Способ получения челночного вектора Советский патент 1988 года по МПК C12N15/00 

со со со

Изобретение относится к биотехнологии, к генетической инженерии, и касается челночного вектора, который содержит фрагмент ДНК и фрагмент ДНК Escherichia coli и может воспроизводиться как в E.coli, так и в дрожжах. Цель изобретения - создание высококо- пийного вектора. Для этого фрагмент Есо RI размером 8 кв, содержащий полипептидный РбО ген, молекулярной массой 60000 дальтон вводится в точку Есо RI плазмиды pBR 322 E.coli, в результате чего образуется плазмида, которая служит в качестве исходного продукта для дальнейшего конструирования вектора рАТ 77. о

см

Изобретение относится к биогехнп- логии, а именно к генетической инженерии, и касается челночного вектора, который содержит дрожжевой фрагмент ДНК и фрагмент ДНК Escherichia coli - промотор кислой фосфатазь и может воспроизводиться как в E.coli, так и в дрожжах.

Целью изобретения является созда- ние высококопийного вектора.

Для этого фрагмент Есо RI размером 8 КБ, содержащий полипептидкый РбО ген, молекулярной массой 60 000 даль- тон вводится в точку Есо RI плазмиды pBR 322 E.coli, в результате чего образуется плазмида, .которая служит в качестве исходного продукта для дальнейшего конструирования вектора .рАТ 77. .

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Фрагмент Есо RI размером 8 кв, содержащий полипептидный ген РбО молекулярной массой 60000 дальтон, получают из банка генов S288 С, клонируют в Есо RI сайт плазмиды pBR 322 E.coli.

Эту плазмиду переваривают с эндо- нуклеазой Sal I и сшивают ДНК-лигазой Т , образуя плазмиду рАТ 25, в которой удален из точки Sal I в фрагмент ген кислой фосфатазы 5,2 кв. Полученная плазмида рАТ 25 состоит из фраг- мента плазмиды pBR 322 (примерно ;3., 7 КБ) от точки Есо RI до точки .;Sal I, который содержит ген стойкости к ампициллину, и фрагмента (примерно 2,8 кв) от точки Есо RI до точки Sal I, содержащего дрожжевой, ген кислой фосфатазы.

В точку Есо RI указанной плазмиды рАТ 25 вводят фрагмент Есо RI (1,4кв) содержащий ген ars I.-trp I, который выделяют из плазмиды YR 7 посредством Есо RI, Б результате получают плазмиду рАТ 26. Указанный фрагмент ars I- trp I имеет одну точку распознавания ограничительного фермента Hind III в гене trp I.

В точку Hind III указанной плазмиды рАТ 26 вводят Hind III фрагмент, содержащий Leu 2 и 2 ori, который получают путем обработки плазмиды pSLE I посредством Hind III эндонук- леазы, в результате .получают челночный вектор рАТ 77. Этот челночный вектор в штамма Saccharomyces cerevi- siae АН 22 был сдан на хранение в Научно-Исследовательский Институт Ферментации, Агентство по промьпиленным исследованиям и технологии, Япония, Budapest Treaty и ему присвоено официальное название FERM ВР-324.

Полученный таким образом рАТ 77 (1 мкг) расщепляют Sal I эндонуклеазой и затем обрабатывают экзонуклеазой BAL 31 (0,1 и) в растворе (50 мкл) 20 мМ Трис-НС1 (рП 8,2), 12 мМ, СаСЦ 12 мМ MgCl;, 12 М NaCl и 1 мМ ЕДТА (этилендиамиптетрауксусная кислота) в течение от 30 с до 1 мин. Реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и осаждению. Полученные осажденные продукты обрабатывают эндонуклеазой Xho I (lum) и ДНК-лигазой Т. В течение 12 ч E.coli х 1776 обрабатывают указанной реакционной смесью таким образом, что происходит трансформация E.coli X 1776 и образуются стойкие к ампициллину трансформанты. Из колоний трансформантов получают плазмиды ДНК. Определяют нуклеотидную последовательность полученных ДНК, и зону гена кислой фосфатазы, удаляе- мую при обработке BAL 31. Наряду с указанным ДНК отбирают и выделяют плазмиды рАМ 81, рАМ 82, рАМ 83 и рАМ 84, которые полностью лишены структурного гена фосфатазы.

Обозначая А в кодоне АТС, кодирующем первую аминокислот.у (метиоНин) продукта РбО структурного гена фосфатазы как +1, отмечают, что в челночных векторах удалены следующие зоны: вектор. рАМ 8V до +2; вектор рАМ 82 до -33; вектор рАМ 83 до-50; и вектор рАМ 84 до-51. Векторы рАМ 81, рАм 82, рАМ 83 и рАМ 84 в Saccharomyces cerevisiae АН 22/рАМ81 АН 22/рАм 82, АН 22/рАМ 83, и АН 22/ /рАМ 84 соответственно были сданы на хранение в Научно-Исследовательский Институт Ферментации, Агентство по промьш1ленным исследованиям и технологии, Япония, Budapest Treaty, и им присвоены официальные названия, соответственно FERM ВР-325, FERM ВР- 313, FERM ВР-327 и FERM ВР-326.

П р и м е р 2. Получают кровяную плазму, собранную от десяти-пациентов (в количестве 700 мл), которые имеют положительную реакцию на HBsAg (небольшое отклонение от типа adr) и на HBeAg, и эту плазму центрифугируют при скорости вращения центрифуги 5000 об/мин в течение 20 мин с целью

удаления нерастворенных веществ. Полученный раствор центрифугируют при температуре , при скорости вращения центрифуги 18 000 об/мин в течение 8 ч, и образующиеся осажденные продукты снова растворяют в 10 мл буферного раствора (рН 7,5) 10 мМ, Трис-НС1, 0,1 М NaCl и 1 М ЕДТА. Этот раствор вводят в верхнюю часть пробирки центрифуги, содержащей 30% сахарозы, и центрифугирование осуществляют при при скорости вращения центрифуги 39 000 об/мин в течение 4 ч. Полученные осажденные продукты повторно растворяют в таком же буфер- ном растворе, что указан выше.

Для того, чтобы облегчить описанную операцию, буферный раствор хими- чески взаимодействует с HBY ДНК поли- меразой при обработке его в смеси (500 мкл) 67 мМ. Трис-НСГ(рН 7,5), 80 мМ Ш,С1, 25 мм KgCl,, 0,5% NP40 (тергитол, выпускаемый фирмой Сигма Ко), 0,1% 2-меркаптозтанола, 330 мкл dCTP (дезоксицитидинтрифосфат), dGTP (дезоксигуанозинтрифосфат) и dATP (деоксиаденозинтрифосфат),0,5 мкм

. d - f32 j dTTP (дезокситимидинтрифосфат) при температуре в течение 3ч, ив эту реакционную смесь вводят такой же объем 100 мМ раствора ЕДТА. В результате одноцепочечная ДНК удва. ивается до двуцепочечной ДНК, образуя меченый С32р1 продукт. Этот продукт вводят в пробирку центрифуги (свер- ху), в которой находятся слои 30, 20 и 10%-ного водных растворов сахарозы в указанном порядке, и осуществляют центрифугирование при температуре 4°С при скорости вращения центрифуги 39 000 об/мин в течение 4,5 ч.

Для разрушения белков, прочно связанных с ДНК, полученные осамсденные продукты обрабатывают в смеси (200 мкл) 1 мг/мл проназы Е (изготавливается фирмой Kakeu Kadaku К.К) и 0,2%-ным водным раствором натрийлаурилсульфата при температуре 31°С в течение 2 ч. Полученную смесь дважды экстрагируют фенолом (200 мкл) и образующийся содержащий ДНК экстракт промывают простым эфиром с целью удаления феноль- ного растворителя, в результате чего получают раствор HBV ДНК. Образующаяся таким путем ДНК имеет удельную радиоактивность 2,5 х 10 отсч. (мин)

c

0 5

п

0

5

0

5

мкг и может использоваться для вываривания ограничительными ферментами..

Двухцепочечную кольцевую HBV ДНК, полученную как описано выше, клонируют с использованием ДНК Д-фага Шарон 16А в качестве вектора, и затем снова клонируют с использованием известной плазмиды рА СУС 177 в качестве вектора следующим образом.

HBV ДНК (20 нг) обрабатывают эндо- нуклеазой Xho I в смеси (20 мкл) 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 7 мМ MgCli, 100 М NaCl и 7 мМ 2-меркаптоэтанола при температуре 37 С в течение 2 ч. Полученную смесь экстрагируют фенолом (20 мкл) и затем простым эфиром и к водному слою добавляют двойной обьем охлажденного этанола с целью осаждения ДНК. Смесь выдерживают при температуре в течение 1 ч и затем . центрифугируют при скорости вращения центрифуги 10 000 об/мин в течение 5 мин и осажденную ДНК извлекают. Отделенные таким образом осажденные продукты растворяют в смеси (5 мкл) 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), и 1 мМ ЕДТА HBV ДНК с равномолярным количеством ДНК А-фага Шарон 16 А, полученным путем расщепления эндонуклеазой Xho 1 и с ДНК-лигазой 14 смесь 50 мм Трис- НС1 (рН 7,4), 10 М MgClt, 10 мМ ди- тиотреитола, 100 мкг/мл альбумина телячей сыворотки, 0,5 мМ АТР и 0,5 мкл ферментного препарата лигазы Т, полученного фирмой Такага bio- raedicals I - 5хШ ед/мл 7 при температуре в течение 18 ч. Реакционную смесь экстрагируют фенолом и простым эфиром и затем подвергают осаждению этанолом таким же образом, как описано вьщ1е.

Полученные таким образом осажденные продукты растворяют в смеси (10 мкл) 10 мМ Трис-НС (рН 7,4) и 1 мМ ЭДТА.

Обработанную таким образом ДНК подвергают операции упаковки с образованием Л-фага и затем из него образуют колонии (10) на чашках (23х х23 см) с L-arapoM с использованием E.coli ДР50 SupF в качестве индикатора. Эти колонии подвергают гибридизации с использованием меченой 32р HBV ДНК с тем, чтобы отобрать образующиеся колонии из фага, имеющего HBV ДНК, в результате чего отделяют множество желаемых фагов.

Из фага, включающего HBV ДНК, полученного как указано выше в разделе, приготавляют фаговую ДНК с использованием Е. coli ДР 50 - Sup F в качестве заражаемых бактерий. Полученную таким образом ДНК переваривают Xho I в тех же условиях, что описаны выше, в течение 2 ч, и полученную реакционную смесь подвергают электрофорезу с 0,75%-ным агарозным гелем, в результате чего извлекают HBV ДНК (3,2кв). HBV ДНК адсорбируют на ДЕАЕ (дизтил- аминоэтилцеллюлоза) бумаге (изготавливаемой фирмой Тоуо Roshi, Япония) с целью отделения ее от вектора ДНК и затем элюируют 1 М водным раствором, в результате чего получают HBV ДНК, имеющую с обоих концов группы Xho I,

Плазмиду рАСУС 177 с единственным сайтом Xho I в пределах гена стойкости к канамицину переваривают Xho I, и полученный продукт очищают путем экстракции фенолом и обработки прос- тым эфиром и осаждают этанолом.

Полученную таким образом ДНК рАСУС 177, расщепляют Xho I и смеши вают с HBV ДНК с концом Xho I, в мо- лярном отношении 1. 5, и смесь сшиваю

,ДНК-лигазой Т в течение 18 ч.

ДНК (10 мкл), полученную как опи- |Сано выше, вводят в жидкость, содер- ;жащую E.coli (0,1 мл), которую приго- :тавливают путем обработки бульона выращивания E.coli к 1776, смесь тщательно перемешивают и выдерживают при О ,С в течение 25 мин. Эту смесь нано- сят на чашку с L-агаром, содержащим ампициллин (20 мкг/мл), о -биотин

(1 мкг/мл), диаминопимелиновую кисло- ту (100 мкг/мл) и тимин (20 мкг/мл) и термостатируют в течение ночи. По- лученные колонии наносят на чашку с агаром, содержащую канамицин (20 мкг/мл), и отбирЗ .ют колонии, которые лишь на чашке с агаром, содержащей ампициллин рАСУС 177 содержит стойкий к ампициллину ген и стойкий к канамицину ген, но ког;да вводится HBV ДНК в сайт гена Xho I стойкости к канамицину, то он теряет стойкость к канамицину. В связи с этим отобранные колонии включают соответственно рекомбинантную ДНК. Из отобранных таким путем колоний приготавливают гшазмиду.

5

Q

Q

е;

0

Полученную плазмиду, т.е. рекомби- натную pACyC177-HBV (которую обозначают pHBV) обрабатывают Xho 1 при тех же условиях, что описаны выше, в результате чего получают общий фрагмент HBV ДНК (3,2 кв). Кроме того, когда эту плазмиду обрабатывают Xho I и Ват Н,, то получают фрагмент (примерно 1,3 кв), содержащий ген HBs Ag.

HBV ДНК, полученную путем обработки плазмиды pHBV (рАСУС 177-HBV ДНК) посредством Xho I, рекомбинируют с расщепленным Xho I челночным вектором, рАМ 82, в молярном отношении 5:1 путем термообработки с ДНК-лигазой Т-} при тех же условиях, что описаны выше.

E.coli X 1776 трансформируют данной реакционной смесью и плазмидную ДНК выделяют из стойких к ампициллину трансформантов таким же образом,- как описано выше. Полученные таким путем ДНК анализируют различными ограничительными ферментами, такими как Xho I и Hind III, и в результате определяют ввод HBV ДНК в векторы,и их направление .

Полученные плазмиды, выражающие ген HBs Ag, включают ген HBs и ген НВс, идущие от гена кислой фосфотазы.

Фрагмент гена HBs Ag (3 мкг), полученный путем расщепления плазмиды pHBV посредством Ват Hi, обрабатывают ДНК полимеразой Т (0,2 U) в растворе (100 мкл) 67 мМ Трис-НС1 (рН 8,6), 6,7 мМ MgCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 6,7 мМ ЕДТА и 16,7 мМ (NH4)2S04, который содержит 200 мМ с/АТР, at СТР, о/ ТТР и C/GTP, в течение 30 мин с тем, чтобы заполнить расщепленный Ват HI конец. Реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и осаждению этанолом. Полученные осажденные продукты подверган т реакции связывания со связующим звеном Xho I в молярном отношении 1:10 с ДНК-лигазой Т в тех же условиях, что описаны выше. После экстракции фенолом и осаждения этанолом полученную плазмиду обрабатывают Xho I, в результате чего получают фрагмент гена HBs Ag (примерно 1,3 KB), имеющий по обоим концам Xho I. Полученный фрагмент сшивают с челночным вектором рАМ 82, который расщепляют посредством Xho в молярном отношении 5:1 с использованием ДНК-лигазы Т, и E.coli х X 1776 трансформируют полученной реакционной смесью.

Исходные дрожжи представляют собой Saccharomyces cerevisiae АН22 (а. Leu 2, his 4, canl ), которые были сданы на хранение в Научно-Исследова-, тельский Институт Ферментации, Агентство промышленных, исследований и нологии, Япония, Budapest treaty, где им присвоено официальное название FERM ВР-312. Эти исходные дрожжи инокулируют в среде УРД (100 мл), содержащей 2% полипептона, 1% дрожжево- го экстракта и 2% глюкозы и смесь термостатируют при температуре 30 С в течение ночи и после этого клетки извлекают пУтем центрифугирования. Извлеченные клетки промывают стерили- 20 зованной водой (20 мл) и суспензируют в растворе (5 мл) 1,2 м сорбита и 100 мкг/мл зимолиазы - 60 000 (поставляется фирмой Seikagaku -Kagyo К.К., Япония), и суспензию выстаивают 25 при 30°С в течение 30 мин и в результате получают сферопласт. Приготовленный таким образом сферопласт промывают 1,2 М раствором сорбита три раза и затем суспендируют в растворе (0,6 мл) 2 М сорбита, 10 мМ CaCl7 и 10 мК Трис-НС1 (рН 7,5). Полученную суспензию разделяют на небольшие пробирки объемом 60 мкл. К суспензии добавляют раствор рекомбинантной плазмиды рАН 203 (30 мкл). После тщательного перемешивания к нему добавляют 0,1 М CaCli (3 мкл) до конечной концентрации СаС Ю мМ и смесь отстаивают при комнатной температуре в течение 5-10 мин. В каждую полученную смесь вводят 1 мл раствора 20%-ного полиэтиленгликоля 4000, 10 мМ CaClj и 10 мМ Трис-НС1 (рН

30

40

ра 2, и оставляют на этом -слое. Чашк термостатируют при температуре 30°С, в результате чего получают Колонию не требующих лейцин дрожжей. Эту колонию термостатируют в минимальной питательной среде Burkholder с добав лением гистидина (20 мкг/мл), в результате чего получают трансформированные дрожжи: Saccharomyces cerevisiae рАН 203.

Каждую колонию трансформированных дрожжей наносят на чашку с агаром с содержанием минимальной питательной среды Burkholder, с введенным гисти- дином (20 мкг/мл) и термостатируют при температуре ЗО С, в результате чего образуется колония. Полученные клетки отделяют от данной колонии, инокулируют в минимальной питательно среде Burkholder, в которую введен гистидин (20 мкг/мл),и термостатирую при температуре 30°С. По прошествии примерно 24 ч клетки в фазе логарифмического роста извлекают путем центрифугирования, суспендируют в ми нимальной питательной среде (10 мл), не содержащей фосфорную кислоту, .ко торую приготавливают путем замены КН2Р04 в минимальной питательной среде Burkholder хлористым калием, с последующим вводом гистидина в количестве (20 мкг/мл) с концентра цией клеток примерно 4x10 клеток/мл После термостатирования при температуре в течение примерно 24 ч пи тательный бульон культуры центрифугируют при скорости вращения центрифуги 4000 об/мин в течение 10 мин, собирая указанные клетки. Отделенные таким образом клетки суспендируют в растворе (3 мл) 1,2 М сорбита, 30 мМ буферного раствора фосфата (рН 7,2), 14 мМ 2-меркаптоэ танола и 100 мкг/мл

7,5) и смесь отстаивают при комнатной .с зимолиазы 60000 (поставляется фирмой

50

температуре в течение 20 мин. Полученную смесь (каждую по 0,2 мл) вводят в среду (10 мл), содержащую, %: сорбита 22, глюкоза 2, аминокислота 0,7 на основе дрожжевого азота, УРД 2, 20 мкг/мл гистидина и агара 3, который поддерживается при температуре 45°С. После осторожного перемешивания смесь наносят на слой с минимальной питательной средой, содержащей 1,2 М сорбита, которая была получена пред- варительно и содержит, %: аминокислоты 0,7 на основе дрожжевого азота, глюкозы 2, 20 мкг/мл гистидина и атаSeikagaku Kagyo К.К., Япония), и смесь осторожно взбалтывают при тем- пературе в течение 30 мин, в результате чего получается сферопласт.

Этот сферопласт извлекают путем центрифугирования и тщательно суспендируют в растворе (1 мл) 0,1%-ного тритона Х-100 и 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), интенсивно перемешивают и затем центрифугируют при скорости вращения центрифуги 7000 об/мин в течение 10 мин и полученный поверх5

0

0

ра 2, и оставляют на этом -слое. Чашку термостатируют при температуре 30°С, в результате чего получают Колонию не требующих лейцин дрожжей. Эту колонию термостатируют в минимальной питательной среде Burkholder с добавлением гистидина (20 мкг/мл), в результате чего получают трансформированные дрожжи: Saccharomyces cerevisiae рАН 203.

Каждую колонию трансформированных дрожжей наносят на чашку с агаром с содержанием минимальной питательной среды Burkholder, с введенным гисти- дином (20 мкг/мл) и термостатируют при температуре ЗО С, в результате чего образуется колония. Полученные клетки отделяют от данной колонии, инокулируют в минимальной питательной среде Burkholder, в которую введен гистидин (20 мкг/мл),и термостатируют при температуре 30°С. По прошествии примерно 24 ч клетки в фазе логарифмического роста извлекают путем центрифугирования, суспендируют в минимальной питательной среде (10 мл), не содержащей фосфорную кислоту, .которую приготавливают путем замены КН2Р04 в минимальной питательной среде Burkholder хлористым калием, с последующим вводом гистидина в количестве (20 мкг/мл) с концентрацией клеток примерно 4x10 клеток/мл. После термостатирования при температуре в течение примерно 24 ч питательный бульон культуры центрифугируют при скорости вращения центрифуги 4000 об/мин в течение 10 мин, собирая указанные клетки. Отделенные таким образом клетки суспендируют в растворе (3 мл) 1,2 М сорбита, 30 мМ буферного раствора фосфата (рН 7,2), 14 мМ 2-меркаптоэ танола и 100 мкг/мл

0

Seikagaku Kagyo К.К., Япония), и смесь осторожно взбалтывают при тем- пературе в течение 30 мин, в результате чего получается сферопласт.

Этот сферопласт извлекают путем центрифугирования и тщательно суспендируют в растворе (1 мл) 0,1%-ного тритона Х-100 и 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), интенсивно перемешивают и затем центрифугируют при скорости вращения центрифуги 7000 об/мин в течение 10 мин и полученный поверх Иостный слой извлекают как лиэировар Ный дрожжевой раствор,

Этот лизированный раствор,подвергают испытанию с HBs антигеном F.IA kit (полученным Abbott; США) на активность к антигену HBs. Результаты не--. г|ытаний представлены в та6л.1.

Таблица 1

S.Cerevisiae рАН 203 13 008

АН2 2 (FERMBP312)

рА 101. рАМ 82

1 200

320

Данный вектор не имеет гена HBV

или HBs и используется как негатив) НЫЙ эталон.

((Негативный контроль RIA kit имеет активность 310 отсч./мин и его позитивный контроль имеет активность 17 500 отсч./мин)о30

Фрагмент rerta HBcAg приготавливают следующим образом.

Плазмиду pHBV (3 мкг) переваривают 1C ограничительной эндонуклеазой Rsa I ;обычным образом. Реакционную смесь 5 подвергают экстракции фенолом и осаждению этанолом. Полученные осажденные продукты подвергают реакции связыва25

Исходные дрожжи представляют собой Saccharomyces cerevisiae АН 22 (а Leu 2 his 4 canl , которые были сданы на хранение в Научно-Исследовательс- кий институт Ферментации, Агентство по промышленным исследованиям и технологии, Япония, Budapest treaty, где им присвоено официальное название РЕЮЧ ВР-312. Исходные дрожжи инокулируют в среде УРД (100 мл), содержащей, %: полипептид 2, дрожжевой экстракт 1 и глюкоза 2,и смесь термостатируют при температуре в течение ночи, а после этого клетки извлекают путем центрифугирования. Собранные таким образом клетки промывают стерилизованной водой (20 мл), суспендируют в растворе (5 мл) 1,2 М, сорбита и 100 мкг/мл зимолиазы - 60 000 (поставляемой фирмой Seikagaku Kogyo К.К., Япония) и суспензию.выстаивают при 30 С в течение 30 , в результате чего получают сферо- 25 пласт. Полученный таким путем сферо- пласт промывают 1,2 М раствором сорбита три раза, а затем суспендируют в растворе (0,6 мл) 2 М сорбита, 10 мМ CaCli и 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,5). Эту суспензию распределяют по небольшим пробиркам объемом по 60 мл. К суспензии добавляют раствор реком- бинантной плазмиды 301 (30 мкл). После тщательного перемешивания к раствору добавляют 0,1 М CaCli (3 мкл) до конечной концентрации СаС, равной 10 мМ, и смесь выстаивают при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин. В полученную смесь добавляют

НИН -с линером Xho I в молярном отношении 1:10 ДНК-лигазой Т,. После эк- 40 1 : J21LL 1 1 лппп ° п S стракции фенолом и осаяудения этанолом полученные осадки подвергают переваго полиэтиленг ликоля 4000, 10 мМ CaCl и 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), и

эту смесь выстаивают при комнатной температуре в течение примерно 20 мин.

риванию Xho I, в результате чего образуется фрагмент гена ИБс (примерно 0,7 KB), по обоим концам которого имеется концевое расщепление Xho I.

Полученный таким образом фрагмент переваривают с челночным вектором рАМ 82,, который расщепляется посредством Xho I в молекулярном отношении 5:1 с использованием ДНК-лигазы Т. Данную реакционную смесь используют для трансформации E.coli, в результате чего получается плазмидная ДНК. В полученную плазмиду вводят ген НВсА ниже фосфатазного стимулятора вектора рАМ 82 и эту плазмиду обозначают рНС 301.

0

5

Исходные дрожжи представляют собой Saccharomyces cerevisiae АН 22 (а Leu 2 his 4 canl , которые были сданы на хранение в Научно-Исследовательс- кий институт Ферментации, Агентство по промышленным исследованиям и технологии, Япония, Budapest treaty, где им присвоено официальное название РЕЮЧ ВР-312. Исходные дрожжи инокулируют в среде УРД (100 мл), содержащей, %: полипептид 2, дрожжевой экстракт 1 и глюкоза 2,и смесь термостатируют при температуре в течение ночи, а после этого клетки извлекают путем центрифугирования. Собранные таким образом клетки промывают стерилизованной водой (20 мл), суспендируют в растворе (5 мл) 1,2 М, сорбита и 100 мкг/мл зимолиазы - 60 000 (поставляемой фирмой Seikagaku Kogyo К.К., Япония) и суспензию.выстаивают при 30 С в течение 30 , в результате чего получают сферо- 5 пласт. Полученный таким путем сферо- пласт промывают 1,2 М раствором сорбита три раза, а затем суспендируют в растворе (0,6 мл) 2 М сорбита, 10 мМ CaCli и 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,5). Эту суспензию распределяют по небольшим пробиркам объемом по 60 мл. К суспензии добавляют раствор реком- бинантной плазмиды 301 (30 мкл). После тщательного перемешивания к раствору добавляют 0,1 М CaCli (3 мкл) до конечной концентрации СаС, равной 10 мМ, и смесь выстаивают при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин. В полученную смесь добавляют

1 : J21LL 1 1 лппп ° п S

го полиэтиленг ликоля 4000, 10 мМ CaCl и 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), и

1 : J21LL 1 1 лппп ° п S

эту смесь выстаивают при комнатной температуре в течение примерно 20 мин.

Полученную смесь (каждая по 0,2 мл) добавляют к среде (10 мл), состоящей из 22% сорбита, 2% глюкозы, 0,7% ами-. нокислоты на основе дрожжевого азота 2% УРД, 20 мкг/мл гистидина и 3% агара, которая поддерживается при постоянной температуре 45 С. После слабого перемешивания смесь вводят в слой на чашке с минимальной питательной средой, содержащей 1,2 м сорбита, которая была предварительно приготовлена

и состоит из 0,7% аминокислоты на основе дрожжевого,азота, 2% глюкозы, 20 мкг/мл гистидина и 2% агара и оставляют на этой среде. Данную смесь .

термостатируют при температуре 30 С, в результате чего получают колонии независимых от лейцина дрожжей. Данную колонию термостатируют в мини- мальной питательной среде Burkholder в которую введен гистидин (20 мкг/ /мл) , в результате чего получают же- лаемые трансформированные дрожжи Sac- t:haromyces cerevi-siae рНС 301. .

Каждую колонию трансформированных дрожжей наносят на чашку с агаром минимальной питательной среды Burk- . holder с введ енным гистидином (20 мкг/мл)5 и термостатируют при температуре 30°С, в результате чего образуется колония. Полученные клетки отделяют от данной колонии, инокули- руют в мини мальную питательную среду Burkhol der с введенным в нее гистиди- ном (20 мкг/мл), и термостатируют при температуре . По прошествии 24 ч клетки в фазе логарифмического роста, собирают и извлекают путем центрифугирования, суспендируют в минимальной питательной среде (10мл) не содержащей фосфорную кислоту (которая получается путем вытеснения в минимальной питательной среде Burkholder) КС1, с последующим вводом 20 мкг/мл гистидина при концентрации клеток примерно 4x10 клеток/мл. После термостатирования при температуре в течение примерно 24 ч питательный бульон выращенной культуры центрифугируют при скорости вращения центрифуги 4000 об/мин в течение 10 мин, в результате чего клетки извлекаются. Отделенные таким образом клетки суспендируют в раство- ре (3 мл) 1,2 М сорбита, 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), 14 мМ 2- меркаптоэтанола и 100 мкг/мл зимолиа- зы-60 000 (поставляемой фирмой Seika- gaku Kogyo К.К., Япония) и смесь ос- торожнр взбалтывают при температуре в течение 30 мин, .в результате чего получается сферопласт.. Этот сфе- ропласт извлекают путем центрифугирования и тщательно суспендиру ют в растворе (1 мл) 0,1% Тритона Х-100 и 50 мМ фосфатного буфера .(рН 7,2), тщательно перемешивают и затем центрифугируют при скорости вращения центрифуги 7000 об/мин в течение 10 мин и полученный всплывший слой

ВНИ11ПИ Заказ 1894/58

извлекают как дрожжевой лизированный раствор.

Этот лизированный раствор (20 мкл) подвергают испытанию с НВС антигеном RIA kit (поставляется фирмой Abbott, США) на активность антигену НВс.

Результаты представлены ниже в табл.2.

Таблица2

S.Cerevisiae

АН22 (FERM ВР-ЗТ2)

рНС 301 4 989

рАМ 82 16 913

Данный вектор не имеет ни гена HEV, ни гена HBs и используется как негативный эталон. (Негативный контроль RIA kit имеет активность 17 740 отсч./мин и позитивный контроль его имеет активность 446 отсч./мин.

Формула изобретен ия

Способ получения челночного вектора путем объединения фрагмента ДНК Saccharomyces cerevisiae, содержащего ars 1 ,2 (uori и селективный маркерный ген для отбора трансформированных S.cerevisiae с фрагментом ДНК Eschef- richia coli, содержащим ген репликации плазмиды, а также селективный маркерный ген для отбора трансформиг рованньпс плазмидой E.coli, отличающийся тем, что, с целью создания высококопийного вектора, в Есо RI сайт-плазмиды fiBR 322 вводят ген кислой фосфатазы РбО, выделенный из банка генов.S 288 С дрожжей, далее обрабатывают эндонуклеазой Sal I и ДНК-лигазой Т4 и получают плазмиду рАТ25, в Sal I сайт рАТ25 включают фрагмент ars I-trp I, выделенный из плазмиды YP7, полученную плазмиду рАТ26 обрабатывают эндонуклеазой Hind III и вводят фрагмент Leu 2 и 2 f4ori плазмиды pSLEI, после чего отбирают вектор рАТ77.

Тираж 520 Подписное