Способ определения антигенов или антител Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 G01N33/483 

1

Изобретение относится к медицине и сельскому хозяйству, а именно к иммунологии, и. может быть использовано при анализе иммунных препаратов на твердой поверхности.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

.На поверхности ПАВ-датчика,имеющего опорную и измерительную линии задержки, размещенные на одной подложке, путем адсорбции из раствора формируют мономолекулярный слой специфических антигенов или антител, затем на поверхность измерительной линии задержки наносят известное количество анализируемого раствора,ин- .кубируют датчик во влажной камере,

промывают, высушивают, после чего измеряют разность времен прохождения акустической волны в опорной и измерительной линиях задержки и по измеренной величине наносят количество исследуемого антитела или антигена по ранее построенной калибровочной кривой.

Для доказательства применимости предлагаемого способа необходимо показать, что приращения толщины молекулярных слоев за счет образования иммунных комплексов достаточно для изменения скорости поверхностной акустической волны, причем настолько, чтобы была возможность это изменение измерить.

Зависимость скорости распростране- ния волны от толщины слоя имеет вид

4ь

sj

00

to 1C

IV - V(h)J/V r 2ii Fh/Vs

(1)

где V, V(h) скорости поверхностной волны на свободной и покрытой слоем поверхности;

У - коэффициент, характеризующий дисперсионные свойства слоистой системы;F - рабочая частота ПАВдатчика.

Если использовать ПАВ-датчик в качестве частотозадающего элемента автогенератора, то при изменении скорости V относительное изменение частоты генератора F будет составлять

F - F(h) V - V(h)

F V

Следовательно, относительное изменение скорости может регистрироваться с тем же разрешением, с каким регистрируется относительное изменение частоты, т.е. на уровне .

Чувствительность к толщине, рассчитанная по формулам, для слоев с и пьезокварцевых датчиков У,Х-среза (V 3159 м/с) с частотами 10 и 100 МГц равна 20 и 2000 Гц/им соответственно. Отсюда следует, что ,минимально регистрируемые приращения толщины ЛЬ MWH составят 10 - м, что находится на уровне элип .сометрического метода, предложенного в прототипе.

Повысить чувствительность можно путем увеличения частоты ПАВ-датчи- ка. Современная технология обеспечивает возможность создания ПАВ-дат- чиков, частоты которых могут лежать в диапазоне до 1 ГГц.

Пример 1 . Определение количества инсулина в растворе.

Использовались ПАВ-датчики с двумя линиями задержки на пьезоквар- цевом кристалле Ґ,Х-среза, основная чистота 10 МГц.

Разведение всех компонентов реакции проводят на 0,01 М фосфатном буфере (ФБ) с рН 7,4.

Этап А. ПАВ-датчик вносят в раствор иммуноглобулинов с концентрацией 10 мкг/мл, выделенных из антиинсули- новой сыворотки морской свинки,инкубируют в течение ночи при+4°С,промывают датчик, не вынимая из раствора

0

5

0

5

0

100 мл ФБ содержащего 0,05% твина-20 (ТФБ), вынимают из раствора и обдувают его рабочую поверхность струей инертного, газа для удаления капель ТФБ.

Этап Б. На поверхность одной из линий задержки наносят 100 мкл анализируемого раствора, разведенного, в ТФБ.

Инкубируют во влажной камере при 37°С 2 ч. Затем поверхность датчика отмывают от несвязавшихся молекул инсулина 100 мл ФБ и 100 мл дистиллированной воды. Сушку датчика производят в среде, осушенной селикагелем до тех пор, пока измеряемая частота разностного сигнала в ошэрной и измерительной линиях задержки повторится не менее 10 раз подряд. Измерение проводят путем включения датчика в цепь обратной связи усилителя,возбуждающегося на частоте, определяемой временем задержки ПАВ-датчика.

В таблице представлены результаты проведенного анализа (приведенные значения являются средними по результатам двух измерений).

Один датчик можно использовать для проведения двух анализов, не пов- торяя этап А, для чего аликвоту анализируемого раствора наносят на поверхность опорной линии задержки, а измерительную используют в качестве опорной. Затем необходимо поверхность датчика очистить от продуктов реакции. Очистку производят путем выдерживания датчика в 10%-ном водном растворе тринатрийфосфата в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим промыванием в дистиллированной воде.

Пример 2. Определение количества антител в сыворотке.

Использовались ПАВ-датчики Y,X- среза, с частотой 10 МГц и классы IgG, IgM, IgA, выпускаемые ИЭМ им. П.Ф. Гамалея АМН СССР.

Этап А. Для адсорбции антигена на поверхность датчиков готовят раствор чистых IgG в ФБ с концентрацией 10 мкг/мл. ПАВ-датчики вносят в приготовленный раствор и инкубируют в течение ночи при + 4°С. Промывают датчики, не вынимая из раствора, 100 мл ТФБ, затем вынимают датчики из раствора и обдувают рабочую поверхность очищенной струей инертного газа.

Этап Б. На поверхность измерительных линий задержки наносят по 100 мкл исследуемого раствора сыворотки различных разведений. Разведения сывороток готовят в ТФБ. Инкубируют сыворотки с адсорбированным иммуноглобулином 1 ч при 37°С. Для исключения влияния качества промывки на результат измерения, и контроля специфичности реакции на опорные линии задержки налосят по 100 мкл контрольного раствора сыворотки без анализируемых антит ел. После инкубации поверхность датчика отмывают от несвязавшихся антител 100 мл ФБ и дистиллированной воды. Сушку и измерение проводят по примеру 1.

Уровень антител в исследуемых сыворотках оценивают по калибровочному графику зависимости частоты разностного сигнала от разведения контрольных сывороток.

Таким образом, из приведенных примеров следует, что чувствительность предлагаемого способа при использований ПАВ-датчиков с частотой 10 МГц и точности регистрации частоты 1 Гц составила 0,5 мкг/мл, что не хуже,

0

5

0

-.

5

0

5

чем в прототипе. Однако, как следует из описания изобретения, повышение чувствительности не менее, чем на 2 порядка, представляет собой чисто техническую задачу, связанную с повышением рабочей частоты ПАВ-датчика до 1 ГГц.

Кроме того, предварительная подготовка датчиков по этапу А, например использование готовых иммунологических наборов, позволяет значительно сократить время анализа. Если сравнить время этапа Б, затраченное на исследование восьми растворов в двух повторностях для прототипа и предлагаемого способа, то окажется, что для прототипа требуется на 5 ч больше. Поэтому технико-экономические преимущества изобретения по сравнению с прототипом являются очевидными. Формула изобретения

Способ определения антигенов или антител путем иммобилизации на твердой поверхности датчика антител или антигенов с последующим нанесением исследуемого раствора, инкубацией, промыванием, высушиванием, измерением акустических характеристик и определением количества антигенов или антител по калибровочной кривей,о т- личающийся тем, что, с целью повышения точности способа, исследуемый и контрольный растворы наносят соответственно на поверхность датчика в области измерительной и опорной линий задержки акустических волн, а измерение акустических характеристик осуществляют по разности времени прохождения акустической волны в опорной и измерительной линиях задержки.

Изобретение относится к области медицины и сельского хозяйства, а именно к иммунологии, и может быть использовано при анализе иммунных препаратов на твердой поверхности. Целью изобретения является повышение точности способа. Поставленная цель достигается тем, что на поверхности датчика, имеющего опорную и измерительную линии задержки на поверхностных акустических волнах, формируют монослой специфических антигенов или антител, на поверхность измерительной линии наносят известное количество анализируемого раствора, инкубируют во влажной камере, промывают, высушивают, и измеряют разность времен прохождения акустической волны в опорной и измерительной линиях задержки и по калибровочной кривой находят количество специфических антител или антигенов. 1 табл.