного измерения, составляла CQ ,312 Е/мг. Аналогично вычислены и ругие активности.

Для удобства проведения расчетов ри непрерывном анализе большого коичества проб используют формулу

35

40

55

л / . а. Ь. А, ед/мл k -----,

где k - коэффициент,.равный концент- , рации холестерина, мкМ, кото,

JQ

5

20

25- о

.с CQ

35

40

5

,

рая способствует изменению тока в ячейке 1 нА; а - измеренное изменение тока,

нА/мин;

b - степень разбавления исследуемого образпгз., раз. Например, при введении в ячейку 10 мкл исследуемой холестеролэстеразы получают

40 мкМ , „ СОЛ/ 5,2.нА/мин;

b ОЬ раз;

. / 1,2«5,2. 100 .. ,, А, ед/мл 0,624.

При введении в ячейку 20 мкл получают: k 1,2; а 10,5 нА/мин; b 50 раз

л / 1,2-10,5-50 - ,- А, ед/мл

Аналогично рассчитаны и другие активности. Данные приведены в табл. 3.

I . .

Из табл. 3 видно, что наблюдается

строгая прямолинейность увеличения тока (л1) от активности холестеролэстеразы в ячейке. Вычисленные удельные активности препарата из любой точки близки (среднее 0,308 Е/мг белка) . Вычисленная удельная активность из построенного калибровочного графика (скорость реакции - количество холестеролэстеразы) составляет 0,305 Е/мг, т.е. практически совпадает. .

Предлагаемый способ является простым и экспрессным, так как отпадает необходимость приготовления радиоактивного субстрата или прозрачных образцов, применения пероксидазы и о- дианиз.идина. Метод основан на использовании простого оборудования и обеспечивает возможность автоматизации процесса. По сравнению с электрофотометрическим методом используется в 10 раз меньше исследуемого образца, а время одного анализа в 6 раз короче. Процесс определения можно проводить непрерывно, например при ходе вьщеления или очистки фермента..

Таким образом, упрощение способа заключается в сокращении времени определения до 4 мин, в возможности ав- то матизации процесса, в использовании более простого оборудования, в исключении дополнительного применения пероксидазы и о-дианизидина.

5

формула изобретения Способ определения активности хо лестеролэстеразы, предусматривающий приготовление реакционной смеси, содержащей фосфатньй буфер, раствор фермента и субстрат, инкубацию ее и последующую оценку результатов, о т- дичающийс.я тем, что, с це956776

лью упрощения способа, реакционную смесь помещают в электрохимическую ячейку и подвергают ее электролизу в с присутствии платинового электрода, покрытого трехслойной защитной мембраной, а холестеролэстеразиую активность оценивают по увеличению анодного тока .

Т а б л и ц а 1.