Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста Советский патент 1989 года по МПК C12N15/00 

31

Полиаденилировэнную РНК траскри- бируют в одноцепочечную с ДНК с использованием обратной транскриптазы. РНК удаляют путем щелочного гидролиза. Одноцепочечную с ДНК экстрагируют фенолом, подвергают хроматографи- ческому разделению при пропускании над G-50 Sephadex и осаждают этанолом. Одноцепочечную ДНК используют как основу для синтеза второй цепи кДНК с применением обратной транскриптазы. Одноцепочечную гепариновую петлю у З -концевой части первой молекулярной цепи кДНК удаляют путем обработки нуклеазой 5д. Двух- цепочечную с ДНК очищают экстракци- ей фенолом, подвергают хроматографи- ческому разделению при пропускании над G5.0 Sephadex и осаждают в этано- ле. Двухцепочечнук кДНК снабжают концевым звеном,dCMP с использованием dCTP и концевой трасферазы.

Плазмиду pBR 322 расщепляют эндо- нуклеазой Pst I и снабжают концевым звеном dGMP с тем исключением, что вместо dCTP используют dGTP. 50 нг расщепленной Pst I плазмиды pBR.322 с dG-концевой частью и 20 нг двуцепо чечной кДНК с dG-концевой частью от- жигшот в 50 мкл реакционной смеси.

Трансформацию Е. coli X, 1776 плаз - мидой осуществляют как описано ниже, Штамм Е. coli X 1776 становится проницаемым дпя ДНК.в результате вьздерж- ки в термостате в 75 мкМ СаС, 5 MKMMgCl, 10 мкМ Трис, рН 7,5 в течение 20 мин при 4 с, Плазмиду и бактерии выдерживают в течение 60 мин при и затем в течение 2 мин при . Преобразованные колонии отбирают по стойкости к тетрациклину. Присутствие размноженной ДНК определяют путем гибридизации колоний кДНК зондом, меченным 32Р и кодируюпа1М гормон роста быков. Плазмиду ДНК выделяют из отобранных колоний, расщепляют Pst I, подвергают электрофорезу на 1%-ной агарозе, обрабатьгоают этидийбромидом, фотографируют и, наконец, переносят на нитроцеллюлозные фильтры. Наличие последовательностей гормона роста определяют путем гибридизации с полной цепью кДИК гормона крысы, меченной nick-трансляцией. Получакп один клон, которьш гибриди- зировался с nick-транслированной DMA и обозначенной как рВР 348. Введенная

Q 5 0

5 о

5

0

5

0

5

последовательность включала 8831 пар оснований.

Пример 2. Плазмиду рВР 348 расщепляют Pst 1, фосфат у 5 -концевых звеньев фрагментов ДНК удаляют путем обработки щелочной фосфатазой и заменяют меченным Р фосфатом с использованием полинуклеотидной киназы. Затем плазмиду рВР 348 расщепляют Pst I, Pvu II или Sau ЗА, меченными , и полинуклеотидной киназой, а после этого расщепляют другими ферментами с образованием фрагментов ДНК, меченых в одиночной концевой части. Эти фрагменты получают путем элюирования из поли- акриламидного геля и устанавливают последовательность.

Аминокислотные положения нумеруют, начиная с аминокислоты с аминовым концом гормона роста быков в направлении к карбоксильному концу и в направлении к первому AU.G кодону, который, как предполагается, является точкой начала трансляции. Данная последовательность кодирует синтез . гормона роста, включающий поелетрансляционную обработку. Трансляция гормона роста mRNA приводит к предшественнику гормона роста, включающему сигнальный пептид.

Пример ,3. (А) Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примере 1, используя плазмиду pBR 315 вместо плазмиды pBR 322.. Все условия, включая отбор рекомбинант- ных клонов, описаны ранее.

Введенную последовательность уда ляют и анализируют аналогично примеру 2, в результате чего получают ДНК, содержащую примерно 831.п.о.

(В) Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примере 1, с использованием плазмиды pBR 316 вместо плазмиды pBR 322-. Все условия идентичны описанным в примере 1-.

Пример 4. В данном примере сДНА, кодирующую предЩественник гормона роста быков, получают по примеру 1 .

(А) Линкеры Hind III,,имеющие последовательность 5 -CCAAGCTTGG-3 , соединяют с кДНК, полученной по примеру 1, за счет связьшания обрезанных концов с использованием Т4 DNA лигазы. После связьшания продукт об- рабатьшают посредством Hind III или Hsu I. Плазмиду pBR 322 расщепляют

Hind III или Hsu I и подвергают обработке щелочной фосфатазой. После оса)ения из этанола обработанную фосфатазой расщепленную pBR 322 соединяют с кДНК, содержащей линкер Hind III. Е. coli X 1776 трансформируют рекомбинантной плазмидой и отбирают по чувствительности к тетрациклину. Получают колонию, включающую введенную последовательность, которая гибридизируется с nick-транслированной ДНК. Введенную последовательность удаляют путем расщепления с Hind III или Hsu I и анализируют, как описано в примере 2. Введенная молекула содержала примерно 830 пар оснований, (в) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4, в котором использовалось несколько векторов вместо pBR 322, однако вместо плазмиды pBR 322 используют плазмиды pSC lOlj рМВ9, pBR 315 и pBR 316. Все условия, включая отбор рекомбинантных клонов, аналогичны описанным. Для всех плазмид получают идентичные результаты, т.е. в каждом случае получают рекомбинан- тную плазмйду, содержащую кДНК, кодирующую гормон роста быка.

(С) Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примере 4 (А), но используют несколько других сайтов рестрикции и эндонуклеаз рестрикции. В данном примере используют линкеры Sal I и Ват Н I вместо линкеров Hind III. Последовательности линкеров представляют собой 5 -GGTCCACC-3 и З -CCGGATCCGG-з . При использовании линкеров Sal I кДНК и pBR 322 расщепляют эндонукле- азой Sal I, а при использовании линкеров Ват Н I эндонуклеаза ограничения представляет собой Ват HI. Все условия, включая отбор рекомбина- нтных клонов, описаны в примере 4 (А-).

(D)Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (С), в котором вместо плазмиды pBR 322 используют плазмиды pSC 101, рМВ9, pBR 313, pBR 315 и pBR 316; Все условия такие же, как в примере 4 (С) и получают идентичные результаты.

(E)Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (А) с использованием линкера Есо RI, имеющего последовательность 5 -CCGAATT6G-3 , вместо линкера -Hind III и с использованием эндонуклеа ы Есо RI вместо Hind III

(Hsu I). Транформирование колонии не отбирают по чувствительности к тетрациклину .

(F)Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (Е), но с использованием плазмид pSC 101, рМВ 9, pBR 313 и pBR 315 вместо pBR 322. Используют те же условия, что описаны в

10 примере 4 (Е), и для каждой плазмиды получают идентичные результаты.

(G)Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (А) с использованием линкера Pst I, имеющего последова15 тельность 5 -GCTGCAGC-3 , и с использованием Pst I эндонуклеазы вместо сайта Hind III и вместо Hind III (Hsu I) соответственно. Используют идентичные условия с той разницей,

Q что отбор рекомбинантных клонов осуществляют, как описано в примере 1 Получают рекомбинантньй клон.

(Н) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (G), но используют

5 плазмиды pBR 315 и вместо плазмцды pBR 322. Используют те же условия, что описаны в примере 4 (G), и получают идентичные результаты. Q) Осуществляют процедуры таким

0 же образом, как описано в примерах 1 3 (А), 3 (В) и 4 (А) - (И), с использованием Е. coli RRJ или Е. coli НВ 101 вместо Е. cali X 1776. Все условия и результаты идентичны описанным.

j ПримерЗ. В данном примере получают cDNA, кодирующую i предщественник гормона роста быков, как описано в призере 1. Линкеры Есо RI соединяют с кДНК и рас-

Q щепляют посредством Есо RJ.

(А) В качестве вектора используют Charon 16А. Когезионно свя,занные концевые части обрабатьтают путем - жки в течение 60 мин при 42°С в 0,1 М

g Трис-НС1, рН 8,0 и 10 мМ MgCljj. Данньй вектор расщепляют в сайте ;ЕСО RI эндонуклеазой Есо RJ и затем подвергают обработке щелочной фосфа- тазой. Шсле осаждения из этанола в обработанный фосфатазой вектор ЬЕсо RI сайт вводят кДНК при молярном соотношении 2 моль вектора на I моль.

0

+

Эту смесь сшивают лигазой фага Т Полученной смесью трансформируют суспензию клеток Е. coli X 1776, приготовленную для преобразования, как описано в примере 1. Рекомбинантные фаги извлекают и наносят на .Lac бактерии в чашках, содержащих 5-хлор-4-бром-3-индолип-()-В-глактозид (Х6) , для продуцирования бесцветных негативных колоний отбирают рекомбинант- ные фаги (80 мкг/мл), содержащие

сДНК в Е. coRJ сайте вектора 16А. Отобранный рекомбинант изолирую и обрабатьшают избытком эндонуклеа- зы Есо RJ и продукт обработки анализируют, как описано в примере 2. Из- влекают ДНК с длинной цепью, включающей примерно 830 пар оснований. Полученные фаги упаковьшают in vitro.

(Б) ДНК фагов Charon ЗА или 4А используют в качестве векто-ра вместо ДНК Charon 16А. Все условия были идентичны тем, что описаны для ДНК Charon 16А. Выбор рекомбинантных фагов осуществляют путем нанесения фагов на Lac бактерии в чашках, со- держащих Хб, и изолирования бесцветных негативных колоний с последующими либо гибридизацией с соответствующей пробой, или обработкой эндо- нуклеазой. Эту введенную последова- тельность удаляют, как описано ранее в результате чего п олучают ДНК с длинной цепью примерно 830 пар осно- ваний.

(C)ДНК фaгa gt WE8 ЛВ используют в качестве вектора вместо Charon 16А Все условия идентичны описанным для Charon 16А. Отбор рекомбинантных фагов осуществляют по способу гибридизации.

Введенный фрагмент удаляют, как описано ранее, в результате чего получалась ДНК, включающая примерно 830 пар оснований (длина цепи).

(D)Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примерах

5(А) - (С), в которых использовались Е. coli RPJ, Е. coli ИВ 101, Е. coli DP 50 или Е. coli DPS иф F, вместо Е. coli, X 1776, Все условия тедентич- ны и получают идентичные результаты.

Пример 6. Для осуществления данного примера получают сДНК, кодирующую предшественник гармона роста, как описано в примере 1 . Вво- дят линкеры Hind III и кДНК обраба- тьшают посредством Hind III или Hsu I, как описано в примере 4(А).

Ппазмиду рС 194, изолированную из S. aureus, используют в качестве вектора, рС 194 расщепляют в зоне Hind Hi посредством Hind III или Hsu I и затем подвергают обработке щелочной фосфатазой.

Полученную кДНК соединяют с расщепленной рС-194, Осуществляют трансформацию В, subtil is RuB, Клеточную суспензию наносят непосредственно на L чашки, содержащие 3 мкг хлор- амфеникола. Отобранньй рекомбинант изолируют и обрабатывают посредством Hind III и продукт расщепления анализируют, как описано в примере 2 Извлекают ДНК длиной цепи примерно 830 пар оснований.

Пример 7, (А) Плазмиду pBR 348 обрабатывают эндонуклеазой Нае II с образованием фрагмента, включающего 1600 п.о. Однако зона Нае II находится в пределах введенной кДНК, кодирукнцей предшественник гормона роста, а вторая зона - в пределах фрагмента плазмиды pBR322. В результате расщепления получают

,...3 - З -GCGGAA5

Бычий GH (гормон роста) начинается либо с 4-1 ala, либо с -+2 phe остататочного звена в концевом по-: ложении NHj,. Удаление ко дона ala . осуществляют путем вьщержки в термостате ДНК вместе с dATP и фрагментом Кленова DNA полимеразы I. В результате этой реакции получают.

5 ТТС .,.,3

З - AAG5 .

ДНК экстрагируют фенолом и осаждают. Избыток dATP и .дигерированные основания удаляют путем хроматографии на G50 Sephadex. Оставшееся 5 звено удаляют нуклеазой S.. В результате такого расщепления получают

5- ТТС ,.,,3

з - AAG- ....5

(В) Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примере 7(А), в котором дезоксинуклеотидную последовательность, кодирующую предшественника гормона роста быка, удаляют путем обработки рекомбинантных ДНК, полученньис в примерах 3, 4, 5 И 6 эндонуклеазой Нае II.

Используемые векторы и эндонуклеа зы показаны в таблице.

После обработки ферментом рестрикции изолируют последовательность предшественника гормона роста быка посредством гельэлектрофореза и за914

тем ее подвергают обработке, как описано в Примере 7(А), при этом получают идентичные результаты.

(С) Осуществляют процедуры таким же образом как описано в примерах 7(А) и 7(В), с использованием полимеразы или З - 5 экзонуклеазы вместо фрагмента Кпенова ДНК полимеразы I.

Все другие условия идентичны и в каждом случае получают идентичные последовательности фрагмента гормона роста быков.

П р и м е р 8. {А) фрагмент гормона роста быков ,

5 - С ТТС....3

з - GCCGAAG з

получают путем обработки Нае II,- как описано в примере 7(А) или 7(В). Затупление осуществляют следующим об- . ДНК, вьщерживают в термостате- с dATP, dCTP, dCTP, dTTP и фрагменто Кпенова ДНК полимеразы I. В результате этой реакции получают 5 - GG

З - GCGGAAG ...,

ДНК экстрагируют фенолом и осаждают. Данную последовательность затем выдерживают в термостате с фрагментом Кленова ДНК полимеразы I в присутствии dCTP. Эту последовательность за тем обрабатьюают S| нуклеазой, в результате чего получают последовательность

5 - GCC ТТСз

3 - CGG AAG5

(в) Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примере 8(А), с использованием Т4 ДНК полимеразы или 3 - 5, т.е. в присутствии dCTP.

Пример 9. Дезоксинуклеотид- ную последовательность, кодирующую гормон роста быков, вводят в векторы переноса, как описано для предшественника гормона роста быков.

(А) Осуществляют процедуры таким же образом, как описано в примерах , 3(А), 3(В), 4(А) - (J), 5(А) - ,() и 6, о использованием ДНК, приготовленной аналогично примерам 7(А), 7(В) или 7(С). Все другие условия идентичны. ДНК расщепляют соответствующими эндонуклеазами, как показано в таблице, и анализируют, как описано в примере 2. В каждом случае по9 О

лучают ДНК с последовательностью, начинающуюся с Phe в положении 2.

(В) Осуществляют процедуры таким же образом, как описано в примерах I, 3(А), 3(В), 4 (А) - (СГ), 5СА) - (D) и 6, с использованием ДНК, приготовленной согласно примеру 8(А) или 8(В). Все другие условия идентичны.

ДНК расщепляют соответствующей эндо-. нуклеазой (как показано в таблице) и анализируют, как описано в примере 2. В каждом случае получают ДНК., имеющую последовательность, начинающуюся с Ala кодона.

Пример 10. (А) Экспрессию предшественника гормона роста быка как белка слияния демонстрируют с помощью радиоиммунного анализа и

миникпеточного эксперимента. В эксперименте с радиоиммунным анализом Е. coli X 1776, содержащие pBR 348, или Е. coli, содержащие pBR 322, как контроль, выращивают в питательном

бульоне и извлекают посредством центрифугирования. Клетки повторно суспендируют и лизирутот, и в гормон роста вводят радиомеченый гормон роста овец и антитело овец (или быков).

Иммунный комплекс осаждают и измеряют радиоактивность. Эксперимент показал, что белок слияния сохраняет некоторую 1муноактивность гормона роста быков. Дпя более подробной иллюстрации продуцирования белка слияния осуществляют мкниклеточньй эксперимент. Данньй эксперимент показывает, что pBR 348 образует белок слияния, состоящий из 183 аминокислот

| Лактамазы, 217 аминокислот предгор- мона роста быка и несколько связывающих аминокислот, кодированных обычно, нетранслированной 5 зоной. Общий молекулярный вес, составляющий примерно 45000, соответствует предсказанному молекулярному весу гибридного белка.

(В) Дпя прямой экспрессии предшественника гормона роста быка введен ™ сначала отделяют от pBR 348 путем частичного расщепления эндону- клеазной Pst I и очищают посредством препаративного гель-электрофореза. 15 мкг образца очищенной введенной

Н затем модиАицируют путем суспен- зирования ДНК в воде, в которую ввоят раствор солей так, чтобы конечая композиция содержала: 70 мМ Трис, Н 8,8; 70 мМ MgCl2 ; Ю Ь дитио1

треитола и 13,75 молекулярных звеньев полимеразы ДНК в общем объеме 250 мкл Реакционную смесь вьщерживают в термостате при 37 С в течение нескольких минут, затем вводят dATP до концентрации 50 M}J. После, дополнительной выдержки в термостате в течение 30 мин фермент инактивируют путем термообра ботки при 65°С в течение 5 мин. Этот процесс повторяют еще два раза, один раз с использованием dCTP и dATP, а затем снова с использованием dTTP. Обработанную DNA извлека1от путем осаждения этанолом. Обрабатывают S, нук- леазой. Данный процесс обеспечивает получение молекулы ДНК, заканчивающейся в начальном кодоне в положении за номером 26. Такие молекулы транс- лирзгются при вводе в вектор экспрессии, имеющий зону ввода, соответствующую примерно 3-11 нуклеотидам от последовательности рибрсомного связы- ,вания.

Вектор прямой экспрессии конструируют путем модификации плазмиды ptrp ЕЗО, путем удаления 23-29 нуклеоти- дов с использованием полимерат зы и S нуклеазы, как описано ранее.

Модифицированную кДНК и модифицированный вектор экспрессии снабжают линкером, имеющим последовательнйсть 5 -CCGGATCCGG-3 у одной цепи, и гомологичную ей, последовательность у другой цепи посредством связьюания с использованием лигазы. Эти линкеры обеспечивают наличие Ват Е+ сайтов. Бактерии-хозяева Е. coli НВ 101, RR5 или X 1776 трансформируют посредством рекомбинантных ДНК, несущих фрагмент, кодирующий предшественник гормона роста, и трансформаты отбирают по стойкости к ампициллину. Единственный трансформант, обозначенный как ptr рЕЗО/bGH отбирают для дополнительного анализа.

Бактериальные клетки, трансформированные плазмщ ой ptr рЕЗО/bGH, выращивают в стандартной.минимальной среде (М9), содержащей LeU PrO, витамин В1 и ампициллин, при 37°С. На ранней логарифмической фазе trp опе- рон индуцируют путем ввода й-индолил- акриловой кислоты (30 мкг/мл среды). Контрольные культуры оставались не- индуцированньми. По прошествии 3 ч роста 1,5 мл клеток .подвергают радиоактивному мечению путем ввода 20 1К S-L-Met и выдерживают в тер моста47

ев л. ойин а т н . а-и - ы-

rpт ,i .

ьы5 га- л- . ота1949J2

те в течение 10 мин. Клетки извлекают путем центрифугирования, промывают и снова суспенди руют в 250 мкл буферного раствора, содержащего 10% гликоля, 5% р -меркаптоэтанола и 2,3% SDS в 0,0525 М Трис, рН 6,8. Суспензию кипятят в течение 5 мин, затем вводят в 10%-ный гель SDS полиакрилами10 да и фракционируют посредством электрофореза. Полосы, соответствующие белковым зонам, визуально наблюдают посредством ауторадиографии. Результаты показали наличие новой белковой

15 полосы, составляющей примерно 2АООО дальтон, которая отсутствует в неиндуцированных или непреобразованных культурах.

Предшественник гормона роста бы20 ков очищают обычными способами,

включающими, например, гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию, адсорбционную хроматографию и методы, основанные на различии растворимос25 тей. Предшественник гормона роста Превращают в гормон роста.

(С) Линкеры с последовательностью S -CCGGATCCGGATG-3 у одной цепи и гомологичной ей последовательностью

30 У другой.цепи соединяют фрагментом ДНК, кодирующим гормон роста.быка, полученным аналогично примерам 7(А) - (С) и 8(А) - (В). Эту модифицированную DNA затем вводят в вектор ptr

-g рЕ 30, как описано в примере 10(В). Бактерию-хозяина трансформируют и культивируют, и получаемый в результате гормон роста быков очищают, как описано в примере 10(В).

40 Формула изобретения

1. Способ конструирования реком- бинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, заключающийся в

45 том, что вьщеляют полиаденилирован- ную мРНК из гипофиза быка, очищают поли А мРНК адсорбционной хроматографией с применением олиго-ё-ц еллюло- зы, обрабатывают обратной транскрипgQ тазой и получают однкДНК, удваивают полученную однкДНК .с помощью обратной транскриптазы, полученную двунитевую кДНК последовательно обрабатьюают эн- донуклазой Нае II, фрагментом Кленоgg ва, ДНК полимеразой, а затем нуклеа- зой S( и получают кДНК, кодирукнцую бычий гормон роста с 26 по 191 аминокислоту со следующей нуклеотидной последовательностью;

S-ATGATGCCTCCAGGCCCCCGGACCTCCCTGCTCCT GCTTTCGCCCTGCTCTGCCTGCCGTGGAGTCAGGTG GTGGGCGCGTTCCC AGGCATGTGGTTGTCCGGGGTG TTTGCGAACGCTGTGCTCCGGGGTCAGCACCTGCAC

CAGCTGGGTGCTGAGACCTTGAAAGAGTTTGAG CGTAGCTACATCGGGGAGGGAGAGAGATACTGC ;ATCCAGAACACCGAGGTTGCCTTCTGCTTCT€C IGAAACCATGCCGGCGGCCACGGGCAAGAATGAG

GGCCAGCAGAAATGAGACTTGGAGCTGCTTCGC

ATCTCACTGCTCCTGATCCAGTCGTGGCTTGGG

GCCCTGCAGTTTCTCAGGAGAGTCTTCACC

AACAGCTTGGTGTTTGGGAGGTCGGAGCGТ

GTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAA

GGCATGTTGGCCGTGATGGGGGAGCTGGAA

GATGG CAGC GGGCGGGG TGGG CAGATGCTC

AAGCAGACCTATGAGAAATTTGACACAAAC

ATGCGCAGTGACGAGGCGGTGCTCAAG

AACTACGGTqTGGTGTGGTGCTTCCGG

AAGGACCTGGATAAGACGGAGACGTAC

CTGAGGGTGATGAAGTGGCGCGGGTTC

GGGGAGGGCAGGTGTGGCTTGTAG-З ,

5

°

5

0

следующей обработкой эндонуклеазой S, и получением кДНК, кодирукядей гормон роста быка со следующей нуклео- тидной последовательностью

5 -GGGTTGGGAGCGATGTGGTTGTGCGGCCTGTTT GGGAAGGGTGTGCTGGGGGCTCAGCACCTGCAG GAGGTGGGTGCTGACAGGTTGAAAGAGTTl GAG CGTACGTAGATGCCGGAGGGACAGAGATAGTCC ATGGAGAAGAGCCAGGTTGCCTTGTGCTTGTGC.. GAAAGCATCCCGGCCGCCACGGGCAAGAATGAG GCCCAGGAGAAATCAGACTTGGAGCTGCTTGGG ATGTCACTGCTGCTGATCGAGTCGTGGCTTGGGCCCGTG CAGTTTCTCAGCAGAGTCTTGACCAACAGGTTG GTGTT GGAGCTGGGACCGTGTCTATGAGAAG ,GTGAAGGACCTGGAGGAAGGGATCTTGGCCCTG ATGCGGGAGGTGGAAGATGGGACCCCCCGCGTC GGGGAGATCGTCAAGCAGACGTATGAGAAATTT GAGACAAACATGCGCAGTGACGAGGGCGTG CTCAAGAACTACGGTCTGCTGTCCTGGTTCCGGAAG GAGGTGGATAAGAGGGAGACGTAGGTGAGGGTGATG AAGTGGGGGCGGTTGGGGGAGGGGAGGTGTGGCTTGTAG

Изобретение относится к области генной инженерии и касается способа получения рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая гормон роста быка, получена путем выделения мРНК из гипофизарных желез быков с последующим получением кДНК и клонированием полученной кДНК в PBR 322. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

и клонируют ее в PS t I или EcoRI сайт вектора pBR 322.

I1-Т

или 3 -5 в присутствии ёТТФ -с по

Фермент ограничения

Вектор переноса (Пример)

0

Pst I Hind III Sal I Bam HI ECO RI

ЗА,ЗБ, 4G, 4H

4A,4B, 6

4G,4D

4G,4D

4E,4F 5A, 5B, 5G