Изобретение относится к иммунологии и генной инженерии, в частности к исследованию моноклональных антител, и направлено на продуцирование химерных моноклональных антител, которые могут быть использованы для лечения рака и других заболеваний.
Изобретение относится к способу экспрессии тяжелых цепей химерного антитела KS.1/4 в эмбриональных клетках человеческой почки. В публикации Европатента № 0125023 от 14 ноября 1984 г. раскрываются рекомбинантные и химерные моноклональ- ные антитела. Однако эти молекулы реагируют с карциноэмбриональным антигеном, а не с антигеном аденокарциномы настоящего изобретения. Кроме того, СаЫНу и др. не раскрывают способ настоящего изобретения, в котором цепи антител продуцируются в нелимфоидных клетках почки.
Sherle L Morrison в Science. 229 : 1202- 1207 (1985) раскрывает получение химерных антител в клетках трансфектомы. Химерные
антитела, полученные Morrison реагируют с тринитрофенилом и были продуцированы в лимфоидных клетках, В работе Sun и др., (1987) Proc.Natl.Acad Sci США, 84 : 214-218 раскрывают химерные антитела, которые реагируют в аденокарциномой. Из сравнения аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела, раскрытого Sun, и аминокислотной последовательности тяжелой цепи KS1/4 ясно видно, что эти последовательности являются на 48% негомологичными. Более того, в работе Sun и др. не раскрывается использование нелимфоидных клеток, которые используются в настоящем изобретении.
Настоящее изобретение относится к получению новых соединений ДНК и векторов клонирования рекомбинатной ДНК, который кодирует мышиное (человеческое) химерное антитело с тяжелой цепью, происходящее от KS1/4. Эти векторы позволяют экспрессировать новые ДНК-соединения в нелимфоидных эукариотических клетках.
х 00 О
Сл)
Изобретение также позволяет получить клетки хозяина, трансформированные этими новыми клонирующими векторами. Эти трансформированные клетки хозяина экс- прессируют рекомбинантные или химерные К51/4-антитела. Многие из существующих ДНК-соединений могут быть использованы для получения К51/4-производных, которые до сих пор не были синтезированы ни в природе, нив лаборатории, и которые также входят в объем настоящего изобретения.
Моноклональное антитело KS1 /4 является мышиным антителом, которое специфически связывается с антигеном поверхностных клеток 40000 Д, обнаруженным в высокой плотности на клетках аденокарциномы, а также на нормальных эпителиальных клетках. Это антитело оказалось эффективным для диагностики заболеваний In vitro, а также для In vivo диагностики и лечения аденокарцино- мы. Последние исследования подтвердили, что К51/4-лекарственные коньюгаты показывают дозозависимую суппрессию роста опухоли.
Возникает одна проблема с использова- нием мышиных антител в человеческом организме, если иммунная система пациента с заболеванием раком вырабатывает антитела против мышиных иммуноглобулинов. Такой иммунный ответ происходит не у всех паци- ентов, но если он происходит, то он приводит к постепенному ухудшению эффективности лечения в течение курса многократного приема лекарственного средства. Этот иммунный ответ пациента может также приводить к более сильным реакциям, таким, как анафилаксия или сывороточная болезнь. Такая иммуногенность не позволяет вводить многократные дозы антитела и поэтому снижает клиническую ценность лечения.
Человеческие моноклональные антитела получить очень трудно, поэтому во избежание иммунологических проблем конструируют химерные антитела. Химерные антитела содержат специфические или вари- абельные части антитела, происходящего от видов, связанных с постоянным участком от различных видов. См. Ol u Morrison; Bio techniques 4:214-221 (1986). Поскольку иммунный ответ бывает часто направлен против постоянного участка, замена мышиного постоянного участка человеческим постоянным участком способствует значительному ослаб лению иммунологической реакции пациента. В соответствии с этим химерные антитела являются желательными для лечения заболевания.
Основная теория химерных антител описана в литературе, однако еще остается необходимость в разработке новых химерных
антител, обладающих определенной специфичностью. Настоящее изобретение относится к рекомбинантной ДНК и аминокислотным последовательностям, которые содержат полную молекулу KS1 /4 мо- ноклональногоантитела.Эти
последовательности воздействуют на экспрессию химерных антител, которые обладают той же тканевой специфичностью, что и KS1/4, но которые содержат при этом постоянные участки, происходящие от человеческих источников. Поэтому настоящее изобретение позволяет применять терапевтический режим с той же тканевой специфичностью моноклинального антитела KS1/4, но со значительным уменьшением иммунологических побочных эффектов.
Кроме того, изобретение включает ре- комбинатную ДНК и аминокислотные последовательности KS1/4. Знание этих последовательностей позволяет специалистам разработать новые К51/4-производные с модифицированными родством для KS1/4- антигена. Настоящее изобретение, кроме того, содержит способы получения химерного и рекомбинантного KS1/4 в линиях нелимфо- идных клеток, чтобы тем самым разрешить проблему, часто возникающую в результате двойной секреции гетерогенных антител в лимфоидных клетках.
В целях раскрытия настоящего изобретения ниже приведенные понятия определяются следующим образом:
А - деоксиаденозин;
Ala - остаток аланина;
Ар - ампициллин-резистентный фенотип или ген, несущий устойчивость в ампициллину;
Arg - остаток аргинина;
Ash - остаток аспарагина;
ASp - остаток аспарагиновой кислоты;
С - деоксицитозин;
Химерное антитело - антитело, содержащее вариабельный участок от одного вида обычно мыши, который связан с постоянным участком от другого и отличного от него вида, обычно человека;
CyS - остаток цистеина;
dhfr - фенотип дигидрофолат-редукта- зы или ген, несущий этот фенотип;
Enh - последовательность энхансера, полученная от ВК-вируса;
G - деоксигуанозин;
Gin - остаток глутамина;
Glu - остаток глутаминовой кислоты;
Gly - остаток глицина:
G418-R устойчивый фенотип или ген, несущий этот фенотип, может быть также идентифицирован как KmR;
His - остаток гистидина;
HmR - гидромицинустойчивый фенотип или ген, несущий этот фенотип;
Не - остаток изолейцина;
Ivs - ДНК, кодирующая интрон, так называемая вставочная последовательность;
KSA - антиген поверхностного гликоп- ротеина клеток 40000 USLA-P3, которые являются распознаваемыми моноклинальным антителом KS1/4;
KS1/4 - мышиное моноклональное антитело, происходящее от линии клеток гиб- ридомы; это антитело, распознающее гликопротеиновый антиген 40000 Д, обнаружено на поверхности клеток P3-UCLA;
Leu - остаток лейцина;
LP-ДНК-фрагмент, содержащий активность промотора аденовируса позднего промотора;
Lys - остаток лизина;
Met - остаток метионина;
МоАВ - моноклональное антитело;
Нативный белок- полипептид, продуцируемый при трансляции и РНК-транскрипта, и любых посттрансляционных модификаций;
РА - ДНК-последовательность, кодирующая сигнал полиаденилации;
Phe - остаток фенилаланин;
PL-ДНК-фрагмент, содержащий активный промотор левого промотора бактериофага;
Pro - остаток пролина,
Промотор - ДНК-последовательность, которая направляет транскрипцию ДНК в РНК.
Вектор клонирования рекомбинантной ДНК - любой автономно реплицирующий агент, включающий плазмиды и фаги, но не ограничивающийся ими, содержащий ДНК- молекулу, к которой могут быть добавлены один или несколько дополнительных фрагментов ДНК.
Вектор экспрессии рекомбинантной ДНК - любой вектор клонирования рекомбинантной ДНК, в который вводят промотор.
Рекомбинантное KS1/4 - молекулы мо- ноклонального антитела KS1/4, экспресси- руемые в клетках, трансформированных вектором, вызывающим экспрессию KS1/4.
Репликон - ДНК-последовательность, которая регулирует и обеспечивает автономную репликацию плазмиды или другого вектора.
Фрагмент рестрикции - любая линейная последовательность генерированная одной или несколькими рекстриктрирующи- ми эндонуклеазами.
Восприимчивая клетка хозяина - которая не может расти в присутствии данного антибиотика или другого токсичного соединения без устойчивого к нему ДНК-фрагмента.
Ser - остаток серина. Структурный ген - любая ДНК - после- 5 довательность, кодирующая функциональный полипептид, начало включения трансляции и стопсигналы. Т - деокситимидин.
TcR - тетрациклинустойчивый фенотип 0 или ген, несущий этот фенотип. Thr - остаток треонина. Тгр - остаток триптофана. Туг - остаток тирозина Val - остаток валина.
5 На фиг.1 показана схема конструкции плазмиды PL32 (для наглядности фиг. точно не соответств уют масштабу); на фиг.2 - сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pNM789; на фиг.З - схема конструкции 0 плазмиды 120; на фиг.4 - схема конструкции плазмиды PL110; на фиг 5-сайт рестрикции и функциональные карты ВК - вируса и плазмиды рВК neol; на фиг.6 - сайт рестрикции и функциональные карты плазмид 5 pLPCat и pPLcat; на фиг.7 - схема конструкции плазмиды pL133; на фиг.8 - сайт рестрикции и функциональные карты плазмид pLPC, pSV 2hyg и pLPChygl; на фиг.9 - схема конструкции плазми ды pBW25; на фиг.Ю - 0 схема конструкции плазмиды pBW32; на фиг 11 - сзйт рестрикции и функциональные карты плазмид pLPChd и phd; на фиг. 12 - сайт рестрикции и функциональные карты плазмид СНКС2-6 и СНКС2-18; на фиг.13 - 5 сайт рестрикции и функциональные карты плазмид СН2А5 и CH2A51G2; на фиг.14 - сайт рестрикции и функциональные карты плазмид CH2A51G3 и CH2A51G4.
Предметом настоящего изобретения яв- 0 ляется способ экспрессии, заключающийся в том, что конструируют рекомбинантную ДНК-плазмиду pHI-HI, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела KS1/4 с аминокислотной последовательно- 5 стью, состоящей в основном из
Gin Пг Gin Геи al Gin Ser Gly Pro Пи leu I) s Pro C1S Glu Thr Val I-, s lie Ser l-±s Ala Ч-r Cly 14 r Thr Phc Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly 0 LVS GIV Leu Lys Tip Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Cly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly .rij Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala ST Thr Ala Phe teu Gin lie flln Cln Pro Gin Asn Met ArS Thr Mcc Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Phe lie Ser Lys Asp Tyr Trp Gly Cln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
трансформируют штамм культивируемых клеток, являющихся эмбриональными клетками гючютг человека, трансформированными аденовирусом типа 5, с помощью плазмиды рН1-Н1, а затем культивируют
клетки, которые экспрессируют цепи химерного антитела.
Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи является следующей5
CAG АТС САО TTG ОТО САС ТСТ EGA CCT GAG СТО AAG AAG CCT GOA GAG АСА СТС ААО АТС ТСС TGC АЛО GCT ТСТ GGG ТАТ АСС ТТС АС4 ААС ТАТ GCA ATG ААС TGG CTG AAG CAG ACT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG GftC TGG ATA ААС ACC ТАС ACT GGA GAA CCA АСА TAT GCT GAT GAC TTC AAG GOA CGG TTT GCC ТТС ТСТ TTG CAA ACC TCT GCC AGC ACT GCC TTT TTG CAG ATT CAA CAA.CCT CAG AAT ATO AGO ACT ATG GCT АСА ТАТ ТТС ТОТ СТА АСА ТТТ ATT TCT. AAG GOG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACG TCA GTC ACC GTC ТСС ТСА
Молекулы легкой и тяжелой цепи насто- ящего изобретения ассоциируются с отчетливыми сигнальными пептидами.
Последовательность аминокислотных остатков сигнального пептида тяжелой цепи в основном является следующей Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gin Ser Ala Gin Ala
Нуклеотидная последовательность этого сигнального пептида является следующей
ATG GAT TGG CTG TGG ААС TTG СТА ТТС CTG ATG GCA GCT GCC CAA ACT GCC CAA GCA:
Новые ДНК-соединения настоящего изобретения являются производными от кДНК-клонов, полученных из мРНКот линии клеток гибридомы, которая продуцирует мо- ноклональное антитело KS1/4. Плазмида рСКС2310 содержит полную кодирующую последовательность легкой цепи монокло- нального антитела KS1/4; кодирующую последовательность сигнального пептида, ассоциируемую с легкой цепью, и 5 и 3 - нетранслированные участки этой молекулы. 51 - нетраслйрованный участок имеет ДНК- поел едовател ьность:
51 -ТС TGA CAG АСА СТА CTG TGC CTC GTC .GGT TGG GAC СТА ААА GGG СТА СТА GAA ТСС GCA AGC ТТТ ТТА АТС ТСТ CCA AAG АА6 ATG AT G TCC GCC AGT АТб ТТб ТСА GGA AG С CCT TAA АСА AAG AAG GTA ATT AG С TAG GGA CCA ААА ТТС ААА GAC AAG-31 .
З1 - нетранслированный участок имеет ДН К-последовательность: 51 - TAG AGA CAA AGG ТСС TGA GAC GCC ACC ACC AGC TCC CCA GCT CCA TCC TAT CTT CCC TTC TAA GGA GGT CTT GGA GGC TTC CCC АСА AGC GAC ATA CCA CTG TTG CGG TGC TCC AAA CCT CCT CCC CAC CTC CTT CTC CTC CTC CTC CCT TTC GGC TTT TAT CAT GCT AAT ATT TGC AGA AAA TAT TCA ATA AAG TGA GTC TTT GCA CTT G-31
Плазмида рСКС2310 может быть выделена обычным способом из E.coll К 12 ММ294 (pGKC2310), штамм депонирован и
0
5
0
5
0 5 0
5
0 5
находится в постоянном фонде коллекции культур Северной областной исследовательской лаборатории (NRRL), Peorla, Иллинойс. Культура E.coli K12 ММ294/ рКС2310 может быть получена из NRRL под входящим номером В-18356.
Плазмида рС2А52 содержит полную кодирующую последовательность тяжелой цепи моноклонального антитела KS1/4, кодирующую последовательность сигнального пептида, связанного с тяжелой цепью и 51 и З1 - нетранслированные области этой молекулы. Тяжелая цепь, кодируемая этой молекулой, является цепью подкласса IgG 2A, 51 - нетранслированная область имеет ДНК-последовательность:
51 - TCG TTT GTC TTA AGG CAC CAC TGA GCC CAA GTC TTA GAC ATC-31 а З1 - нетранслируемая область имеет ДНК- последовательность:
51 - TGA GCT CAG CAC CCA CAA AAC TCT CAG GTC CAA AGA GAG ACC CAC
ACT CAT CTC CAT GCT TCC CTT GTA TAA ATA AAG CAC CCA CGA ATG CCT GGG ACC TAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AGA CG-31
Плазмида рС2А52 может быть выделена обычным способом из E.coli K12MM294/pG22A52, также депонированным и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL. Культура Е. coll K12 MM294/pG2A52 может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL B-18357.
Плазмида СНКС2-6 содержит кодирующую КДНК-последовательность вариабельной области природной легкой цепи моноклонального антитела KS1/4, к ДНК кодирующую последовательность сигнального пептида, связанного с этой легкой цепью, и геномную ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область легкой цепи человеческого иммуноглобулина. Плазмида СНКС2-6 может быть выделена обычным способом из Е. coll K12 DH5/CHKC2-6, также депонированном и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL Культура Е. coll K12 ДН5- СНКС2-6 может быть получена из NRRL под входящим номером В-18358. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды СНКС-2-6 представлены на фиг. 12.
Плазмида СНКС-2-18 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области производного с легкой цепью моноклонального антитела KS1/4, кодирующую кДН К-последовательность сигнального пептида, ассоциируемого с легкой цепью, и геномную ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область легкой цепи человеческого иммуноглобулина. Вариация этой последовательности включает альтерацию кодона в З1 -конце. Вариабельная область природной легкой цепи содержит кодом агригина в З1 - конце, тогда как кодон в том же положении в плазмиде СНКС2-18 кодирует остаток глицина. Плазмида СНКС2-18 может быть выделена обычным способом из Е. coll K12 ДН5/СнКС2-18, также депонированном и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL. Культура Е. coli K12 ДН5/СНКС2-18 может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL В/18359. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды СНКС2-18 представлены на фиг. 12.
Плазмида СН 2А5 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела KS1/4; кодирующую кДНК-после- довательность сигнального пептида, ассоциированного с указанной тяжелой цепью, и геномную ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgGI, Плазмида СН2А5 может быть выделена обычным способом из Е. coli K12 ММ294/СН2А5, также депонированном и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL Культура Е. coli K12 ММ294/СН2А5 может быть получена и NRRL под входящим номером NRRL B-18360. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды СН2А5 представлены на фиг, 13.
Плазмида СН2А551С2 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела KS1 /4, кодирующую кДНК-последо- вательность сигнального пептида, ассоциированного с тяжелой цепью, и геномную ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина lgG2. Плазмида СН2А51С2 может быть выделена обычным способом из Е. coli K12 ДН5/СН2А51С2, также депонированном и находящимся в постоянном фонде коллекций культур NRRL. Культура Е. coli K12 Н5/СН2А5102 может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL B-18361. Сайт ресктрикции и фун- кциональная карта плазмиды CH2A51G2 представлены на фиг. 13.
Плазмида CH2A51G3 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела KS1/4; кодирующую кДНК-последовательность сигнального пептида, ассоциированного с тяжелой цепью, и геномную ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина lgG3. Плазмида CH2A51G3 может быть выделена обычным способом из Е. coli K12 ДН5/СН2А51СЗ, также депонированном и 5 находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL, Культура Е. coll K12 ДН5/СН2А51СЗ может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL B- 18362. Сайт рестрикции и функциональная 0 карта плазмид CH2A51G3 представлены на фиг. 14.
Плазмида CH2A51G4 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального 5 антитела KS1/4, кодирующую кДНК-последо- вательность сигнального пептида, ассоциированного с тяжелой цепью, и геномную ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область тяжелой цепи человече0 ского иммуноглобулина lgG4. Плазмида CH2A51G4 может быть выделена обычным способом из Е. coll K12 ДН5/СН2А5164, также депонированном и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL.
5 Культура Е. coll K12 ДН5/СН2А5164 может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL B-18363. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды CH2A51G4 представлены на фиг.14.
0
ДНК-соединения настоящего изобретения, кодирующие рекомбинантное KS1/4 и их производные, особенно предпочтительны для конструирования векторов для трансфор5 мации и экспрессии различных цепей антитела в клетках млекопитающих и других эукарио- тических клетках. Хозяйские клетки многих млекопитающих обладают необходимым механизмом для распознавания и соответствую0 щей обработки-сигнальных пептидов, находящихся на аминоконцах различных цепей антитела, рассматриваемых в настоящем изобретении. Клетки хозяина некоторых млекопитающих также обеспечивают посттранс5 ляционные модификации, как, например, гликосилирование, наблюдаемое в молекулах антитела. Существует много разновидностей векторов для трансформации эукариотиче- ских клеток хозяина; и специфические векто0 ры, описываемые ниже, не ограничивают объема настоящего изобретения.
Векторы экспрессии настоящего изобретения, которые способствуют получению ре- комбинантного KS1/4 и его химерных
5 производных, конструируются при помощи плазмиды phd. Плазмида phd конструируется из широко известных доступных исходных материалов. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды phd представлены на фиг.11.
Плазмида phd конструировалась сначала при помощи выделения плазмиды рКС283 от Е. coll K12 ВЕ1201/рКС283. Эта культура может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL B-15830. Плазмида рКС283 содержит промотор гибрида Ipp- pZ бактериофага А. Эту плазмиду получали из клеток Е. coll K12 ВЕ1201, так как эти клетки содержат термовосприимчивый с I репрессор, интегрируемый в клеточную ДНК. Ненужный участок lacZ плазмиды рКС283 вырезали сначала путем переваривания плазмиды рекстриктирующим ферментом PV и 11. Затем добавляли к переваренной ДНКспецифические ДНК линкеры для превращения PV и 11 сайтов в одиночный Xhol сайт, который создавал плазмиду рКС28РХ. Подробные описания выделения плазмид рКС283 и рКС283РХ представлены соответственно в примерах 1 и 2. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид рКС283 и рКС283РХ представлены на фиг.1. Как описано в примере 3, плазмида рКС283РХ трансформируется в Е. coli K12 МО (А4) Е. coli K12 МО (А) может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL В-15993.
Затем при помощи рестриктирующих ферментов Bglll и Xhol переваривали плазмиду рКС283РХ. После этого вектор очищали, ДНК линкеры с Bglll и Xhol-концами лигировали в вектор для образования плазмиды рКС283-п, Bglll-Xhol линкер также одержал ХЬа 1-сайт. Xho-сайт плазмиды pKC283-Z затем трансформировали в BamHI-сайт. Это достигалось путем полного переварирования плазмиды pKC283-L рестриктирующим ферментом Xh01, с последующей обработкой ф-м Кленова и добавлением BamHI-линке- рами для образования плазмиды pKC283LB. Подробное описание конструирования плазмид pKC283-Ln pRC283-L В приводится соответственно в примерах 4 и 5. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид pKC283-Lи pKC283-L В предстэрлены на фиг.1.
Периферическую ДНК Е. coll затем вырезали из плазмиды рКС283РХ путем полного переваривания рестриктирующим ферментом Sal I с последующей обработкой 4,0 kb вектора Кленова и добавлением EcoR l-линкеров. После рециркуляризации путем лигирования получали плазмиду рКС283Р RS. Затем плазмиду г ереваривали рестриктазами Pst и Sph I выделяли 0,85 kb. Фрагмент рестрикции Psi + 1 - SpJbi I. Аналогичным образом плазмиду pKC283-Z В переваривали рестриктазами ESI + 1 и SpJi I и выделяли 0,3 kb орагмент
0,85 kb Pst + 1 - Sph I фрагмента плазмиды рКС283Р RS затем лигировали в 3,0 kb Pst + I - $ph I фрагмента вектора плазмиды pKC282-L В для образования
плазмиды pL32. Подробные описания конструирования плазмид рКС283 PRS и pL32 приведены в примере 6. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид рКС283 PRS и pL32 представлены на фиг.1.
Плазмида pNM789 была получена из NRRL в Е. coll K12, PV 308 (pNM789 под входящим номером В-18216. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмид pNM789 представлены на фиг.2. Плазмиду
pNM789 частично переваривали рестрикта- зой PVU II, полностью переваривали ре- стриктазой BamHI. а затем обрабатывали щелочной фосфатазой. Затем в переваренный, обработанный фосфатазой вектор
pNM789 лигировали новый PVU II - BamMI линкер с целью получения плазмиды 120. Затем плазмиду 120 полностью переваривали рестриктазами ХЬа и BamHI и выделяли 0,6 kb Xbal - BamHI EK-BGH-кодирующий
фрагмент рестрикции. Плазмиду pL32 также переваривали рестриктазами Xbal и BamHI и выделяли 3,9 kb фрагмента вектора. Затем во фрагмент 3.9 kb вектора плазмиды pL32 лигировали 0,6 kb Xbal - BamHI
фрагмента плазмиды 120 для получения плазмиды pL47. Подробные описания конструирования плазмид 120 и pL47 приводятся в примерах 6 и 7. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид 120 и pL47 представлены
соответственно на фиг.З и 4.
Плазмида pPR 12 содержит ген с 18157 термовосприимчивого pZ репрессиора, а плазмида рВ R 322 - ген, несущий устойчивость к тетрациклину. Плазмида р PR 12
раскрыта и заявлена в патенте США № 4436815, выданном 13 марта 1984 г. Сайт рестрикции и функциональная карта плгз- миды р PR12 представлены на фиг.4. Ecof. l- сайт удаляли из плазмиды pPR 12 путем.
первого полного переваривания плазмиды рестриктазой EcoR I с обработкой ф-том Кленова. Затем век гор рециркулизовали ли- гированием для образования плазмиды pBL12 ARI. Затем плазмиду рР R 12 ДК
переваривали рестриктазой AVal с обработкой ф-м Кленова. Переваренную AVal и обработанную ф-том Клечова плазмиду рР R 12 ARI затем лигировали в Eco RI-линкеры, разрезали рестриктазои Ecol, а затем рециркулизовали с целью получения плазмиды pPR 12A R I. Подробные описания конструирования плазмиды рР R I2A R 1 приводятся в примере 8. Сайт рестрикции и функциональная карта представлены на фиг.4.
л 2,9 kb Pstl - ECOR I фрагмента рестрикции плазмиды pP R 12A R I выделяли после первого переваривания плазмиды ре- сктриктазами Pstl и Eco R I, Плазмиду переваривали рестриктазами Pstl и BamHI, ил,2,6 kb Pstl-BamHI фрагмент рестрикции выделяли. При помощи отдельной реакции плазмиду pZ47 переваривали рестриктазами Eco R I и BamHI, а- 1,03 kb Eco R I - BamHI фрагмента выделяли. 2,7 kb Pstl- BamHI и 1,03 kb Eco R I - BamHI фрагмента ресктрикции плазмиды pL47 лигировали в 2,9 kb Pstl-EcoRI фрагмента рестрикции плазмиды pP R 12A R I с целью образования плазмиды . Подробное описание конструирования плазмиды pL110 приводится в примере 9, Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pL110 представлены на фиг.4.
Вектор типа ВК-энхансера, рассматриваемый в настоящем изобретении, содержит кассету ВК-энхансера и позднего промотора аденовируса, а также ген, несущий устойчивость к гидромицину, и мышиный ген дигидрофолат-редуктазы (dhbr). Использование ВК-вируса в соединении с поздним промотором аденовируса значительно способствует усилению транскрипции рекомбинатного гена в эукариотических клетках хозяина, Ген, несущий устойчивость к гидромицину, используется в эукариотических клетках хозяина в качестве отборочного маркера .Машинный ген дигидрофолат- редуктазы при соответствующих условиях амплифицируется в хромосоме хозяина. Эта амплификация, описанная в обзоре Schimke 1984, Cell 37:705-713, может также включать ДНК-последовательности, близко соприкасающиеся с dhfr геном. Этот dhfr ген является селектируемым маркером в dhfr отрицательных клетках и может быть использован для увеличения числа копий сегментов ДНК путем экспонирования клеток хозяина для увеличения уровней метот- рексата.
Плазмида pLPChd может быть использована для построения эукариотического вектора экспрессии для экспрессии нового антитела KSI/4, рассматриваемого в настоящем изобретении. Плазмида pLPChd содержит ген dhfr промотор аденовируса типа-2 и энхансер ВК-вируса. ВК-вирус, содержащий энхансер ВК-вируса, может быть закуплен или легко выделен в больших количествах так, как описано в примере 10. ВК-вирус также имеется в Американской коллекции типовых культур под входящим номером ATCCVR-837. Сайт рестрикции и функциональная карта ВК-вируса представлены на фиг.5.
ВК-вирусный геном комбинировали с частью плазмиды pdBPV. MMT пео с целью построения плазмиды рВК neol и рВК пео 2. Плазмида pdBPV-MMT пео размером около 5 15 kb, имеющаяся в АТСС под номером АТСС 37224, содержит репликон и ген / -лактомазы от плазмиды рВ R 322, промотор мышиного металлотионина, помещенного в целях стимуляции экспрессии
0 структурного гена, который кодирует фермент, несущий устойчивость к неомицину, и 8 kb ДНК бычьего вируса папилломы (BPV). Плазмиду pdBPV-MMTneo можно переваривать рестриктирующим фермен5 том BamHI для получения двух фрагментов: 8 kb фрагмента, содержащего BPV ДНК, и -1 kb фрагмента, содержащего другие последовательности, описанные выше, ВК-вирус имеет только один сайт рестрикции BamHI
0 и плазмиды рВК neol и рВК пео 2 конструировали путем лигирования 7 kb BamHI фрагмента рестрикции плазмиды pdBPV MMT пео в ДНК BamHI - линеаризованного ВК- вируса, Конструирование плазмид рВК пео
5 и рВК пео 2, которые отличаются только ориентацией дНК ВК-вируса, описано в примере 11. Плазмида рВК neol содержит - 2,1 kb фрагмента рестрикции Sall -Hindlll, тогда как плазмида рВК пео 2 содержите 1,0 kb
0 фрагмента рестрикции. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рВК neol представлены на фиг.5.
Каждая из плазмид рВК neol и рВК пео 2 содержит полный геном ВК-вируса, вклю5 чающий последовательность энхансера. поэтому являются ценными исходным материалом для вектора экспрессии настоящего изобретения. Вектор экспрессии, плазмида рВв cat, содержит последовательо ность ВК-энхансера в тандеме с поздним промотором аденовируса типа 2, помещенного для стимуляции экспрессии фермента хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT). Плазмида pSV2 cat служит в качестве подхо5 дящего источника САТ-гена и может быть взята из АТСС под входящим номером АТСС 37155. ДНК человеческого аденовируса типа 2 является коммерчески доступной и может быть взята из АТСС под номером
0 ATCCVR-2. Иллюстративную плазмиду pBZcat конструировали путем лигирования содержащего поздний промотор Accl-PVU II фрагмента рестрикции ДНК человеческого аденовируса типа 2 в ВСИ-линкеры с тупым
5 концом, которые соединяются только с PVU Il-концом Accl-PVU II фрагмента рестрикции. Полученный в результате фрагмент затем лигировали ,51 kb ACCI-PVU фрагмента рестрикции плазмиды pSV2cat с целью получения промежуточной плазмиды
pLPcat. Целевую плазмиду pBLcat конструировали из плазмиды pLPcat путем лигирования начала репликации и энхансер-содержаще- ro(A,1,28kb)Accl-PVU lf-фрагмента рестрикции ДНК ВК-вируса в л4,81 kb Accl-Stu фрагмента 5 рестрикции плазмиды pLPcat. Конструирование плазмиды pBLcat описано ниже в примере 12. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид pLPcat и pBLcat представлены на фиг.6. 10
Затем из плазмид рНС7, pSV2-dpt и pSV2 Р-глобина конструировали плазмиду pL133. Плазмида рНС7 содержит ДНК-последовательность, которая кодирует человеческий белок. С. Плазмида рНС7 может быть выде- 15 лена из Е. coll K12 RR1/ рН С7, которая имеется в NRRL под номером NRRL1-15926. Плазмиду рНС7 разрезали рестриказой Baml и выделяли лИ,25 kb фрагмента рестрикции. Затем добавляли линкеры и фраг- 20 мент разрезали рестриказами Apal и Hind II, а после этого выделяли / ,23 kb фрагмента рестрикции. Далее плазмиду рНС7 разрезали рестриказой PstAO.Se kb фрагмента ре- стриказы выделяли, добавляли линкеры, 25 фрагмент снова разрезали рестриктазами и выделял и 0,19 kb Apal-Bg II фрагмента рестрикции. Плазмиду pSV2 gpt (ATCC 37145) переваривали рестриктазами Hind III и Bg III и выде ляли 5,1 kb фрагмента. 1,23 kb 30 фрагмента рестрикции Hlndlll-Apal, 0,19 kb фрагмента Apal-Bg III и 5,1 kb фрагмента Hindlll-Bglll лигировали вместе для получения промежуточной плазмиды pSV 2-HPC8. Более подробное объяснение конструиро- 35 вания плазмиды psV2-HPC8 приводится в примере 13. Схема этого конструирования представлена на фиг,7.
Затем плазмиду pSV2-HPC8 разрезали рестриктазами Hindlll и Sail и выделяли 40 0,29 kb фрагмента рестрикции. Таким же образом разрезали также плазмиду pSV2- НРС8 рестриктазами Bg III и Sail и выделяли фрагмент рестрикции (,15 kb). Плазмиду pSV2- -глобин (NRRL B-15928) 45 разрезали рестриктазами Bg III и Hind III. выделяли 4,2 kb фрагмента рестрикции. Эти три фрагмента затем лигировали вместе с целью получения pL133.Плазмиду pLl J3 переваривали рестриктазой Hindlll, 50 затем обрабатывали щелочной фосфатазой. Плазмиду pBLcat также разрезали рестриктазой Hindlll и выделяли /0,87 kb фрагмента рестрикции. Этот фрагмент лигировали в вектор разрезанной Hindlll и обработанной 55 фосфатазой плазмиды pL133 с целью получения плазмиды pLPC. Так как фрагмент Hindlll плазмиды pBLcat может быть встав- .лен в плазмиду pL133 в двух ориентациях
следует отметить, что pLPC является плаз- мидой, где надлежащая ориентация обеспечивает 1 kb фрагмента Ndll - Stul. Плазмида pLPC подобно miasMHflepLI33 содержит эн- хансер, ранний и поздний промоторы, Т-анти- ген связывающие сайты и начало репликации SV40. Подробные протоколы конструирования плазмид pL133 и pLPC приведены в примерах 13 и 14. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид pL133 и pLPC представлены соответственно на фиг.7 и 8.
Элементы SV40, присутствующие на плазмиде pLPC, расположены слишком близко и трудно различимы. Связывание Т- антигена с Т-антигенсвязывающими сайтами, необходимое для SV40 репликации и применяемое для усиления транскрипции из SV40 позднего промотора, неожиданно имело подобное действие на ВК поздний промотор. Так как высокий уровень Т-анти- генстимулированной репликации плазмиды, содержащей SV40 начала репликации, является обычно летальным для клеток хозяина ни плазмида pLPC, ни плазмида pL133 не могут стабильно поддерживаться в качестве эписомных (экстрахромосомных) элементов в присутствии SV40 Т-антигена, а скорее эти две плазмиды должны интегрироваться в хромосомной ДНК-клетке хозяина для своего стабильного существования. Полная структура области ВК-энхансера полностью совпадает со структурой 40 для ВК-энхансера начала репликации, ранних и поздних промоторов и ВК-аналога Т-анти- генсвязывающих сайтов являются близко расположенными и поэтому трудно различимыми на ВК-вирусной ДНК. Однако при выращивании в присутствии ВК-Т-антигена плазмида, содержащая ВК начало репликации и Т-антигенсвязывающие сайти, не реплицируется до некоторого предела, который является летальным, и стабильно поддерживается в качестве эписомного элемента в клетке хозяина. Более того репликация, стимулированная Т-антигеном, может быть использована для увеличения числа копий вектора, содержащего ВН-начало репликаций, так, что если приложить давление отбора, большее число копий плазмиды, будет интегрироваться в хромосомную ДНК-клетки хозяина. Очевидно, вследствие сходных структурно-функциональных соотношений между ВК- и SV40 Т-антигенами и их соответствующих связывающих сайтов ВК-реплика- ция также стимулируется SV40 Т-антигеном.
Эписомное поддержание вектора экспрессии рекомбинантной ДНК не всегда является предпочтительным при интеграции в хромосому клетки хозяина. Однако из-за отсутствия селектируемого маркера, функционирующего в эукариотических клетках, идентификация стабильных эукариотических трансформантов плазмиды pLPC является затруднительной, если только плазмида pLPC не трансформируется совместно с другими плазмидами, содержащими селектируемый маркер. Следовательно, плазмида pLPC была модифицирована с целью получения производных плазмид, являющихся селектируемыми в эукариотических клетках хозяина. Это достигается лигированием плазмиды pLPC в часть плазмиды pSV2 hyg плазмиды, которая содержит ген, несущий устойчивость к гидромицину. Плазмида pSV2 hyg может быть получена из Северной региональной исследовательской лаборатории (NRRL), Пеория, 1 61640, под номером NRRL B-18039. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pSV2 hyg представлены на фиг.8. Плазмиду SV2 hyg переваривали ре- стриктазой BamHI, и выделяли 2,5 kB фрагмента ректрикции BamHI, который содержит полный ген, несущий устойчивость к гидромицину, затем обрабатывали ферментом Кленова (большой фрагмент, полученный при дроблении субтилизином Е. coli ДНК-полимеразы 1) и после этог,о лигировали в обработанные ферментом Кленова ч-5,82 kb Ndel-Stul фрагмента рестрикции плазмиды pLPC с целью получения плазмид pLPChyg 1 и pLPChyg 2. Плазмиды pLPChyg 1 и pLPChyg 2 отличаются между собой только ориентацией фрагмента, несущего устойчивость к гидромицину. Плазмида pLPChyg содержит 5,0 kb фрагмента Hindll, тогда как плазмида pLPChyg 2 содержит А. 1,0 kb фрагмента. Протокол конструирования для плазмид pLPChyg и pLPChyg 2 приводится в примере 15. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pLPChyg 1 представлены на фиг.8.
Затем конструировали плазмиду pBL32, которая содержит мышиный ген (dhfr) гид- рофолат-редуктазы. Плазмиду рТРА102 (NRRL В-15834) разрезали рестриктазой Ith III и выделяли 4,4 kb фрагмента ресктрик- ции. Этот фрагмент обрабатывали ферментом Кленова, добавляли линкеры и затем разрезали рестриктазами Hindlll - BamHI с целью получениял/2 kb фрагмента рестрикции, затем путем лигирования 288 п.о. Cla- l-EcoRI фрагмента рестрикции плазмиды рТРА102 в Cla I 7,.EcoR в разрезанный вектор рКС7. Плазмида рКС7 может быть получена из АТСС под номером АТСС 37083. Плазмиду рКС переваривали рестриктазами BamAI и Hindlll, затем лигировали kb фрагмента рестрикции плазмиды рТРА102, полученной выше, и получали плазмиду
рТРАЮЗ. Протокол конструирования плазмиды рТРАЮЗ приводится в примере 16А. Схема этого конструирования представлена на фиг.9.
5Плазмиду рТРАЮЗ разрезали рестриктазой Bglll, обрабатывали ферментом Кленова и добавляли линкеры Ndel. Затем эту смесь лигировали и получали плазмиду рТРАЮЗ der Ndel. Плазмиду pTPA103-der
0 Ndel разрезали рестриктазой и выделяли /l,4 kb фрагмента. Этот фрагмент обрабатывали ферментом Кленова, затем после добавления Нра линкеров разрезали рестриктазой EcoRI- 770 п.о. фрагмента, со5 держащего trp РО и аминоконцы ТРА, лигировали в EcoRI Smal переваренный вектор pu C19 и получали плазмиду ри C19TPAFE. Плазмиду pu C19TPAFE частично переваривали рестриктазой Hpal, затем полностью
0 разрезали рестриктазой BamHI. Полученные 3,42 kb Hpal-BamHI фрагмента рестрикции затем лигировали в 1.015 Scal-BamHI - фрагмент, полученный из плазмиды рТРАЮЗ и получали плазмиду
5 pBW25. Протокол конструирования плазмиды pBW25 приводится в примере 16В. Схема этой конструкции представлена на фиг.9. Плазмиду pBW25 разрезали рестриктазами Hindlll и EcoR I и полученные в резуль0 тате -810 п.о. фрагмента лигировали в Hind III - EcoR l-разрезанный фаг M13-mp8 (биолаборатории Новой Англии) и получали фаг PM8BW26. Затем на фаге pM8BW26 (при де- леции ДНК, кодирующей аминокислотные
5 остатки) осуществляли In vitro реакцию мутагенеза, в результате чего получали фаг PM8BW27. Фаг pM8BW27 разрезали рестриктазами Eco RI и Ndel и выделяли 560 п.о. фрагмента рестрикции. Затем синтези0 ровали 48 п.о. линкера Ndel - Xbal. Плазмиду рТРАЮЗ разрезали, рестриктазами Eco R I и BamHI и выделяли 689 п.о. фрагмента. Плазмиду pL 110, построенную по методу примера 9, частично переваривали рестрик5 тазой BamHI, затем полностью разрезали Xbal и выделяли 6 kB фрагмента, kb фрагмента вектора, 689 п.о. фрагмента плазмиды рТРАЮЗ, 560 п.о. фрагмента pM8BW27, и-48, п.о. линкера затем лигирова0 ли вместе, в результате чего получали плазмиду pBW28. Протокол конструирования плазмиды pBW28 приводится в примере 16С, Схема этой конструкции представлена на фиг. 10.
5Затем путем лигирования 2 kb Hind III Bg III фрагмента плазмиды pTRA103 в 4,2 kb Hind III - Bg III фрагмента плазмиды pSV2 - /5-глобин плазмиду pSV2 - dhfr (АТСС 37146) разрезали рестриктазой PVUM. После добавления BamHI линкеров в BamHI
разрезанную и обработанную фосфатазой плазмиду рТРА301 лигировали 1,9 kb фрагмента, несущего ген dhfr, в результате чего получали плазмиду рТРАЗОЗ. Плазмиду рТРАЗО разрезали рестриктазами EcoR I и Вд II и получали 2,7КЬ фрагмента. Плазмиду рТРАЗОЗ разрезали рестриктазами Hind III и EcoR I и получали 2340 п.о. фрагмента, содержащего ген dhfr. Плазмиду рТРАЗОЗ разрезали рестриктазами Hind 111 и Sst I и получали л 1,7 kb фрагмента. Плазмиду pBW28 разрезали рестриктазами Xholl и Sstl и получали 680 п.о. фрагмента. С целью получения плазмиды pBW32 лигировали вместе; 2,7 Eco R I - Вд II фрагмента плазмиды рТРА301, 2340 п.о. Hind III - Eco R I фрагмента плазмиды рТРАЗОЗ, 1,7 kb Hindlll - Sst I фрагмента плазмиды рТРАЗОЗ и 680 п.о. Xball - Sst I фрагмента плазмиды pBW28. Протокол конструирования плазмиды pBW32 приводится в примере 16D, Схема конструкции представлена на фиг.10.
у 1,9 kb BamHI dhfr ген содержащего фрагмента плазмиды pBW32 изолировали, обрабатывали ферментом Кленова и вставляли в частично Eco R I - переваренную плазмиду pLPC hygl с целью получения плазмид pLPChygl и pLPChd2. Плазмида pLPChygl содержит два сайта распознавания рестриктазы Eco R I; один в гене, несущем устройчивость к гидромицину, и один в последовательностях, происходящих от плазмиды РВР322. Фрагмент, содержащий ген dhfr вставляли в Eco R I сайт, расположенный в рВ R 322-производных последовательностях плазмиды pLPChygl, и получали плазмиды pLPChd 1 и pLphd 2. В целях раскрытия настоящего изобретения плазмиду pLPChd 1 обозначали как празмиду pLPChd. Сайт рестрикции м функциональная карта плазмиды pLPChd представлены на фиг. 11. Конструирование плазмид pLPChdl и pLPChd2, которые отличаются только ориентацией ДНК-сегмента, содержащего ген dhfr, описано в примере 17,
Затем путем трансформирования и повторного выделения плазмиды pLPChd при помощи dam-штамма Е. coll конструировали плазмиду phd. После этого плазмиду pLPCnd переваривали растриктазой Bell и рециркулизовали для получения плазмиды phd. Плазмида phd образовывалась от деле- ции экстра Bell линкеров, прицепленных при построении плазмиды pLPcat, и двух смежных Bell фрагментов рестрикции с общим размером около 1,45 kb от плазмиды pLPChd. ДНК, кодирующую полную кДНК, которая кодирует легкую цепь моноклональ- ногоантитела KSI/4, лигировали в плазмиду phd для получения вектора экспрессии pLKSL1100 п.о. Eco R I - фрагмента плазмиды рСКС2310 обрабатывали ферментом Кленова, лигировали в BamHI линкеры, а затем лигировали в Bell - переваренную плазмиду
phd. Подробные описания конструирования плазмид phd и pL-KSL приводятся в примерах 18 и 19. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды представлены на фиг.11.
0 Плазмида pH-KS является вектором настоящего изобретения, происходящим от плазмиды phd и плазмиды рС2А52. ,6 kb Eco R I -фрагмента плазмиды рС2А52 выделяли, обрабатывали ферментом Кленова и
5 соединяли с BamHI линкерами. Этот фрагмент содержит полную кДНК, которая кодирует тяжелую цепь моноклонального антитела KS 1/4. Затем этот фрагмент лигировали с Bell - переваренную плазмиду phd
0 с целью получения плазмиды экспрессии pH-KS. Плазмида pL-HD является вектором экспрессии, построенном из плазмиды phd и плазмиды СНКС2-18, который содержит ДНК, кодирующую производное вари5 абельной области легкой цепи KS1/4, связанной с постоянной областью легкой цепи человека. 1,3 kb Рпи Д II - Hind III фрагмента плазмиды СЕКС2-18 выделяли и обрабатывали ферментом Кленова. Затем
0 этот фрагмент лигировали в Bcll-переварен- ную, обработанную ферментом Кленова плазмиду phd, в результате чего получали плазмиду экспрессии pL-НД. Подробные описания конструирования плазмид рН S5 KS и pL-НД приводятся в примерах 20 и 21.
Плазмида pL-НД 2 является вектором
экспрессии, построенным из плазмиды phd
и плазмиды СНКС2-6, который содержит
ДНК, кодирующую природную последова0 тельность вариабельной области легкой цепи KS1/4, связанной с постоянной областью легкой цепи человека,1,3 kb Рпи ДИ - Hind HI фрагмента плазмиды СНКС2-18 выделяли и обрабатывали ферментом Кленова. Затем
5 этот фрагмент лигировали вВсИ-переварен- ную, Кленов - обработанную плазмиду phd, в результате чего гголучали плазмиду экспрессии pL-НД 2. Плазмиду рН 1-НД, которая содержит кДНК, кодирующую
0 вариабельную область тяжелой цепи антитела KS1/4, связанную с геномной ДНК, кодирующей постоянную область человеческого lgG1, конструировали из плазмиды phd и плазмиды СН2А5. Плазмиду СН2А5 перева5 ривали рестриктазой Eco R I, обрабатывали ферментом Кленова, а затем лигировали в BamHI-линкеры. Затем плазмиду переваривали растриктазой BamHI и выделяли-,7,4 kb фрагмента рестрикции. Этот фрагмент лигировали с Bell-переваренную плазмиду phd и
получали плазмиду экспрессии рН1-НД. Подробные описания конструирования плазмид pL-НД и рН 1-НД, приводятся соот- ветстенно в примерах 22 и 23.
Плазмиду рН2-НД, которая содержит кДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи KS 1 /4, связанную с геномной ДНК, кодирующей постоянную область человеческого lgG2, конструировали из плаз- миды phd и плазмиды CH2A51G2. Плазмиду CH2A51G2 переваривали рестриктазой Eco R I, обрабатывали ферментом Кленова, затем лигировали Bam HI линкеры. После этого плазмиду переваривали рестриктазой BamHI и выделяли ,1 kb фрагмента рестрикции. Этот фрагмент лигировали в Bcll- переваренную плазмиду phd в результате чего получали плазмиду экспрессии рН2- НД. Плазмиду рНЗ-НД. которая содержит кДНК; кодирующую вариабельную область тяжелой цепи KS1/4, связанную с геномной ДНК, кодирующей постоянную область человеческого lgG3, конструировали из плазмиды phd и плазмиды CH2A51G3. Плазмиду CH2A51G3 переваривали рестриктазой Есо R I, обрабатывали ферментом Кленова, а затем лигировали в BamHI линкеры. После этого, плазмиду переваривали рестриктазой BamHI и выделяли 7,4 kb фрагмента рестрикции. Этот фрагмент лигировали в Bell - переваренную плазмиду phd, в результате чего получали плазмиду экспрессии рНЗ-НД. Подробные описания конструирования плазмид рН2-НД и рНЗ-НД приводятся соответственно в примерах 24 и 25.
Плазмиду рН4-НД, которая содержит кДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи KS1/4, связанную с геномной ДНК, кодирующей постоянную область человеческого lgG4, конструировали из плазмиды phd и плазмиды СН2Ф51С4 Плазмиду CH2A51G4 переваривали рестриктазой EcoR1, обрабатывали ферментом Кленова, а затем лигировали в BamHI линкеры. После этого плазмиду переваривали рестриктазой BamHI и выделяли 6,4 kb фрагмента рестрикции. Этот фрагмент лигировали в Bell - переваренную плазмиду phd, в результате чего получали плазмиду экспрессии рН4-НД. Более подробные описания конструирования плазмиды приводятся в примере 26.
Настоящее изобретение не ограничивается использованием конкретных эукариоти- ческих промоторов, представленных в изобретении. Другие промоторы, например промоторы гомологичногно или гетерологич- ного иммуноглобулина, поздний промотор SV40 или промоторы от эукартиотических генов, в частности от экстроген-индуцируемого гена циплячьего яичного альбумина, гена интерферона, глюкокортикоид-индуцируемо- го гена тирозин-аминотрансферазы. главного раннего гена аденовируса и раннего промо- 5 тора SV40, могут быть легко выделены и модифицированы для использования на векторах экспрессии рекомбинантной ДНК, построенных для получения антител в эукари- отических клетках хозяина. Эукариотические
0 промоторы могут быть также использованы в совокупности в целях стимулирования таких антител. Кроме того, известно большое количество ретровирусов, инфецирующих широкий ряд эукариотических клеток хозяина.
5 Длинные концевые дупликации в ДНК ретро- вирусов часто кодируют активность промотора и могут быть использованы вместо позднего промотора ВК-энхансераденовиру- са, описанного выше, в целях экспрессии ан0 титела KS1/4 и его производных. Настоящее изобретение также не ограничивается приведенными селектируемыми маркерами на описанных плазмидах. Существует большое разнообразие селектируемых маркеров для
5 эукариотических клеток и прокэриотических клеток, которые являются пригодными для использования при клонировании рекомбинантной ДНК или вектора экспрессии, содержащего ДНК-соединение или
0 последовательность настоящего изобретения. Различные векторы экспрессии могут быть трансформированы и экспрессирова- ны в целый ряд эукариотических клеток хозяина, в частности клеток млекопитающих.
5 Векторы экспрессии содержат также последовательности, которые получают для репликации в E.coli, так как более эффективно получать ДНК плазмиды в E.coli, чем в других клетках хозяина. Экспрессия антител
0 происходит в клетках хозяина, в которых конкретный промотор, ассоциированный с антителом, является функцией структурного гена. Для специалистов очевидно, что ряд эукариотических клеток хозяина может
5 быть использован для экспрессии различных антител при использовании позднего промотора ВК-энхансера-аденовируса, поскольку клетка хозяина экспрессирует продукт непосредственно раннего гена вируса
0 ДНК. Так как продукт непосредственно раннего гена может быть введен в клетки хозяина многими способами, например трансформация плазмидой или другим вектором, практически любая эукариотическая
5 клетка может быть использована в настоящем способе. Предпочтительными клетками хозяина в способе настоящего изобретения являются клетки человека, так как человеческие клетки являются естественными хозяевами для ВК-вируса и могут заключать
клеточные факторы, которые служат для стимуляции ВК-энхансера. Хотя человеческие клетки могут быть использованы в качестве клеток хозяина, линия 12 - трансформированных клеток Syrian Hamster аденовируса AV12, которые экспрессируют гена Е1А, является наиболее предпочтительной и имеется в Американской коллекции типовых культур в Роквилле, шт. Мэриленд, под входящим номером АТСС С RL9595 (депонирована 24 ноября 1987 г.). Стандартная процедура трансформации описана подробно в примере 27.
При трансформации вектором экспрессии, кодирующим тяжелую цепь иммуноглобулина, AV12 клетки выделяют обработанную тяжелую цепи в супернатанте. Однако AV12 клетки,-трансформированные вектором экспрессии, кодирующим легкую цепь, не выделяют указанную легкую цепь, если только эти клетки не являются также трансформированными вектором экспрессии, кодирующим тяжелую цепь. Способ выделения клонов, экспрессирующих различные иммуноглобулинов настоящего изобретения, описан в примере28. Функциональные К51/4и производные KS1/4 могут быть очищены от супер- натанта клеток AV12, которые являются трансформированными совместно векторами, кодирующими легкую и тяжелую цепи. Таким образом, путем подбора и смешивания различных легких и тяжелых цепей настоящего изобретения можно получить множество вариантов KS1/4.
Экспрессия молекул иммуноглобулина с легкой и тяжелой цепью в нелимфоидной системе имеет значительное преимущество по сравнению с лимфоидными системами. Обычно моноклональные антитела выделяются и очищаются от лимфоидных систем, например миело-мные и гибридомные клетки. Такие клетки часто экспрессируют значительное количество гетерогенных антител. Это явление объясняется тем, что лимфоидные клетки являются естественными секретерами антител. При трансформации посредством ДНК, кодирующей отдельные антитела или слияния с другими клетками, продуцирующими различные антитела, эти лимфоидные клетки иногда становятся двойными секретерами. Клеточные линии с двойной секрецией производят много антител с гибридноймолекулярной структурой, большая популяция которых является нежелательной. Эти нежелательные гибриды должны затем отделяться от целевого продукта с использованием дорогой и занимающей много времени технологии. Способ настоящего изобретения устраняет эту проблему путем использования нелимфоидных клеток, которые не секретируют молекул антител естественным образом. Поэтому, целевым гомогенным продуктом являются только антитела, которые секретируются в супернатанте.
Возможны много модификаций и вариантов рассматриваемых в настоящем изобретении последовательностей ДНК и плазмид. Например, деградация генетиче0 ского кода корректируется заменой нуклеоти- дов на протяжении областей, кодирующих полипептиды, а также заменой, например, ТАС или ТСА-трансляционных стоп-сигна- АТСACT
5 лов на ТАА - трансляционный стоп-сигнал.
АТТ
Такие последовательности могут быть получены из ныне известных аминокислотной или ДНК-последовательности антитела
0 KS1 /4 и могут быть сконструированы в соответствии со стандартными синтетическими методами. Такие синтетические методы могут быть выполнены в соответствии с методикой Itakura et al 1977; Science 198:1956 и
5 Crea et al., 1978, Proc.Nat.Acad. Scl USA 75:5765. Кроме того, синтетические гены и линкеры могут быть синтезированы также с использованием синтезатора ДНК (Systec 1450А Systec Inc, 3816 Chaulder Drleve,
0 Minneapolis, MN) или синтезатор ABS380A (Applied Blpsystems Inc, 50 Zlucolu Center Drive, Forsber City CA 94404). Существуют также и многие другие синтезаторы ДНК, которые также могут быть использованы для
5 синтеза ДНК-фрагментов. Поэтому настоящее изобретение не может быть ограничено ДНК-последовательностями и плазмидами, представленными в настоящем описании в качестве примеров.
0 Специалистам в данной области нетрудно понять, что векторы экспрессии настоящего изобретения используются для трансформации эукариотических клеток хозяина так, чтобы1 полипептиДы с различными
5 структурами легкой и тяжелой цепей экс- прессировались клеткой хозяина. Если клетка хозяина трансформируется вектрром, содержащим промотор, который функционирует в этой клетке хозяина и стимулирует
0 транскрипцию структурных генов иммуноглобулина, и если эта клетка хозяина обладает клеточным механизмом для обработки сигнальных пептидов, то зрелые антитела или цепи антител вырабатываются клетка5 ми. При других условиях экспрессии, когда только легкие цепи иммуноглобулина экс- прессируются клеткой хозяина, эти легкие цепи должны быть выделены из клетки хозяина. Как установлено выше, векторы, методы, трансформированные клетки и антитела, рассматриваемые в настоящем изобретении, могут быть весьма эффективными в борьбе против рака. Моноклональное антитело KS1/4 является эффективным агентом в диагностике, прогнозе и лечении адено- карциномы у Bumol In Relsfeld, R.A. и Sell S eds Monoclonal Antibodies and Cancer therapy, New York Alan R.Liss Inc. 1985,257- 259. Spearman et al., 1987, I.Pharmacol and Exp. Therap. 241:695-703, данные которых вводятся в настоящее описание посредством ссылки, раскрывают использование коньюгата; моноклональное антитело-вин- каалкалоид в распознавании локализации и лечении опухолей. Это KS1/4 - DAVL В (4- дезацитилвинобластин) - коньюгат вызывает также супрессию опухолевого роста, как описано Bumol et al. In Ceriani, R.L. ed Immunologie Approaches to the Diagnosis and Therapy of Breast Cancer, New York and London; Plenum Press 1987, 205-215, данные которых вводятся в описание настоящего изобретения посредством ссылки. Биохимические и иммунологические исследования показали, что рекомбинантные и химерные молекулы KS1/4 настоящего изобретения обладают такой же антигенной ре- активностью, как и молекулы KS1/4, происходящие из клеток гибридомы.
Однако использование мышиных антител имеет тот недостаток, что указанные антитела часто вызывают неправильный иммунологический ответ в организме человека. Это наблюдалось у некоторых пациентов, лечащихся KS1/4. Этот недостаток можно устранить, если использовать химерные антитела настоящего изобретения, Если заменить постоянные области антитела KS1/4 постоянными областями человеческого происхождения, иммунная система пациента распознает химерное антитело как свое и поэтому вырабатывает меньше анти-К51 /4 антител. Более того использование человеческих постоянных областей способствует активации комлемента и других клеточных ответов.
Специалистам в данной области также нетрудно понять, что неизвестные до сих пор аминокислотные и ДНК-последовательности KS1/4 могут быть использованы для создания новых производных с высокой или низкой степенью сродства.Различные части антитела могут быть подвергнуты делеции или мутации для создания новых антител или же части одной цепи могут быть заменены участками другой цепи. Рентгеновское кристаллографическое исследование показывает, какие именно аминокислотные остатки антитела появились в непосредственной близости аминокислотными остатками антигена, с которым связывается антитело KS1 /4. Используя белковую инженерию, антитело KS1/4 можно модифицировать для получения негативных остатков около пози- 5 тивных остатков на антигене. Такие сконструированные антитела затем отображают модифицированное родство к поверхностному антигену клетки у больных раком.
Приведенные ниже примеры иллюстри0 руют осуществление настоящего изобретения. В этих примерах даются описания способов конструирования объектов настоящего изобретения и объяснения к ним, там, где это целесообразно.
5
П р и м е р 1. Выделение плазмиды рКС283.
Лиофилы Е. coll K12 ВЕ1201 /рКС283 были взяты из Северной региональной иссле0 довательской лаборатории, Пеория, Иллинойс 61604, под номером NRRL В- 15830. Эти лиофилы сливали в пробирки, содержащие 10 мл LB-среды (10 г бактот- риптона, бактодрожжевого экстракта и 10 г
5 NaCI на литр; рН доведен до 7,5) и инкубировали в течение 2 ч при 32°С, после чего культуру помещали в 50 мкг/мл ампициллина и инкубировали при 32°С в течение ночи. Клетки Е. coll K12 ВЕ1201/рКС 2283 культи0 вировали при 32°С, так как эти клетки содержат ген термовосприимчивого с L репрессора, интегрированный в клеточной ДНК. Если клетки, которые содержат ген дикого типа лямбда pL-penpeccopa или не
5 содержат лямбда pL-промотор, используются в процессе выделения плазмиды, как описано в нижеследующих примерах, температура инкубации равна 37°С.
Небольшую часть ночной культуры по0 мещали в чашки с.1 В-агаром (LB-среда с 15 г/л бактоагара), содержание 50 мкг/мл ампициллина для получения одноколониевого изолята Е. coli К 12 ВЕ1201/Р С283. Полученную одноколониевую культуру инокули5 ровали в 10 мл LB-среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, и инкубировали в течение ночи при 32°С при энергичном встряхивании.10 мп ночной культуры инокулировали в 50 мл LB-среды, содержа0 щей 50 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 32°С энергично встряхивая при этом до тех пор, пока культура не достигнет стационарной фазы.
Последующая методика была заимство5 вана из работы Manlallsetal. 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor-laboratory).
Урожай клеток собирали при помощи центрифугирования при 400 г за 10 мин при 4°С, а супернатант отбрасывали. Клеточный осадок промывали в 100 мл охлажденного
льдом STE-буфера (0,1М NaCI 10 мМ трис- HCI, рН 7,8 и 1 мМ ЭДТК). После промывания клеточный осадок ресуспендировали в 10 мл раствора 1 (50 мМ глюкозы; 25 мМ трис-HCI, рН 8 и 10 мМ ЭДТК), содержащего 5 мг/мл лизоцима, и оставляли на 10 мин при комнатной температуре, 20 мл раствора 2 (0,2 н. NaOH и 1 % ДДС), затем добавляли к клеткам, обработанным лизоцимом, и полученный раствор осторожно смешивали путем инверсии. Эту смесь инкубировали на льду в течение 10 мин.
К смеси лизированных клеток добавляли 15 мл охлажденного льдом 5 мМ ацетата калия, рН 4,8 и раствор смешивали инверсией. Полученный раствор инкубировали на льду в течение 10 мин. 5 М раствор ацетата калия изготовляли путем добавления 11,5 мл деляной уксусной кислоты к 28,5 мл воды и 60 мл 5М ацетата калия; полученный раствор имел соотношение: ЗМ относительно калия и 5М относительно ацетата.
Смесь лизированных клеток центрифугировали в аппарате Beckman SW27 (или его эквиваленте) при 4°С со скоростью 20000 об/мин, в течение 20 мин. На дне пробирки образуется осадок из клеток ДНК и продукта распада клеток. Около 36 мл супернатан- та восстанавливали и добавляли 0,6 объема изопропанола, смешивали и полученный в результате раствор оставляли при комнатной температуре н а 15 мин, Плазмидную ДНК собирали при помощи центрифугирования при 12000 г за 30 мин при комнатной температуре. Супернатант отбрасывали, а осадок ДНК промывали 70% этанола при комнатной температуре. Затем этанол сливали, а остаток высушивали в вакуумном испарителе. Затем осадок ресуспендировали в 8 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCI, рН 8 и 1 мМ ЭДТК).
К раствору ДНК добавляли 8 г CSCI. На каждые 10 мл CSCI - ДНК-раствора добавляли около 0,8 мл 10 мг/мл раствора бромида этидия в воде. Конечная плотность раствора составляла около 1,55 г/мл, а концентрация бромида этидия составляла около 600 мг/мл. Раствор помещали в пробирку центрифуги Beckman типа 50, которую наполняли до краев парафиновым маслом, герметично закрывали и центрифугировали при 40000 об/мин в течение 24 ч при 20°С. После центрифугирования визуально прослеживались две полосы ДНК. После удаления крышки из пробирки нижнюю полосу ДНК удаляли при помощи шприца с иглой (#21) для подкожных инъекций, введенной через боковую сторону пробирки центрифуги.
Бромид этидия удаляли путем многократного экстрагирования водонасыщенным 1-бутанолом, CSCI удаляли посредством диализа против ТЕ-буфера. После экстрагирования буферным фенолом, а затем хлороформом, ДНК осаждали, промывали
70%-ым этанолом и высушивали. После чего получали 1 мг плазмиды рКС283, которую хранили при 4°С в ТЕ-буфере с концентрацией около 1 мкг/мкл. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рКС283
представлены на фиг.1.
П р и м е р 2. Конструирование плазмиды рКС283РХ. ,
Около 10 мкм ДНК плазмиды рКС283,
полученной в примере 1, смешивали с 20 мкл 10-кратного солевого буфера рестрикции (500 мМ NaCI, 100 мМ трис-HCI, рН 7.5, 100 мМ MgCI2 и 10 мМ ДТТ), 20 мкл 1 мг/мл БСА. 5 мкл рестриктазы PVU II (50 ед., как
определено Bethesda Research Laboratorla BRL, где были получены все рестриктирую- щие ферменты) и 145 мкл воды, полученную в результате реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Реакции рестрикции, описываемые в настоящем изобретении, обычно заканчиваются экстрагированием фенолом и затем хлороформом с последующей преципитацией ДНК, промывкой этанолом и ресуспендированием ДНК в ТЕ-буфере. После переваривания PVUII, как описано выше, PVU - переваренная ДНК плазмиды рКС283 осаждали, затем ресуспендироеали в 5 мкл ТЕ- буфера.
Около 600 пикомолей (рМ) Xhol линкеров (5 - ССТ CGA GC-31 ) киназировали в смеси, содержащей 10 мкл 5-кратного ки- назного буфера (300 мМ трис-HCI, рН 7,8,50 мМ MgCl2, 25 мМ ДТТ), 5 мкл 5 мМ АТФ, 24
мкл Н20, 0,5 мкл Т4 полинуклеотидкиназы (около 2,5 ед. как определялось при помощи P-L-биохишческого анализа). 5 мкл 1 мг/мл БСА и 5 мкл 10 мМ спермидина путем инкубирования смеси в течение 30 мин при 37°С.
К 5 мкл ДНК PVUH-переваренной плазмиды рКС283 добавляли около 12,5 мкл ки- назированных Xhol линкеров, затем 2,5 мкл 10-кратного лигазного буфера (300 мМ т рис- HCI, рН 7,6; 100 мМ и 50 мМ ДТТ), 2,5 мкл 1
мг/мл БСА, 7 мкл 5 мМ АТФ, 2,5 мкл (около 2,5 ед. как определено P-L-биохим. анализом) Т4 ДНК-лигазы, 2,5 мкм 10 мМ спермидина и 3 мкл воды добавляли к ДНК. Полученную в результате реакцию лигирования инкубировали в течение ночи при 4°С. После реакции лигирования реакционную смесь корректировали до состава высокосолевого буфера (0,1 М NaCI; 0,05 М трис-HCI; рН 7,5; 10,0 мМ MgClz и 1 мМ ДТТ). Затем в смесь добавляли около 10 мкл (100 ед.) рестриктазы Xhol и полученную реакционную смесь инкубировали в течение 2 ч при 37°С, По окончании реакции и преципитации Xhol-переваренной ДНК последнюю ресус- пендировали и лигировали, как было описано выше, за исключением того, что в смесь лигирования Xhol-линкеры не добавлялись, Лигированная ДНК образовывала желаемую плазмиду рКС283РХ. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рКС283РХ представлены на фиг.1.
П р и м е р 3. Конструирование Е, coll К12 МО (Я+)/рКС283РХ.
E.coli K12 МО (Я ) может быть получен из Северной региональной исследовательской лаборатории влиофилизированном виде под номером NRRL В-15993. Е. coll K12
МО (Я ) содержит ген дикого типа лямбда р L с1-репрессора для того, чтобы транскрипция от гибридного pL-Lpp-промотра настоящего изобретения не происходила в
клетках Е. coll K12 МО (Я ) , Лиофилы восстанавливали, одиночные колонии изолировали, затем приготовляли 10 мл ночной
культуры МО (Я ) - клеток в соответствии с методикой, описанной в примере 1, за исключением того, что температура инкубирования составляла 37°С и в среде роста ампициллин не использовали,
Для инокуляции 5 мл LB-среды, содержащей также 10 мМ MgSO-i и 10 мМ MgCl2, использовали 50 мкл ночной культуры. Культуру инкубировали в течение ночи при 37°С с интенсивным встряхиванием. На следующее утро культуру разбавляли до 200 LB- средой, содержащей 10 мМ MgS04 и 10 мМ MgCl2. Разбавленную культуру инкубировали при 37°С, интенсивно встряхивая до тех пор, пока оптическая плотность при 550 нм (Asso) не достигнет величины около 0,5, которая соответствует клеточной плотности около 1х108 кл./мл. Затем культуру охлаждали в течение 10 мин в ледяной бане, а клетки собирали путем центрифугирования при 4000 г за 10 мин при 4°С. Клеточный осадок ресуспендировали в 100 мл охлажденного 10 мМ MgS04, а затем тот же час снова осаждали путем центрифугирования. Клеточный осадок ресуспендировали в 100 мл 30 мМ CaCl2 и инкубировали на льду в течение 20 мин.
Эти клетки снова собирали путем центрифугирования и ресуспендировали в 10 мл 30 мМ CaCIa 1 /2 мл аликвоты клеток добавляли кхлегированной ДНК, приготовленной в соответствии с описанием в примере 2; эту ДНК смешивали с 30 мМ СаС12. Смесь клеток с ДНК инкубировали на льду в течение часа, затем резко повышали температуру до 42°С в течение 90 с, а затем охлаждали на льду в течение 2 мин. Клеточную ДНК-смесь
5 разбавляли в 10 мл LB-среды в 125 мл флаконах и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. 100 мкл аликвот высеивали на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин и инкубировали при 37°С до тех пор, пока не
0 появлялись колонии.
Эти колонии культивировали отдельно и плазмидную ДНК отдельных колоний подвергали анализу рестриктирующими фер- . ментами и гельэлектрофорезу. Выделение
5 плазмидной ДНК осуществляли в меньшем масштабе в соответствии с методикой, описанной в примере 1, но стадию градиента CSCI пропускали до тех пор, пока не было проведена индентификация трансформан0 тов Е. coli K12 МО (Я+) /рКС283РХ. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рКС283 РХ. Сайт рестрикции и функци- ональная карта плазмиды рКС283Х представлены на фиг.1.
О
П р и м е р 4. Конструирование Е. coli
К12МО (Я+)/pKC283-L.
10 мг ДНК плазмиды рКС283РХ, изго0 товленной в соответствии с методикой, описанной в примере 1, растворяли в 20 мкл 10-кратного высокосолевого буфера, 20 мкл 1 мг/мл БСА, 5 мкл («SO ед.) рестриктазы Вд III,5 мкл (-50 ед.) рестриктазы Xhol и 150 мкл
5 воды и полученную реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Затем реакцию прекращали и после преципитации Bglll-Xhol-переваренной ДНК последнюю ресуспендировали в 5 мкл ТЕ-буфера.
0 ДНК-линкера с признаками расщепления рестриктазами BgMI и Xhol и с концами однонитевой ДНК синтезировали и кинази- ровали. Линкер киназировали в основном в соответствии с методикой, описанной в при5 мере 2.
ДНК - линкер имеет следующую структуру:
5- GATCTA ТТА ACT CAA ГСТАС АС - 3
3 - AT/, ATT САС ТТА cAt CTG AGCT - 5 Линкер, изображенный выше, синтезировали из однонитиевых деоксиолигонуклео- тидов по известной специалистам методике. Однонитиевые деоксиолигонуклеотиды могут быть синтезированы при помощи коммерчески приемлемой аппаратуры, как. например, 380А ДНК-синтезатора, маркированный Applied Blosystem (850 Lincoln CenterDrlve, Foster City, CA 94404), с использованием фос- форамидатов. Известны также и другие способы синтеза ДНК. Стандартный модифицированный способ синтеза однонитевой ДНК при помощи фосфотриэфира описан в Itakura et al., 1977, Science 198:1056 и в Сгеа etal., 1978. Proc. Nat. ACad. Scl USA 75:5765. Кроме того, особенно предпочтительный способ синтеза ДНК описан в Aslnng et al., 1983, Nucleic Acid Research II: 3227 и Harany etal., 1980, Methods In Enzymology 68:90.
Линкер и Bg III - Xho I переваренную плазмиду рКС283Х лигировали в соответствии с методикой, описанной в примере 2. Лигированная ДНК образовывала целевую плазмиду pKC283-L Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды, p«C283-L представлены на рис.1 ДНК плазмиды, PKC283-L использовали для трансформации
Е. coll K12 МО (А+) и полученные в результате трансформаты Е. coll K12 МО
(A )/pKC283-L были индентифицированы в соответствии с методикой, описанной в примере 3.
П р и м е р 5. Конструирование Е. coll
К12 МО () /pKC283-L В.
Около 10 мкг плазмидной pKC283-Z ДНК, полученной в соответствии с методикой , описанной в примере 1, растворяли в 20 мкл 10-кратного высокосолевого буфера, 20 мкл 1 мг/мл БСА, 5 мкл (-50 ед.) рестрик- тазы Xho I и 155 мкл Н20, полученную в результате реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Затем Xho I - переваренную плазмиду рКС283-1 -ДНК осаждали из реакционной смеси путем добавления трех объемов 95% этанола и 1/10 объема ЗМ ацетата натрия, инкубированием в сухой бане из льда и этанола в течение 5 мин и центрифугированием. Полученный ДНК-осадок промывали 70% этанола, высушивали и ресуспендировали в 2 мкл 10-кратного ник-трансляционного буфера (0,5 М трис-HCI, рН 7,2, 0,1 мМ MgSOi, и 1 мМ ДТТ), 1 мкл раствора 2 мМ в каждом из деоксинуклеотид-трифосфатов, 15 мкл Н20, 1 мкл (6 ед. как определено Р-1 биохимическим анализом) фермента Кленова, который является большим фрагментом Е. coll ДНК-полимеразы, 1, и 1 мг/мл БСА. Полученную в результате реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин при 25°С. затем реакцию прекращали путем инкубирования этого раствора при 70°С в течение 5 мин.
ВатН1 линкеры (5- CGGGATCCCC - 3) киназировали и сшивали с Xhol-переварен- ной Кленов-обработанной плазмидной рКС283-1 ДНК в соответствии с методикой, описанной в примере 2. После реакции лигирования указанную ДНК переваривали -100 единицами BamHI в течение 2 ч при 37°С в высокосолевом буфере. После BamHI переваривания указанную ДНК изготавливали для лигирования в соответствии с методикой, описанной в примере 2.
л 5,9 kb фрагмента рестрикции BamHI циркуляризовали путем лигирования и трансформировали в E.collK 2 МО (А ) всоответствии с методикой, описанной в примерах 2
и 3. Е. coll K12 МО (А+)/рКС283-1В-транс- форманты идентифицировали, а затем в соответствии с методикой, описанной в примере 1, изготавливали плазмидную рКС293-2В-ДН. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pKC283-LB представлены на фиг.1.
Примерб. Конструирование Е. coll
К12МО(А+)/р32.
Около 10 мкг плазмиды рКС283РХ переваривали рестриктазой Sail в высокосолевом буфере, обрабатывали ферментом
Кленова и сшивали с Eco R (-линкерами (51 - CAGGAATTCCTC - 3) в соответствии с методикой, описанной в примере 5, с тем лишь исключением, что в данном примере используются другие исходные материалы,
рестриктазы и линкеры. После переваривания рестриктазой Eco R I, в результате чего вырезалось 2,1 kb ДНК, 4,0 kb Eco R I фрагмента рестрикции циркуляризовали путем лигировакия с полученной плазмидой
рКС283РР. Лигированную ДНК использовали для трансформации Е. coll K12 МО (А ) в соответствии с методикой, описанной в примере 3. После идентификации Е. coll K12 МО
(A )/pKC283PRS трансформантов, в соответствии с методикой, описанной в примере 3, изготавливали плазмиду рКС283Р RS - ДНК. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рКС 283Р RS представлены
на фиг.1 приложенных иллюстраций.
Около 10 мкг плазмиды рКС283Р RS переваривали в 200 мкл высокосолевого буфера каждой из рестриктаз (около 50 ед.) Pst и Sph I. После инкубирования реакционной
смеси в течение 2 ч при 37°С, реакционную смесь подвергали электрофорезу на 6% низкотемпературном агарозном геле (FMC Corporation, Marine Colloids-Division Rockland) в течение 2-3 ч U 75 мА
в трис-ацетатном буфере.
Указанный гель окрашивали в разбавленном растворе бромистого этидия и полосу ДНК. составляющую 0,85 kb Pstl-Sphl фрагмента рестрикции, который визуалиро- вали длинноволновым УФ-излучением, вырезали из геля в небольшом сегменте. Объем сегмента определяли по весу и плотности сегмента и в пробирку, содержащую данный сегмент, добавляли такой же объем 10 мМ Трис-HCI: рН 7,6, Затем этот сегмент рас- плавляли путем инкубирования при 72°С. В объеме около 1 мкл получали 1 мкг 0,85 kb Pstl-Sphl фрагментов ресктрикции плазми- ды рКС283Р RS. Аналогичным способом Pstl и Sphl - рестриктазами переваривали плаз- миду рКС283 - В, полученные в результате рестрикции А 3,0 kb фрагмент изолировали при помощи электрофореза на агарозном геле и готовили для лигирования,
л 0,85 kb Pstl-Sphl фрагмента рестрик- ции плазмиды рКС283 Р RS сшивали ,0 kb Pstl-Sphl - фрагмента рестрикции плазмиды рКС283 - LB в соответствии с методи- кой, описанной в примере 2. Легированная ДНК составляла целевую плазмиду . Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pL32 представлены на фиг.1. Плазмиду трансформировали в Е. coli К12 МО (Я+) - клетках в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Плазмид- ную pL32 - ДНК получали из Е. coli K12 МО (А+)/р1 32-трансформаторов в соответствии с методикой, описанной в примере 1. Ана-. лиз плазмидной р 32-ДНК показал, что обработанный ферментом Кленова Sail-концы плазмиды рКС283РХ сцеплены с более чем одним Eco R I - линкером. Присутствие более одного Eco R 1-линкера нежелательно для плазмиды или производных плазмиды pL32 и может быть обнаружено по присутствию Xhol-сайта рестрикции, который образуется всегда, когда два Eco R I- линкера сшиваются вместе. Альтернативно, плазмида может быть построена путем Sail - Eco R l-вырезания и лигирования, выполненных в соответствии с описанием в первом абзаце настоящего примера по отношению к плазмиде pKC283-LB.
Пример. Конструирование Е. coli К12 МО (A+)/pL47.
Е, coll K12 RV 308-pNM789 может быть получен из Северной Региональной исследовательской лаборатории в лиофилизиро- ванном виде под номером NRRL В-182216. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pNM789 представлены на фиг.2, Плазмидную ДНК извлекали из культуры в соответствии с методикой, описанной в примере 1, за исключением того, что температу- ра инкубирования составляет 37°С. 10 мкг pNM789 суспендировали в 200 мкл PVUII- буфере(50мМтрис-НС1, рН 7,5; 60 мМ NaCI и 6 мМ MgCte). Затем добавляли 1 ед. PVUII
и реакционную смесь инкубировали в течение 5 мин при 37°С. Фермент инактифиро- вали путем нагревания при 65°С в течение 10 мин. Затем добавляли 30 мкл 10-кратного BamHI - буфера (200 мМ трис-HCI, рН 8; 1 М NaCI и 70 мМ MgCIa). 70 мкл Н20 и 10 ед. BamHI и реакцию инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После этого добавляли 5 ед. алкалин-фосфатазы и смесь инкубировали в течение 1 ч при 65°С. ДНК-фрагменты отделяли на 1 % агарозном геле и один отрезанный фрагмент (фиг.З) очищали.
ДНК-линкер с тупым концом и с Bamll - концом синтезировали в соответствии с методикой, описанной в примере 4. Этот линкер (показан на фиг.З) имеет следующую структуру:
5 -CTGTGCCTTCTAG-3 3 -GACACGGAACATCCTAG - 5 Этот линкер киназировали и лигировали в BamHI-PVUII - переваренную плазмиду pNM789 в соответствии с методикой, описанной в примере 2. Указанную смесь лигирования использовали для трансформации клеток Е. coli K12 RV 308 и после трансформации плазмиду выделяли по способу, описанному в примере 3. Затем отбирали несколько плазмид, которые содержали PVUII - фрагмент (494 п.о.) и Xhoal - BamHI фрагмент (628 п.о,). Последовательность, состоящую по меньшей мере из двух этих фрагментов, определяли секвенированием от BamHI - сайта по направлению к специфическому Smal-сайту, а затем отбирали один клон с нужной последовательностью. Эту промежуточную плазмиду обозначали плаз- мидой 120. Схематическое описание этой процедуры, сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды 120 представлены на фиг.З приложенных иллюстраций.
В целях изолирования EK-BGH-кодиру- ющей ДНК около 10 мкг плазмиды 120 переваривали в 200 мкл высокосолевого буфера, содержащего около 50 ед. каждого из Хва l-Bam рестриктаз. Продукты переваривания отделяли при помощи электрофореза на гарозном геле, .б kb Хва l-BamHi-фраг- мента рестрикций, кодирующих EK-BGH, выделяли и приготовляли для лигирования в соответствии с.методикой, описанной в примере 6.
Плазмиду pL32 также переваривали рестриктазами Xhal и BamHI и выделяли 3,9 ks фрагмента рестрикции, который использовали для лигирования. -ч, 3,9 kb BamHI-фрагмента рестрикции плазмиды pL32 лигировали с- 0,6 Xeal-BamHI-фраг- мента рестрикции плазмиды 120 по способу, описанному в примере 2, и получали плазмиду pL47. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pL47 представлены на фиг.4. Плазмиду pL47 трансформировали в Е. coll K12 МО (А+) в соответствии с методикой, описанной в примере 3, и Е. coll К12 МО (Я+) /pL47 - трансформанты идентифицировали. Плазмидную pL-47-ДНК получали из этих трансформантов в соответствии с методом, описанным в примере 1.
П р и м е р 8. Конструирование Е. coll K12RV308/pPR12ARI.
Плазмида рР R 12 содержит с 1857-ген термовосприимчивого pL-penpeccopa. а плазмида pBL322 содержит ген. несущий устойчивость к тетраклину. Плазмида рР R 12 раскрыта и заявлена в патенте США № 44368Т5. выданном 13 марта 1984 г. Сайт рестрикции и функциональная карта представлены на фиг.4.
Около 20 мкг плазмиды рР R 12 переваривали 50 ед. рестриктазы Eco R I в 200 мкл высокосолевого буфера в течение 2 ч при 37°С. ДНК Eco RI - переваренной плазмиды рР R I преципитировали и обрабатывали ферментом Кленова по способу, описанному в примере 5. После реакции Кленова Есо R I - переваренную, обработанную ферментом Кленова плазмидную рР R 12 - ДНК ре цир кул изо вал и путем лигирования в соответствии с методикой, описанной в примере 2. Лигированная в ДНК, которая составляет нужную плазмиду рР R 12AR I использовалась для трансформации Е. coll К12 RV308 по способу, описанному в примере 3, за исключением того, что селектирова- ние было основано на устойчивости к тетрациклину 5 мкг/мл, а не на устойчивости к ампициллину Е. coli K12 RV308 имеется в NRRL под номером NRRL В-15624. После того как трансформанты Е. coll K12 RV 308/рР R 12 AR I были идентифицированы, из этих трансформантов изготовляли ДНК плазмиды рР R 12 AR I по способу, описанному в примере 1.
Около 10 мкг плазмиды рР R 12 AR I переваривали около 50 ед., рестриктазы AVal в 200 мкл среднесолевого буфера в течение 2ч при 37°С. ДНК AVal-переваренной плазмиды преципитировали и обрабатывали ферментом Кленова по способу, описанному в примере 5. После реакции Кленова ДНК AVal-переваренной и обработанной ферментом Кленова плазмиды рР R 12 AR I лигировали с Eco R (-линкерами (5; - CAGGAATTCCTC - 3) по способу, описанному в примере 2. После лигирования линкера ДНК преципитировали, а затем ре- суспендировали в около 200 мкл высокосолевого буфера, содержащего 50 ед. рестриктазы Eco R I. Полученную в результате реакцию инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После Eco RI - переваривания реакционную
смесь погружали в агарозный гель, 5,1 kb Eco R I фрагмента рестрикции очищали в соответствии с методикой, описанной в примере 2. Лигированная ДНК составляла желаемую плазмиду рР R 12A R I. ДНК
плазмиды рР R 12A R I трансформировали в Е. coll K12 308 в соответствии с методикой, описанной в примере 3, за исключением того, что селекция проводилась на основании устойчивости к тетрациклину, а не к
ампициллину. После идентификации Е. coll К12 RV 308/рР R I 12A R I - трансформантов, в соответствии с процедурой описанной в примере 1, получали ДНК плазмиды рР R 12А R I Сайт рестрикции и функциональная
карта плазмиды рР R 12A R I представлены на фиг.4.
П р и м е р 9. Конструирование Е, coll К12 RC308/pL110.
Около 10 мкг ДНК плазмиды рР R 12AR
1 суспендировали в около 200 мкг высокосолевого буфера, содержащего около 50 ед. каждого из рестриктаз Pstl и Eco R I, и реакцию переваривания инкубировали при 37°С
в течение 2 ч. Затем реакционную смесь погружали в агарозный гель, а 2,9 kb Pstl
-Eco R I - фрагмента рестрикции плазмиды рР R 12A R I выделяли и готовили для лигирования в соответствии с методикой, описанной в примере 6.
Около 10 мкг плазмиды pL47 переваривали Pstl и BamHI рестриктазами в 200 мкл высокосолевого буфера в течение 2 ч при 37°С. Затем Pstl - BamHI переаренную ДНК
погружали в агарозный гель, ИА/2,7 кв. Pstl
-BamHI - фрагмента рестрикции, содержащего начало репликации, и часть гена, несущего устойчивость к ампициллину, выделяли и готовили для лигирования в соответствии
с методикой, описанной в примере 6.В вы- , деленной реакции около 10 мкг ДНК плазмиды переваривали Eco R I и BamHI - рестриктазы в 200 мкл высокосолевого буфера при 37°С в течение 2 ч, а 1,03 kb Eco R I BamHI - фрагмента рестрикции, содержащего новую транскрипционную и трансляционную активирующую последовательность и EK-BGH-кодирующую ДНК; выделяли и подготавливали для лигирования в соответствии
с методикой, описанной в примере 6.
/v 2 мкг из 1,0 kb полученного Eco R I - BamHI - фрагмента рестрикции использовались в конструировании плазмиды pL110. / 2,7kb Pstl -BamHI и 1,03kb Eco R I
-BamHI - фрагмента рестрикции плазмиды
pL47 лигировали с 2,9 kb Pstl - Eco R I - фрагмента рестрикции плазмиды pP R 12A R I с целью конструирования плазмиды , а лигированную ДНК использовали для трансформации Е. coll K12 RV308 в соответствии с методикой, описанной в примерах 2 и 3, за исключением того, что выделение трансформантов проводилось на основе устойчивости к тетрациклину, а не к ампициллину.
В рестрикционном сайте и функциональных картах, приведенных на приложенных рисунках, не обозначена EK-BGH - кодирующая область, в которой находятся сайты распознавания двух Pstl - плазмиды pl 110 представлены на фиг.4
П р и м е р 10. Получение ДНК вируса В К.
Вирус ВК получают из Американской Коллекции Типовых культур под депозитарным номером ATCCVR-837. Вирус доставляют в л-иофилизированной форме и ресуспендируют в уравновешенных солях Хэнка (Гибко, 3175 Стэйли Роду, Грэнд Айланд, Нью-Йорк 14072) до титра около 10 бляшкообразующих единиц (б о е.) на миллилитр. Хозяином для получения ДНК вируса ВК являются клетки человеческой первичной почки (РНЕК), которые могут быть получены из Флоу Лабораториез, Инк., 7655 Олд Спрингхауз Роуд, Мак Лин, Виргиния 22101, под каталожным номером 0-100 или из М.А. Биопродактс под каталожным номером 70-151.
Около пяти 75 мм2 полистироловых колб, содержащих конфлуентные монослои около 10 клеток РНЕК, используют для получения вируса. Около 1 мл вируса ВК при титре 105 б.о.е./мл прибавляют в каждую колбу, которую затем инкубируют при 37°С в течение часа, после чего прибавляли свежую культуральную среду (Дульбекко Модифицированная среда Игл, Гибко, пополненная 10%-ной сывороткой плода коровы) и зараженные клетки инкубируют при 37°С в течение 10-14 дней или до полного цитопатогенно- го эффекта вируса. Этот цитопатогенный эфект варьируется от линии клеток до линии клеток и от вируса до вируса, однако обычно состоит в том, что клетки округляют сверху, обособляются популяционно и отторгаются от культурального диска.
Вирус высвобождают из клеток при помощи трех циклов замораживания-оттаивания и продукты распада клеток удаляют центрифугированием при 5000 х г. Вирус в 1 л надосадочной жидкости осаждают и собирают прибавлением 100 г ПЭГ-6000, инкубированием раствора в течение 24 ч при 4°С
и центрифугированием при 5000 х г в течение 20 мин.Осадок после центрифугирования растворяют в 0,1Х SSC буфере (IXSSC 0,15 М Nad и 0,015 М Na цитрат, рН 7) при 5 концентраии. равной одна сотая первоначального объема. Вирусную суспензию расслаивают на 15 мл раствора насыщенного КВг в пробирке, которую центрифугируют при 75000 х г в течение 3 ч. После центрифу0 гирования в растворе КВг видны - две полосы. Нижнюю полосу, которая содержит полный вирион, собирают и обессоливают на колонке Сефадекс G-50 (Сигма Кемикал Ко., P.O. Бокс 14508, Сент-Луис, Миссури
5 63178), используя ТЕ (10 мМ трис-HCI; рН 7,8 и 1 мМ ЭДТА) в качестве буферного раствора для элюирования.
Додецилсульфат натрия (ДДС-Na) прибавляют в раствор очищенных вирианов,
0 полученный из колонки, до концентрации 1%, проназу прибавляют до концентрации 100 мкг/мл и раствор инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Затем в раствор прибавляют хлорид цезия до плотности 1,56 г/мл, после
5 чего прибавляют бромид этидия до конечной концентрации, равной 100 мкг/мл. Раствор центрифугируют в роторе Сорвалл 865 (Дю Пон Инст. Продактс, Биомедицинское отделение, Ньютон, Коннектикут 06470) или
0 аналогичном вертикальном роторе при 260000 х г в течение 24 ч. После центрифугирования полосу вирусной ДНК выделяют и экстрагируют 5 раз с использованием изо- амилового спирта, насыщенного 100 мМ
5 трис-HCI, рН 7,8. Затем раствор ДНК вируса В К диализируют по буферу ТЕ до тех пор, пока отношение оптической плотности 260 нм/280 ДНК не станет равным от 1,75 до 1,90. ДНК осаждают путем приведения
0 концентрации МаП к 0,15 М, прибавления двух объемов этанола, инкубирования раствора при -70°С в течение по крайней мере 2 ч и центрифугирования раствора при 12000 х г в течение 10 мин. Полученный
5 осадок ДНК вируса В К суспендируют в буфере ТЕ при концентрации 1 мг/мл. Ре- стрикционный сайт и функциональная карта вируса В К представлены на фиг.5.
0 П р и м е р 11. Конструирование плазмид рВКпео 1 и рВКпео2.
Клетки Е. coli K12 HB101/pd BPV - MMTneo получают в лиофильной форме из американской коллекции типовых культур
5 под депозитарным номером АТСС 37224. Лиофилизированные клетки высеивают на чашки с L-агаром, содержащие 100 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37°С с получением одноколониевых изолятов.
1 л бульона L(10 гтриптона, 10rNaCI и 5 г дрожжевого экстракта на 1 л), содержащего 50 мкг/мл ампициллина, инкулируют колонией Е. coll K12 НВ 101/ pdBPV- MMTneo и инкубируют в воздушной качалке при 37°С до достижения О. Дт равной около 1 единицы спектральной поглощательной способности, при которой 150 мг хлорамфеникола прибавляют в смесь. Инкубирование продолжают в течение приблизительно 16ч, прибавление хлорамфеникола ингибируют синтез белков и тем самым ингибирует дальнейшее деление клеток, однако позволяет продолжение плазмидной репликации.
Затем из этой культуры выделяют плаз- мидную ДНК в соответствии с методикой призера 1 и около 1 мкг ДНК плазмиды pdBPVMMT neo. полученной этой методикой, суспендируют в 1 мл буфера ТЕ и сохраняют при -20°С.
Около 5 мкг (5 мкл) ДНК плазмиды pdBPV-MMT neo, полученной выше и 5 мкг (5 мкл) ДНК вируса В К, полученной в примере 10, переваривают каждые отдельно при 37°С в течение 2 ч в растворе, содержащем 2 мкл 10Х буфера BamHI (1,5 М NaCI. 60 мМ трис-HCI, рН 7,9. 60 мМ MgCl2 и 1 мг/мл БСА), 1 мкл рестрикционного фермента BamHI и 7 мкл воды. Реакцию останавливают путем экстракции равным объемом фенола с последующими двумя экстракциями хлороформом. Каждую BamHI переваренную ДНК затем осаждают, собирают фильтрацией и ресуспендируют в 5 мкл воды.
Около 1 мкл 10Х лигазного буфера прибавляют в смесь BamHI-переваренной плазмидной pdBPV-MMT neo (1 мкл) и BamHI - переваренной ВК-вирусной ДНК(1 мкл). После прибавления 1 мкл (около 1000 единиц) ДНК - лигазы Т4 и 6 мкл воды полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Лигированная ДНК составляет желаемые плазмиды рВК neo 1 и рВК neo
2,которые отличаются только в отношении ориентации ДНК вируса ВК. Плазмида рВК neo 1 содержит около 2,1 kb фрагмент рестрикции.
Клетки Е. coll K12 НВ101 поставляются в лиофилизированной форме из Норверы Риджионал Рисерч Лаборатори под депозитарным номером HRRL В-15626. Клетки НВ 101 К12 Е. coll культивируют; делают компетентными для трансформации и трансформируют лигированной ДНК, полученной выше, в соответствии с методикой примера
3.Трансформированные клетки высеивают на чашки с L-агаром, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Трансформанты Е. coll K12 НВ101/рВК neo 1 и Е. coll K12/pBK neo 2 идентифицируют по их ампициллинустойчивому фенотипу и посредством анализа на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pBKneol представлены на фиг.5 прилагаемых чертежей.
П р и м е р 12. Конструирование плазмиды pBLcat,
А, Конструирование промежуточной
плазмиды pLPcat.
Вирионная ДНК аденовируса 2 (Ad2) представляет собой двухспиральную линейную молекулу размером около 35,94 ко. Поздний промотор Ad2 может быть выделен на
рестрикционном фрагменте Accl-PVUII около 0,316 kb генома Ad2, этот рестрикционный фрагмент размером около 0,32 kb соответствует последовательности между нуклеотидными положениями 5755 и 6071
генома Ad2. Для выделения желаемого рестрикционного фрагмента Accl-PVUII размером около 0,32 kb ДНК Ad2 вначале переваривают рестрикционным ферментом Ball и выделяют рестрикционный фрагмент
Ball размером около 2,4 kb, который содержит полную последовательность рестрикционного фрагмента Accl-PVUII размером около 0,32 kb. Затем рестрикционный фрагмент Ball размером около 2.4 kb переваривают Асе и PVUII с получением требуемого фрагмента.
Около 50 мкг ДНК Ad2 (поставленной из В R 2 или АТСС VR-2) растворяют в 80 мкл воды и 10 мкл 10Х буфера Ва (100 мМ
трис-HCI, рН 7,6, 12-мМ MgCl2, 100 мМ ДТФ и 1 мг/мл БСА). Около 10 мкл (около 20 ед.) рестрикционного фермента Ball прибавляют в раствор ДНК Ad2 и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в
течение 4 ч,
Ball-переваренную ДНК помещают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до полного отделения рестрикционных ферментов. Визуализацию элект офорезованной ДНК осуществляют путем окрашивания геля в разбавленном растворе (0.5 ) бромида этидия и экспонирования окрашенного геля длинноволновому ультрафиолетовому (УФ) свету. Один способ выделения ДНК из агарозы заключается в следующем. В геле впереди желаемого фрагмента небольшой продольный разрез, маленький кусок диэтиламиноэтилцеллюлозной мембраны А-45 (Шлейчер энд Шуелл. Кин.
Нью-Хемпшир 03431) помещают в каждый разрез. После дальнейшего электрофореза ДНК нековалетно связывается с диэтилами- ноэтилцеу люлозной мембраной. После того, как требуемый фрагмент привязался к
мембране, мембрану извлекают и промывают буферным раствором с низким содержанием соли (100 мМ КС, 0,1 мМ ЭДТК и 20 мМ трис-HCI, рН 8). Затем мембрану помещают в маленькую пробирку и погружают в буферный раствор с высоким содержанием соли (1 М NaCI, 0,1 мМ ЭДТК и 20 мМ трис- HCI, рН 8) и затем инкубируют при 65°С в течение часа с тем, чтобы извлечь ДНК из бумаги диэтиламиноэтилцеллюлозы. После инкубирования при 65°С инкубационный буфер собирают в мембрану промывают буферным раствором с высоким содержанием соли. Высокосолевой промывочный раствор объединяют с высокосолевым инкубационным буфером.
Объем высокосолевого ДНК-раствора регулируют так, чтобы концентрация NaCI составила 0,25 М, после чего прибавляют в раствор 3 объема холодного абсолютного этанола. Полученную смесь перемешивают и помещают при -70°С на 10-20 мин отстаиваться. Затем раствор центрифугируют при 15000 об/мин, в течение 15 мин. После осуществления осаждения с тем, чтобы удалить остаточную соль осадок ДНК промывают этанолом, сушат, ресуспендируют в 20 мкл буфера ТЕ и получают около 3 мкг трег буемого рестрикциейного фрагмента Ad2. Полученный очищенный фрагмент растворяют в 10 мкл буфера ТЕ.
Около 6 мкл воды и 2 мкл 10Х буфера Асе (60 мМ NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,5, 60 мМ MgCIa, 60 мМ ЭДТК и 1 мг/мл БСА) прибавляют в раствор рестрикционного фрагмента Bal 1 размером около 2,4 kb аденовируса 2. После прибавления около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Асе к раствору ДНК реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. После переваривания Асе ДНК собирают осаждением этанолом и ресуспендируют в 16 мкл воды и 2 мкл 10Х буфера PVUII/600 мМ NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,5, 60 мМ MgCl2, 60 мМ ДТФ и 1 мг/мл ВСА). После прибавления около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента PVUII к раствору ДНК реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч.
Accl-PVUII-переваренный, растрикци- онный фрагмент Ad2 Ball размером около 1,4 kb нагружают на приблизительно 6%- ный полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока из других продуктов переваривания не выделится ре- стрикционный фрагмент Accl-PVUII размером 0,32 kb, который содержит поздний промотор Ad2. Гель окрашивают бромидом этидия и наблюдают в ультрафиолетовых лучах, после чего сегмент геля, содержащий
рестрикционный фрагмент Accl-PVUII размером около 0,32 kb отрезают от геля, дробят и пропитывают в течение ночи при комнатной температуре в приблизительно 5 250 мкл экстракционного буферного раствора (500 мМ , 10 мМ МдОАс, 1 мМ ЭДТК и 0,1% ДДС Na). На следующее утро смесь центрифугируют и осадок сливают. ДНК в надосадочной жидкости осаждают
0 этанолом, прибавляют около 2 мкг тРНК с тем, чтобы гарантировать полное осаждение требуемого фрагмента. Около 0,2 мкг рестрикционного фрагмента Accl-PVUH размером около 0,32 kb получают и суспен5 дируют в 7 мкл воды.
Около 0,25 мкг (в 0,5 мкл) линкеров Ball (51 - СТАТСАС - 3), поставляются Нью Инг- ланд Биолабс), которые киназированы по существу в соответствии с методикой, опи0 санной в примере 2, прибавляют раствор рестрикционного фрагмента Accl-PVUII размером около 0,32 kb и затем в ДНК прибавляют 1 мкл (около 100 единиц) ДНК-лига- зы Т4 и 1 мкл 10Х лигазнрго буфера и
5 полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Линкеры Bell могут лигировать только к концу PVUII рестрикционного фрагмента Accl-PVUII. Сек- венирование ДНК позднее выявляет, что
0 четыре линкера Bell присоединены к концу PVUII рестрикционного фрагмента Accl- PVUII. Эти добавочные линкеры Bell могут быть извлечены перевариванием Bell и повторным лигированием, однако добавочные
5 линкеры ВСН не были извлечены, поскольку линкеры не препятствуют должному функционированию векторов, которые составляют добавочные линкеры.
Клетки Е. coli K12 HB101/pSV2 cat пол0 учают в лиофилизипованной форме из АТСС под депозитарным номером АТСС 37155, ДНК плазмиды pSV2 cat выделяют из клеток в соответствии с методикой примера 1. Около 1 мг ДНК плазмиды pSV2 cat получают и
5 растворяют в 1 мл буфера ТЕ. Около 3 мкг (3 мкл) ДНК плазмиды pSV2 cat прибавляют в раствор 2 мкл 10Х буфера Асе и 16 мкл воды, после чего 3 мкл (около 9 единиц) рестрикционного фермента Асе прибавля0 ют в раствор ДНК плазмиды pSV-2 cat и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Асе - переваренную ДНК плазмиды pSV2-cat затем переваривают рестрикционным ферментом
5 Stul путем прибавления 3 мкл 10Х буфера (1 М NaCI, 10 мМ трис-HCI. рН 8,100 мМ MgCl2. 60 мМ ДТФ и 1 мг/мл БСА), 6 мкл воды и около 2 мкл (около 10 единиц)рестрикционного фермента Stul. Полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2
ч. Реакцию оканчивают экстрагированием реакционной смеси один раз фенолом, затем дважды хлороформом. Около 0,5 мкг требуемого фрагмента получают и растворяют в 20 мкл буфера ТЕ.
Около 4 мкл Accl-Stul - переваренной ДНК плазмиды pSV2cat смешивают с приблизительно 7 мкл рестрикционного фрагмента Accl - PVUII размером около 0,32 kb (с присоединенными линкерами Bell) аденовируса 2, после прибавления 3 мкл 10 X лигазного буфера, 15 мкл воды и 2 мкл (около 1000 единиц) ДНК-лигазы Т4 реакционную смесь лигирования инкубируют при 16°С в течение ночи. Лигированная ДНК составляет требуемую плазмиду pLPcat, плазмиду, которая содержит поздний промотор Ad2, расположенный так, чтобы стимулировать транскрипцию и тем самым экспрессию хлорамфениколаметилтранс- феразагена. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pLPcat представлены на фиг.6.
Лигированную ДНК используют для трансформации клеток Е. coli K12 НВ101 в соответствии с методикой примера 3. Трансформированные клетки высеивают на -агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина; анализ на рестрикационный фермент плаз- мидной ДНК используют для идентификации трансформантов Е. coli K12 HB102/pLPcat. ДНК плазмиды pLPcat выделяют из трансформантов для использования в последующих конструированиях по существу в соответствии с методикой выделения плазмиды, описанной в примере 1.
В. Конечное конструирование плазмиды pBLcat.
Около 88 мкг ДНК плазмиды рВ пео 1 в 50 мкл буфера ТВ прибавляют в 7,5 мкл 10Х буфера Accl, 30 мкл воды и 15 мкл (около 75 единиц) рестрикционного фермента Accl и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Accl-переварен- ную ДНК вируса ВК нагружают на агарозный гель, фрагмент размером около 1,4 kb, который содержит энхансер ВК, отделяют от других продуктов переваривания. Рестрикционный фрагмент Accl размером около 1,4 kb затем выделяют в соответствии с методикой, описанной в примере 12А. Около 5 мкг фрагмента ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера PVUII, 45 мкл воды и 5 мкл (около 25 единиц) рестрикционного фермента PVUII, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. PVUII переваренную ДНК затем выделяют и приготавливают для лигирования в соответствии с методикой примера 12А. Около 2 мкг желаемого фрагмента Accl-PVUII размером
около 1,28 kb получают и растворяют в 5 мкл буфера ТЕ.
Около 1 мкг ДНК плазмиды pLPcat растворяют в 5 мкл 10Х буфера Accl и 40 мкл
воды. Около 5 мкл (около 25 единиц) рестрикционного фермента Accl прибавляют в раствор ДНК плазмиды pLPcat, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С. Accl - переваренную ДНК плазмиды pLPcat
0 осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера Stul, 40 мкл воды и 5 мкл (около 25 единиц) ресктрикционного фермента Stul, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Accl 5 Stul - переваренную ДНК плазмиды pLPcat осаждают этанолом несколько раз с тем, чтобы очистить рестрикционный фрагмент Accl - Stul размером около 4,81 kb, который содержит Е. coll - начало репликации ияозд0 ний промотор Ad2 вдали от других продуктов переваривания, причем рестрикционный фрагмент имеет размер около 16 пар оснований. Около 1 мкг требуемого рестрикционного фрагмента размером около 4,81 kb
5 получают и растворяют в 20 мкл буфера ТЕ. 5 мкл рестрикционного фрагмента Accl - Stul размером около 4,81 kb плазмиды pLPcat прибавляют к 5 мкл рестрикционного фрагмента Accl - PVUII размером около
0 1,28 kb вируса В К. После прибавления 3 мкл 10Х лигазного буфера 15 мкл воды и 2 мкл (около 1000 единиц) ДНК-лигазы Т4 полученную лигационную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Лигированная ДНК
5 составляет требуемую плазмиду pBLcat. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pBLcat представлены на фиг.6.
Лигированную ДНК используют для трансформации клеток Е. coll K12 НВ101 в
0 соответствии с методикой, описанной в при- мере 3. Трансформанты E.coli K12 HB101/pBLcat идентифицируют анализом на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК. ДНК плазмиды pBLcat получают для
5 использования в последующих конструктивных в основном в соответствии с методикой примера 1.
Пример 3. Конструирование плазмиды pL133.
0 А. Конструирование промежуточной плазмиды pSV2-HPC8.
Плазмида рНС7 содержит ДНК-последовательность, которая кодирует человеческий протеин С. Один литр L-бульона,
5 содержащего 15 мкг/мло тетрациклина, инокулируют культурой Е, coll K12 RRI (рНС7) NRRL В-15926). ДНК плазмиды рНС7 выделяют и очищают в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды
рНС7 представлены на фиг.7 Около 1 мг ДНК плазмиды рНС7 получают этой методикой, суспендируют в 1 мл буфера ТЕ и сохраняют при-20°С.
50 мкл ДНК плазмиды рНС7смешивают с 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Banl, 10 мкл 10Х реакционного буфера Banl (1,5 М NaCI, 60 мМ трис-HCI. рН 7,9, 60 мМ MgCI2 и 1 мг/мл ВСА) и 35 мкл воды и инкубируют до завершения перева- ривания. Banl-переваренную ДНК плазмиды рНС7 затем подвергают электрофорезу на 3,5%-ном полиакриламидном геле (29:1, акриламид: бисакриламид) до тех пор, пока рестрикционный фрагмент Banl размером около 1,25kb не отделится от других продуктов переваривания.
Область геля, содержащую рестрикционный фрагмент Banl размером около 1,25 kb, отрезают от геля, помещают в испыта- тельную пробирку и разбивают на маленькие кусочки. 1 мл экстракционного буфера (500 мМ NH40Ac, 10 мМ МдОАс, 1 мМ ЭДТК, 1 % ДДС Na и 10 мг/мл тРНК) прибавляют в пробирку, содержащую фрагменты, и про- бирку помещают при 37°С на ночь. Центрифугирование используют для осаждения продуктов распада клеток и надосадочную жидкость переносят в новую пробирку, Продукты распада промывают один раз 200 мкл экстракционного буфера, промытую над- осадочную жидкость объединяют с первым надосадочным слоем от ночной экстракции. После пропускания надосадочного слоя через пробку из стекловаты прибавляют два объема этанола и смешивают с надосадоч- ной жидкостью. Полученный раствор помещают в ванну с сухим льдом и этанолом на 10 мин, после чего ДНК осаждают центрифугированием.
Приблизительно 8 мкг рестрикционного фрагмента Banl размером около 1,25 kb получают этой методикой. Очищенный фрагмент суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и сохраняют при -20°С. Рестрикционный фрагмент Banl необходимо модифицировать путем прибавления линкера с тем, чтобы построить плазмиду pSV2-HPC8.
500 пикомолей каждого одиночной спирали линкера киназируют в 20 мкл реакци- онного буферного раствора, который содержит в 20 мкл реакционного буферного раствора, который содержит 15 единиц (около 0,5 мкл) полинуклеотид - киназы Т4,2 мкл 10Х лигазного буфера, 10 мкл из 500 мкМ АТФ и 7,5 мкл воды. Киназную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин и реакцию завершают инкубированием при 100°С в течение 10 мин Чтобы гаранти- ровать полную кинацию, реакционную
смесь охлаждают на льду, после чего прибавляют 2 мкл 0,2 М дитиотрейтола, 2,5 мкл 5 мМ АТФ и 15 единиц Т4-полинуклеотидки- назы прибавляют в реакционную смесь и перемешивают, после чего реакционную смесь инкубируют еще 30 мин при 37°С в течение 10 мин и осуществляют охлаждение реакционного продуктэТна ль ду/
Хотя и киназированные отдельно две одиночные спирали ДНК-линкера смешивают друг с другом после киназной реакции. Для ренатурации спиралей «иназную реакционную смесь инкубируют при 100°С в течение 10 мин в водяной , содержащей около 150 мл воды. После инкубации водяную баню отключают и охлаждают до комнатной температуры, что занимает около 3 ч. Водяную баню, все еще содержащую пробирку кинасированной ДНК, затем инкубируют при 4°С в течение ночи. Этот процесс позволяет денатурирозать одиночные спирали. Построенный линкер имеет следующую структуру
5 -AGCTTTGATCAG-S1
3 - AACf AGTCCACG - 5
Линкер сохраняют при -20°С до его использования.
Около 8 мкг фрагмента Banl размером около 1,25 kb прибавляют в реакционную смесь и смешивают с 50 мкл линкера (около 500 пикомолей), 1 мкл ДНК - лигазы Т4 (около 500 единиц), 10 мкл 10Х лигазного буфера и 19 мкл воды и полученную лигационную смесь инкубируют при 4°С в течение ночи. Реакцию лигирования прекращают путем 10-минутного инкубирования при 65°С. ДНК осаждают путем прибавления аОАс до конечной концентрации 0,ЗМ прибавления 2 объемов этанола, охлаждения в ванне с сухим льдом и этанолом и центрифугирования раствора
Осадок ДНК растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Apal (60 мМ NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,4, 60 мМ MgCte и 60 мМ 2-меркаптоэтанола), 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Apal и 85 мкл воды и рёакционную с мё сь% пЪ мёщают при 37°С на 2 ч. Затем реакцию останавливают и ДНК осаждают, как описано выше. Осадок ДНК после центрифугирования растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буферного раствора Hindlll, 5 мкл (около 50 единиц) ре- сктрикционного фермента Hindlll и 85 мкл воды, реакционную смесь помещают при 37°С на 2 ч После переваривания Hindlfl реакционную смесь нагружают на 3,5%-ный полиакриламидный гель и желаемый рестрикционный фрагмент Hindlll-Apal размером около 1,23 kb выделяют в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 12А. Приблизительно 5 мкгтребуемого фрагмента получают, суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и сохраняют при -20°С,
50мкл ДНК плазмиды рНС7смешивают с 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Pstl. 10 мкл 10Х реакционного буфера Pstl (1.0 М NaCI. 100 мМ трис-HCI, рН 7,5, 100 мМ MgCl2 и 1 мг/мл БСА) и 35 мкл воды и инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Pstl-переваренную ДНК плазмиды рН С7 затем подвергают электрофорезу на 3,5%- ном полиакриламидном геле, желаемый фрагмент размером около 0,88 kb очищают в основном в соответствии с методикой, описанной выше. Приблизительно 5 мкг желаемого фрагмента получают, суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и сохраняют при -20°С.
Около 5 мкг фрагмента Pstl размером около 0,88 kb прибавляют и смешивают с 50 мкл следующего линкера, который конструируют в автоматизированном ДНК-синтезаторе:
51- GTGATCAA-3
3 - ACGTCAGTACTTCTAG - 5
Около 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (около 10 единиц), 10 мкл 10Х лигазного буфера и 29 мкл воды прибавляют к смеси ДНК и полученную лигазную реакционную смесь инкубируют при 4°С в течение ночи.
Реакцию лигирования прекращают путем 10-минутного инкубирования при 65°С. После осаждения лигированной ДН К осадок ДНК растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Apal, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Apal и 85 мкл воды и реакционную смесь помещают при 37°С на 2 ч. Затем реакцию прекращают и ДНК осаждают еще раз. Осадок ДНК растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Bglll (1 М NaCI, 100 мМ трис-HCI. рН 7,4, 100 мМ MgCl2,100 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА), 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционо- го фермента Bglll и 85 мкл воды, реакционную смесь оставляют при 37°С на 2 ч. После переваривания Bglll реакционную смесь нагружают на 3.5%-ный полиакриламидный гель и желаемый рестрикционный фрагмент Apal-Bglll размером около 0,19 kb выделяют в основном в соответствии с методикой, описанной выше. Приблизительно 1 мкг желаемого фрагмента получают, суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и сохраняют при -20°С.
Приблизительно 10 мкг ДНК плазмиды pSV2gpt (ATCC 37145) растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Hlndlll, 5 мкл (около 50 единиц), рестрикционного фермента Hlndlll и 85 мкл воды и реакционную смесь помещают при 37°С на 2 ч. Затем реакционную смесь доводят до 0.25 М в NaOAC. после прибавления двух объемов
этанола и инкубирования в ванне в сухим льдом и этанолом ДНК осаждают центрифугированием. Осадок ДНК растворяют в 10 мкл 10Х буфера Bglll, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Bglll и 85 мкл воды, реакционную смесь помещают при 37°С на 2 ч. После переваривания Bglll реакционную смесь нагружают на 1%-ный агарозный гель и фрагменты отделяют элек0 трофорезом. Гель окрашивают этидия бромидом и наблюдают при УФ-свете и полосу, содержащую желаемый фрагмент Hindlll - Bglll размером около 5,1 kb, отрезают от геля и помещают в пробирку для диализа,
5 электрофорез осуществляют до тех пор. пока ДНК не отсоединится от агарозы. Буферный раствор, содержащий ДНК из пробирки для диализа, экстрагируют фенолом и . после чего ДНК осаждает. Осадок
0 ресуспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и он составляет около 5 мкг желаемого рестрикционного фрагмента Hlndlll - Bglll размером около 5,1 kb плазмиды pSV2gpt.
2 мкл рестрикционного фрагмента
5 Hindlll-Apal размером около 1,23 кл. 3 мкл фрагмента Apal-Bglll размером около 0,19 kb и 2 мкл фрагмента Hindlll-Bglll размером около 5,1 kb смешивают и затем инкубируют с 10 мкл 10Х лигазного буфера, 1 мкл ДНК0 лигазы Т4 (около 500 единиц) и 82 мкл воды при 16°С в течение ночи. Л игированная ДНК составляет желаемую плазмиду pSV2-HPC3. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pSV2-HPC8 представлены
5 на фиг.7.
Клетки Е, coll K12 RRI (NRRL В-15210) делают компетентными за трансформацию в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Полученную лиги0 рованную ДНК используют для трансформации клеток, аликвоты трансформационной смеси высеивают на чашки с L-агаром, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Затем чашки инкубируют при 37°С. Трансформан5 ты Е. coll K12 RRI/pSV2-HPC8 оценивают анализом на рестрикционный фермент плазмидной ДНК.
В. Окончательное конструирование плазмиды .
0 50 мкг плазмиды pSV2-HPC8 растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Hlndlll, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Hlndlll и 85 мкл воды, реакционную смесь инкубируют при 37°С в
5 течение 2 ч. После переваривания Hlndlll ДНК осаждают и осадок ДНК растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Sail (1,5 М NaCI, 60 мМ трис-HCI. рН 7,9 мМ MgCte. 60 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА). 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Sail и 85 мкл воды. Полученную реакционную смесь Sail инкубируют в течение 2 ч при 37°С. Hindlll - Sail - переваренную плазмиду pSV2-HPC8 нагружают на 3,5%- ный полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока желаемый рестрикционный фрагмент Hindlll - Sail размером около 0,29 kb не отделится от других реакционных продуктов. Требуемый фрагмент выделяют из геля, при этом получают около 2 мкг фрагмента и суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ.
50 мкг плазмиды pSV2-HPC8 растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Bgllll, 5 мкл (50 единиц) рестрикционного фермента Bglll и 85 мкл воды, реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. После переваривания Bglll ДНК осаждают и осадок ДНК растворяют в 10 мкл ЮХреакцион ного буфера Sail, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Sail b 85 мкл воды. Полученную реакционную смесь Sail инкубируют в течение 2 ч при 37оС. Sail - Bglll - переваренную плазмиду pSV2-HPC8 нагружают на 3,5%-ный полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока желаемый рестрикционный фрагмент Sail - Bglll размером около 1,15 kb не отделится от других реакционных продуктов. Рестрикционный фрагмент Sail - Bglll размером около 1.15 kb выделяют из геля, при этом получают около 8 мкг фрагмента и суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ.
Приблизительно 10 мкг ДНК плазмиды pSV2- -глобина (NRRL В-15928) растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Hindlll, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Hindlll и 85 мкл воды и реакционную смесь оставляют при 37оС на 2 ч. Затем реакционную смесь доводят до 0,25 М в NaOAc и после прибавления двух объемов этанола и инкубации в ванне с сухим льдом - этанолом ДНК осаждают центрифугированием. Hindlll - переваренную плазмиду pSV2-/3 -глобин растворяют в 10 мкл 10Х буфера Bglll, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Bglll и 85 мкл воды и реакционную смесь оставляют на2чпри37°С. После Bglll-переваривания реакционную смесь нагружают на 1%-ный агарозный гель и фрагмент Hindlll - Bglll размером около 4,2 kb выделяют из геля, при этом получают около 5 мкг желаемого фрагмента и суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ.
2 мкл фрагмента Hindlll-Sall размером около 0,29 kb плазмиды pSV2 - HPC8, 2 мкл фрагмента Sall-Bglll размером около 1,15 kb плазмиды pSV2-HPC8 и 2 мкл фрагмента Hindlll - BgllJ размером около 4,2 kb плазмиды pSV2- /9-глобин смешивают и лигиру- ют в основном в соответствии с методикой примера 13А. Лигированная ДНК составляет желаемую плазмиду pL133. Рестрикцион- 5 ный сайт и функциональная карта плазмиды рИЗЗ представлены на фиг.7. Требуемые трансформанты Е. coll K12 RRI/p 133 конструируют в основном в соответствии с методикой примера 16А за исключением того, 0 что вместо плазмиды pSV2-HPC8 плазмиду используют в качестве трансформирующей ДНК.
П р и м е р 14. Конструирование плазмиды pLPC.
5 Около 20 мкг плазмиды pBLcat растворяют в 10 мкл 10Х буфера Hindlll и 80 мкл воды. Около 10 мкл (около 100 единиц) рестрикционного фермента Hindlll прибавляют в раствор ДНК плазмиды pBLcat и 0 полученную реакционную смесь инкубируют1 при 37°С в течение 2 ч. Hlndlll-перева- ренную ДНК плазмиды pBLcat нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до выселения рестрикционного фраг- 5 мента Hindlll размером около 0,87 kb, который содержит энхансер В К и поздний промотор Ad2; затем данный фрагмент выделяют и подготавливают для лигирования в основном в соответствии с методикой при- 0 мера 12А.
Около 2 мкг желаемого фрагмента получают и растворяют в 5 мкл буфера ТЕ.
Около 1,5 мкг ДНК плазмиды pL133 растворяют в 2 мкл 10Х буфера Hindlll и 16 мкл 5 воды. Около 1 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Hindlll прибавляют в раствор ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Затем ДНК разбавляют до 100 мкл буфером 0 ТЕ и обрабатывают телячьекишечной щелочной фосфатазой в основном в соответствии с методикой примера 7. Hindlll-переваренную ДНК плазмиды pL133 экстрагируют дважды фенолом и один раз хлороформом, осажда- 5 ют этанолом и ресуспендируют в 10 мкл буфера ТЕ.
Около 5 мкл рестрикционного фрагмента Hindlll размером около 0,87 kb плазмиды pBLcat прибавляют к 1,5 мкл Hindlll-nepe- 0 варенной плазмиды pL133, а затем 1 мкл 10Х лигазного буфера, 1 мкл (около 1000 единиц) ДНК-лигазы Т4 и 1,5 мкл воды прибавляют к раствору ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют в течение ночи 5 при 16°С. Лигированная ДНК составляет желаемую плазмиду pLPC. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pLPC представлены на фиг.8.
Лигированную ДНК используют для трансформации Е. coli K12 НВ101 в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Трансформированные клетки высевают на L-arap, содержащий амипицил- лин и плазмидную ДНК ампициллин-устойчивых трансформантов, исследуют анализом нерестрикционный фермент с тем, чтобы идентифицировать трансформанты Е. coll K12 НВ101/ - pLPC. Рестрикционный фрагмент Himdlll размером около 0,87 kb, кодирующий энхансер ВК и поздний промотор Ad2 можно инсерцировать в Hindlll-переваренную плаз- миду pL133 в одной или двух ориентациях, единственная конструкция, которая содержит фрагмент Ndel-Stul размером около 1 kb, и приводит к получению плазмид pLPC,
Пример15. Конструирование плазмид pLPChyg и pLPChyg2.
Клетки Е. coli K12 RRI/pSV2hyg получают из Норзерн Риджионал Рисерч Лабора- тори под депозитарным номером В-18039. ДНК плазмиды pSV2hyg получают из клеток в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pSV2hyg представлены на фиг.8.
Около 10 мкг (в 10 мкл буфера ТЕ) плазмиды pSV2hyg прибавляют в 2 мкл буфера BamHI и 6 мкл воды. Около 2 мкл (около 20 единиц) рестрикционного фермента BamHt прибавляют в раствор ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч.
Реакционную смесь экстрагируют вначале фенолом и затем дважды хлороформом, BamHI2 переваренную ДНК плазмиды pSV2hyg нагружают на агарозный гель и гиг- ромицин-устойчивый генсодержащий ре- стрикционный фрагмент размером около 2,5 kb выделяют в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 12А,
Около 5 мкл 1DX буферного раствора Кленова (0,2 мМ в каждой из четырех дНТФ, 0,5 трис-HCI, рН 7,8, 50 мМ MgCh, 0,1 М 2-меркаптоэтанола и 100 мкг/мл ВСА) и 35 мкл воды прибавляют к раствору BamHI-ne- реваренной ДНК плазмиды pSV2hyg, затем около 25 единиц фермента Кленова (около 5 мкл, поставляемых на рынок фирмой в RL) прибавляют к смеси ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 30 мин при 16°С. Обработанную ферментом Кленова BamHI - переваренную ДНК плазмиды pSV2hyg экстрагируют один раз фенолом и один раз хлороформом и затем осаждают этанолом. Около 2 мкг желаемого фрагмента получают и суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ.
Около 10 мкг (10 мкл) ДНК плазмиды pLPC прибавляли к 2 мкл 10Х буфера Stul и 6 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц)
рестрикциоиного фермента Stul прибавляют к раствору ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Stul - переваренную ДНК плазмиды pLPC
осаждают этанолом, собирают центрифугированием ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера Nde 1 (1,5 М NaCI, 0,2 М трис-HCI, рН 7,8, 70 мМ MgCl2, 60 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА) и 16 мкл воды. Около 2 мкл
0 (около 10 единиц) рестрикционного фермента Ndt 1 прибавляют к раствору Stul-перева- ренной ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Ndel и Stul переваренную ДНК плазми5 ды pLPC осаждают этанолом, собирают центрифугированием и ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера Кленова и 40 мкл воды. Около 5 мкл (около 25 единиц) фермента Кленова прибавляют к раствору и ДНК и полученную
0 реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение 30 мин. После завершения реакции Кленова реакционную смесь нагружают на агарозный гель и рестрикционный фрагмент размером около 5,82 kb Ndel-Stul выделяют
5 из геля. Около 5 мкг желаемого фрагмента получают и суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ. Около 2 мкл Кленов-обработанного рестрикционного фрагмента BamHI размером около 2,5 kb плазмиды pSV2hyg смешивают
0 с приблизительно 1 мкл Кленов-обработанного рестрикционного фрагмента Ndel- Stul размером около 5,82 kb плазмиды pLPC, в раствор ДНК прибавляют около 3 мкл 10Х лигазного буфера, 2 мкл Т4 ДНК-ли5 газы (около 1000 единиц), 1 мкл Т4 РНК лигазы (около 1 единицы) и 14 мкл воды. Полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Лигированная ДНК составляет желаемые плазмиды
0 pLPChygl и pLPChyg2, которые отличаются друг от друга только в отношении ориентации рестрикционного фрагмента BamHI, обработанного ферментом Кленова, размером около2,5 kb, плазмиды pSV2hyg. Рестрикци5 онный сайт и функциональная карта плазмиды pLPChygl представлены на фиг.8. Лигированную ДНК используют для трансформации Е. coli K12 НВ101 в основном в соответствии с методикой примера 3. Желаемые
0 трансформэнты E.coli K12 НВ101/pLPChygl и Е. coll K12 HB-101/pLPChyg2 высевают на L- агар, содержащий ампициллин, и идентифицируют анализом на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК.
5 Пример1б. Конструирование плазмиды pBW32.
А, Конструирование промежуточной плазмиды рТРА103.
Плазмида рТРА102 содержит кодирующую последовательность тканевого активатора плазминогена (АПТ) человека. Плазми- ду рТРА102 можно выделить из Е. coll K12 ММ294/рТРА102, штамма, поставляемого Норзерн Риджионал Рисерч Лаборатори под депозитарным номером NRRL В- 15834. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды рТРА102 представлены на фиг.9. ДНК плазмиды рТРА102 выделяют из Е. coll K12 ММ294/рТРА102 в основном в соответствии с методикой примера 1.
Около 5 мкг плазмиды рТРА102 (в приблизительно 50 мкл буфера ТЕ) прибавляют к 10 мкл 10Х буфера Tthllll (0,5 М NaCI, 80 мМ трис-HCI, рН 7,4. 80 мМ MgChz, 80 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА) и 80 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрик- ционного фермента Tthllll прибавляют к раствору ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 65°С в течение 2 ч. Реакционную смесь нагружают на агарозный гель, рестрикционный фрагмент Tthllll размером около 4,4 kb, который содержит последовательность, кодирующую АПТ, выделяют из геля. Другие продукты переваривания, ре- стрикционные фрагменты размером около 3,1 kb и 0,5 kb удаляют. Около 10 мкг желаемого рестрикционного фрагмента TthllH размером около 4,4 kb получают и суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ.
Около 5 мкл 10Х буфера Кленова и 30 мкл воды прибавляют к раствору, содержащему рестрикционный фрагмент Tthllll размером около 4,4 kb, и после прибавления около 5 мкл фермента Кленова (около 5 единиц) реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение 30 мин. После завершения реакции Кленова ДН К осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 14 мкл воды.
Линкеры BamHI (Нью-Инглэнд иолабо), имеющие следующую последовательность
5 -CGGATCCG-3
3 -GdctAdGC-S
киназируют и подготавливают для лигиро- вания следующим образом. 4 мкл линкера (около 2 мкг) растворяют в 20,15 мкл воды и 5 мкл 10Х киназного буфера (500 мМ трис- HCI, рН 7,6 и 100 мМ MgCte), инкубируют приЭОоС в течение 2 мин и затем охлаждают до комнатной температуры. 5 мкл уг2-р- АТФ (около 20 мкС), 2,5 мкл Ш ДТТ и 5 мкл полинуклеотидкиназы (около 10 единиц) прибавляют в смесь, которую затем инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Затем прибавляют 3,35 мкл 0,01 М АТФ и 5 мкл киназы и реакцию продолжают еще 30 мин при 37°С. Радиоактивная АТФ помогает в определении лигированы или нет линкеры к искомой ДНК.
Около 10 мкл киназированных линкеров BamHI прибавляют к раствору рестрикционного фрагмента Tthllll размером около 4,4 kb и после прибавления 2 мкл Т4 ДНК-лига5 зы (около 1000 единиц) и 1 мкл Т4 ДНК-лига- зы (около 2 единиц) смесь реакции лигирования инкубируют при 4°С в течение ночи. Лигированную ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера
0 Hindlll и 40 мкл воды. Около 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Hindi If прибавляют к раствору ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч.
5 Hlndlll-переваренную ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют 10 мкл 10Х буфера BamHI и 90 мкл воды. Около 10 мкл (около 100 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавляют к раствору
0 ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37°С. После ВатНt-перевариванйя реакционную смесь нагружают на ага роЗньТй гель и рестрикционный фрагмент BamHI-Hindlll
5 размером около 2 kb выделяют из геля. Около 4 мкг желаемого фрагмента получают и суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ.
0 Для построения плазмиды рТРАЮЗ рестрикционный фрагмент BamHI-Hlndlll размером около 2 kb, полученный из плазмиды рТРА102, инсерцируют в BamHI-Hfndlll-пе- реваренную плазмиду pRC. Плазмиду pRC
5 конструируют путем инсерции рестрикционного фрагмента Eco R l-Clal размером около 288 пар оснований, который содержит последовательности промотора и оператора (trpPO) оперона trp Е. coll b Eco R l-Clal0 переваренную K12N10b/pKC7 плазмиду PKC7. Плазмида рКС7 может быть получена под депозитарным номером АТСС37084. Рестрикционный фрагмент из Американской коллекции Типовых культур в Е. coll Eco
5 R l-Clal размером около 288 пар оснований, который содержит trp PO, может быть выделен из плазмиды рТРА102, которую можно выделить из Е. coli K12 ММ294/рТРА102 (NRRL B-15834). ДНК плазмид рКС7 и
0 рТРА102 могут быть получены из упомянутых клеточных линий в основном в соответствии с методикой примера 1. Этот рестрикционный фрагмент Eco R l-CIal размером около 0,29 kb плазмиды рТРА102 со5 держит последовательность активации транскрипции и большую часть последовательности активации трансляции гена trp E. coll и имеет следующую последовательность.
S-AAITCACGCT СТОСГОТТЛТ GCTCGGTGGT CGCTAGCGTO CCGACGCCCA
ним i mi inn mi i HIM mi mm 11111 inn
З -СТСССА CACCACAATA CCACCCACCA CCCATCCCAC GGCTGCGCGT
TCTCG CTCC AtGJTGCICC «-fTCCTTCTG СССААТССЗ.
ii mm 11 1111 iiini 111 mn 11 m mi m 11 m и 111
AGAGCTGACG TGCCACGTGG TTACGAACAC CGCAGTCCGT CGGTTAGCCT
AGCTGTGGTA TGCCTGTCCA GGTCGTATAA TCACCGCATA ATTCGACTCO 111 III II11 III 11 Mill I III 111111 1111111111 III1111111
TCGACACCAT ACCGACACGT CCAGCATATT AOTCGCOTAT TAAGCTCAGC
MO 170 190 190 90 CTCAAGGCGC ACTCCCGTTC CGGATAATGT TTTTTGCTCC CACATCATAA
mmiiii пинии hiiiiiiii iimimi iniinm
CAGITCCGCG TGAGGGCAAG GCCTATTACA AAAAACGAGG CTGTAGTATT
3102202 ЭО2402
CGGTTCCGCC AAATATTCTG AAATGAGCTG TTGACAЈTT4 ATCATCGAAC
mmmi iiimmi mmiiii mimm пинии
CCCAAGGCCG TTTATAAGAC TTTACTCGAC AACTGTTAAT TAGTAGCTTG
460270280 287
TAGTTAACTA GTACGCAAGT TCTCGTAAAA AGCGTAT-3
mmmi i mi 11 m mi i mi i и i им
AICAATTGAT CATGCGTTCA ACAGCATTTt TCCCATAGC-5
Таким образом, для построения плазми- ды PRC около 2 мкг плазмиды рКС7 в 10 мкл буфера ТЕ прибавляют к 2 мкл 10Х буфера Clal (0,5 M NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,9, 60 мМ MgCl2 и 1 мг/мл БСА) и 6 мкл воды. Около 3 мкл (около 10 единиц) рестрикцион- ного фермента Clal прибавляют к раствору ДНК плазмиды рКС7, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Clal-переваренную ДНК плазмиды рКС7 осаждают этанолом и ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера Eco R I и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикцион- ного фермента Eco R I прибавляют к раствору Clal-переваренной ДНК плазмиды рКС7 и полученную реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37°С.
Eco R l-Clal-переваренную ДНК плазмиды рКС7 экстрагируют один раз фенолом и затем дважды хлороформом. Затем ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 20 мкл воды, Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды рКС7 могут быть получены из работы Маниатиса и др., Молекулярное клонирование (Коулд Спринг Харбор Лабо- ратори, 1982, с.8).
Около 20 мкг плазмиды рТРА102 в приблизительно 20 мкл буфера ТЕ прибавляют к 10 мкл 10Х буфера Clal и 60 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикци- онного фермента Clal прибавляют к раствору ДНК плазмиды рТРА102, полученную реакционную смесь инкубируют при 37оС в течение 2 ч. Clal-переваренную ДНК плаз- миды рТРА102 осаждают этанолом и ресуспендируют в 10 мкл 10Х буфера Eco R I и 80 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Eco RI прибавляют к раствору Clal-переваренной ДНК плаз- миды рТРА102 и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч.
Eco R l-Clal-переваренную ДНК плазмиды рТРА102 экстрагируют один раз фено- лом, нагружают нэ 7%-ный
0
5
0 5 0
5 0
5 0 5
полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока от других продуктов переваривания не отделится рестрикционный фрагмент Eco R l-Clal размером около 288 пар оснований, который содержит trpPo. Данный рестрикционный фрагмент Eco R l-Clal размером около 288 пар оснований выделяют из геля; около 1 мкг желаемого фрагмента получают, суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ и прибавляют к раствору Eco RI Clal-переваренной ДНК плазмиды рКС7, полученной, как описано выше. Около 2 мкл (около 1000 единиц) ДНК- лигазы Т4 затем прибавляют к смеси ДНК, полученную реакционную смесь для лигиро- вания инкубируют при 16°С в течение 2 ч. Лигированная ДНК составляет требуемую ДНК плазмиды pRC.
Л игированную ДНК используют для трансформации компетентных клеток НВ101 К12 Е, coli в основном в соответствии с методикой примера 3. Трансформированные клетки высевают на L-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина, и ампициллинустойчивые трансформанты подвергают скринингу посредством анализа на рестрикционный фермент их плаз- мидной ДНК с тем, чтобы идентифицировать желаемые колонки Е. coli K12 HB101/pRC.flHK плазмиды pRC получают из трансформантов Е. coli K12 НВ101/pRC в основном в соответствии с методикой примера 1,
Около 2 мкг ДНК плазмиды pRC в 2 мкл буфера ТВ прибавляют к 2 мкл 10Х буфера Hlndlll и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Hindlll прибавляют к раствору ДНК плазмиды pRC, полученную реакционную смесь икубируют при 37°С в течение 2 ч. Hindlll-переварен- ную ДНК плазмиды PR С осаждают этанол ом и ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера BamHI и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавляют к раствору Hindlll-переварен- ной ДИК плазмиды pRC, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч.
BamHI-Hindlll-переваренную ДНК плазмиды pRC экстрагируют один раз фенолом и затем два раза хлороформом, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 20 мкл воды. Приблизительно 4 мкг (в приблизительно 5 мкл буфера ТЕ) рестрикционного фрагмента Hindlll-BamHl размером около 2 kb плазмиды рТРА102 затем прибавляют к раствору BamHI-Hindlll- переваренной ДНК плазмиды pRC. Около 2 мкл (около 100 единиц) Т4 ДНК-лигазы при- бав(ляют к смеси ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение
2 ч. Лигированная ДНК составляет желаемую ДНК плазмиды рТРАЮЗ.
Для уменьшения количества нежелательных трансформантов лигированную ДНК переваривают рестрикционным фер- ментом Ncol. который отрезает плазмиду pRC, но не плазмиду рТРАЮЗ. Таким образом переваривание лигированной ДНК ферментом Ncol, уменьшает количество нежелательных трансформантов, поскольку линеаризованная ДНК трансформирует Е. coli с более низ кой частотой, нежели закрытая кольцевая ДНК. Для переваривания лигированной ДНК последнюю вначале осаждают этанолом и затем ресуспендиру- ют в 2 мкл 10Х буфера Ncol (1.5 М NaCI, 60 мМ трис-HCl, рН 7,8, 60 мМ MgCl2 и 2 мг/мл БСА) и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Ncol прибавляют к раствору ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 2
4при 37°С.
Лигированную, а затем Ncol-перева- ренную ДНК используют для трансформации Е. coli K12 RV308/NRRL 15624). Клетки RV308 К12 Е. coll делают компетентными и трансформируют в основном в соответствии с методикой примера 3. Трансформационную смесь высеивают на L-arap, содержащий 1000 мкг/мл ампициллина. Ампициллину- стойчивые трансформанты испытывают на чувствительность к канамицину, поскольку если плазмида pRC придает устойчивость к канамицину, то плазмида рТРАЮЗ не придает. Ампициллинустойчивые, канамицинчувстви- тельные трансформанты затем используют для получения плазмидной ДНК, плазмидную ДНК исследуют анализом на рестрикцион- ный фермент с тем, чтобы идентифицировать трансформанты Е. coli K12 RV308/pTPA-103. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды рТРА-103 представлены на фиг.9. ДНК плазмиды рТРАЮЗ выделяют из клеток Е. coli Kl2RV308/pTPA103 в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 1.
В. Конструирование промежуточной плазмиды pBW25.
Около 1 мкг ДНК плазмиды рТРАЮЗ в 1 мкл буфера ТЕ прибавляют к 2 мкл 10Х бу- фера Bglll и 16 мкл воды. Около 1 мкл (около
5единиц) рестрикционного фермента Bglll прибавляют к раствору ДНК плазмиды рТРАЮЗ, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37°С. Bglll-ne- реваренную ДНК плазмиды рТРАЮЗ осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера Кленова и 44 мкл воды. Около 1 мкл фермента Кленова (около 1 единицы) прибавляют к раствору Bglll-переваренной
ДНК плазмиды рТРАЮЗ, полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение 2 ч. Обработанную ферментом Кленова Bglll-переваренную ДНК плазмиды рТРАЮЗ осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 22 мкл воды.
Около 2 мкл (0,2 мкг) некиназированных линкеров (Нью Инглэнд Биолабс) последовательности
5 - CCATATGG - 5
З1 -GGTATACC-5
прибавляют в раствор, обработанный ферментом Кленова, Bglll-переваренной ДНК плазмиды рТРАЮЗ вместе с 2 мкл (около 100 единиц) Т4 ДНК-лигазы и 1 мкл (около 2 единиц) Т4 РНК-лигазы и полученную смесь для реакции лигирования инкубируют в течение ночи при 4°С. Лигированная ДНК составляет плазмиду рТРАЮЗ der Ndel, которая в основном аналогична плазмиде рТРАЮЗ за исключением того, что плазмида рТРАЮЗ - der Ndel имеет последовательность распознавания Ndel так, где плазмиды рТРАЮЗ имеет последовательность распознавания Bglll.
Лигированную ДНК используют для трансформации компетентных клеток Е, coll К12 RV308 в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Трансформированные клетки высевают на L-arap, содержащий ампициллин, и трансформанты Е. coli K12 RV308/pTPA103 der Ndel идентифицируют анализом нерестрикционный фермент их плазмидной ДНК. ДНК плазмиды рТРАЮЗ - der Ndel выделяют из трансформантов для использования в последующих построениях в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 1.
Около 10 мкг ДНК плазмиды рТРАЮЗ der Ndel в 10 мкл буфера ТЕ прибавляют к 2 мкл 10Х буфера AVall (0.6 М NaCI, 60 мМ трис-HCl. рН 8, 0,1 М MgCIa, 60 мМ 2-мер- капроэтанола и 1 мкг/мл БСА) и 6 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента AVall прибавляют к ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. AVall-переваренную ДНК нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до отделения от других продуктов переваривания рестрикционного фермента размером около 1,4 kb. Рестрикционный фрагмент AVall размером около 1,4 kb плазмиды рТРАЮЗ der Ndel выделяют из геля, получая при этом около 2 мкг желаемого фрагмента, которые суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ.
Около 5 мкл ЮХ буфера Кпенова,35мкл воды и 5 мкл (около 5 единиц) фермента Кленова прибавляют к раствору рестрикционного фрагмента AVall размером около 1.4
kb, полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение 30 мин. Кленов-об- работанную ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 14 мкл воды.
Около 2 мкг линкеров Нра последовательности
51 - CqiTAACG - 3
3 -GCAAfTGC-5
киназируют в основном в соответствии с методикой примера 2. Около 10 мкл кинази- рованных линкеров прибавляют к раствору Кленов-обработанного рестрикциейного фрагмента AVall размером около 1,4 kb плазмиды рТРАЮЗ der Ndel вместе с 2 мкл (около 100 единиц Т4 ДНК - лигазы и 1 мкл) около 1 единицы Т4 ДНК-лигазы, полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи.
Лигированную ДНК экстрагируют один раз фенолом, дважды хлороформом, осаждают этанолом и ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера Eco R I и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Eco R I прибавляют к раствору ДНК, полученную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Eco R l-переваренную ДНК экстрагируют один раз фенолом, дважды хлороформом, осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 20 мкл воды. Фрагмент, имеющий около 770 пар оснований в размере и кодирующий trpPO и аминоконец тканевого активатора плазминогена человека (АПТ), имеет один Eco R l-совместимый конец и один тупой конец и его лигируют в Eco R l-Smal переваренную плазмиду PUCI с образованием плазмиды PUC19NPAFE.
Около 2 мкл плазмиды pUC19 (поставляется Бетесда Рисирч Лабораториез) растворяют в 2 мкл 10Х буфера Smal (0,2 М KCI, 60 мМ трис-HCI, рН 8, 60 мМ MgCIa, 60 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА) и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Smal прибавляют к раствору ДНК, полученную реационную смесь инкубируют при 25°С в течение 2 ч. Smal переваренную ДНК плазмиды pUC19 осаждают этанолом, собирают центрифугированием и ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера Eco R I и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Eco R I прибавляют к раствору Smal-ne- реваренной ДНК плазмиды р(1С19, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Eco R l-Smal-ne- реваренную ДНК плазмиды pUC19 экстрагируют один раз фенолом, затем два раза хлороформом и ресуспендируют в 5 мкл буфера ТЕ.
Eco R l-Smal-переваренную ДНК плазмиды p(JC19 прибавляют к раствору, содержащему тупоконечный рестрикционный фрагмент Eco R f размером около 770 пар
оснований, полученный из плазмиды рТРАЮЗ der Ndel. Около 2 мкл (около 1000 единиц)Т4 ДНК-лигазы прибавляют к смеси ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Л игированная ДНК составляет желаемую плазмиду PU019TPAFE. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pUC19TPAFE представлены на фиг.9.
Многоклонирующий сайт плазмиды
pUC19 содержит последовательности распознавания Eco R I и Smal, используемые при конструировании плазмиды pUC19TPAFE, расположен в пределах кодирующей последовательности для фрагмента
lacL2. Экспрессия фрагмента lacL2 в клетках, содержащих мутацию М15 Iac2, мутацию в гене lacL, который кодирует /3-галактозида- зу, позволяет этим клеткам экспрессировать функциональную молекулу / -галактозидазы и тем самым позволяет этим клеткам гидролизовать X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индо- лил- галактопиранозид, бесцветное соединение) в его индиго-окрашенный продукт гидролиза. Инсерция ДНК в многоклонирующий сайт плазмиды pUC19 мешает кодирующей последовательности для фрагмента 1ас21и клеткам с мутацией М151ас1 так,что хозяин, например плазмида, не в состоянии гидролизовать X-Gal Лигированную ДНК,
которая составляет плазмиду pUC19TPAFE. используют для трансформации клеток Е. coll K12 RRI M15 (NRR LB-15440), которые делают компетентными для трансформации в основном в соответствии с методикой примера 3.
Трансформированные клетки высевают на L-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл X-Gal и 1 мМ IPTG. Колонии, которые не проявляют индиго-окраску, субкультивируют и используют для получения плазмидной ДНК; трансформанты Е. coll К12 RRI AM15/pUC19TPAF E идентифицируют анализом на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК. ДНК плазмиды
pUC19TPAF Е выделяют из клеток Е. coli K12
RRI AM15/pUC19TPAF Е, для использованй я в пбШГбдую щйх пбст роёнйях в основном
в соответствии с методикой примера 1.
Около 7 мкг плазмиды pUC19TPAF E в
20 мкл буфера ТЕ прибавляют к 10 мкл 10Х буфера Hpal (0,2 М KCI. 0,1 М трис-HCI, рН 7,4 и 0,1 М MgCI2) и 70 мкл воды. Около 3 мкл (около 6 единиц) рестрикционного фермента Hpal прибавляют в раствор ДНК плазмиды pUC19TPAF Е, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 20 мин; короткий период реакции предназначен для получения частичного Hpal-перева- ривания. Реакционную смесь доводят до 150 мкл IX буфера BamHI (150 мМ NaCI, 10 мМ трис-HCI, рН 8 и 10 мМ MgCl2, поднимая концентрацию соли, инактивирующую Hpal). Около 1 мкл (около 16 единиц) рестрикцион- ного фермента BamHI прибавляют к раств о- ру частично-Нра1-переваренной ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 90 мин.
BamHI-частично-Н pal-переваренную ДНК плазмиды pUC19TPAF E концентриру- ют осаждением этанола, нагружают на 1,5%-ный агарозный гель и рестрикцион- ный фрагмент Hpal-BamHI размером околб 3,42 kb, содержащий репликон, ген /3-лак- тамазы и йсю АПТ-кодирующую ДНК плаз- миды pUCATPAF Е, выделяют из геля путем отрезания сегмента геля, который содержит желаемый фрагмент, замораживан ия сег- мента и последующего выдавливания жидкости из сегмента. ДНК осаждают из жидкости осаждением этанола. Около 1 мкг желаемого фрагмента получают и суспендируют в 20 мкл буфера ТЕ.
Около 10 мкг плазмиды рТРАЮЗ в 10 мкл буфера ТЕ растворяют в 10 мкл 10Х буфера Scal-(1 M NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,4, и 60 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ и 1 мг/мл ВСА) и 80 мкл воды, Около 3 мкл (около 18 единиц) рестрикционного фермента Seal прибавляЮт к рае твору ДНК плазмиды рТРАЮЗ, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 90 мин при 37°С. Реакционный объем доводят до 150 мкл IX буфера BamHI и около 1 мкл (около 16 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавляют в смесь, которую затем инкубируют при 37°С в течение 90 мин. ДНК осаждают этанолом , собирают центрифугированием и ресуспендируют при получении для Электрофореза. Scal-BamHI-переваренную ДНК плаз- миды рТРА-103 нагружают на 1,5%-ный агарозный гель и подвергают электрофорезу до отделения от других продуктов перев ар й ба- ния рестрикционного фрагмента Scal-BamHI размером около 1,015 kb.
Данный рестрикционный фрагмент, содержащий АПТ-карбоксиконец-кодирую- щую ДНК плазмиды рТРАЮЗ, выделяют из геля, получая при этом около 0,5 мкг желаемого фрагмента, которые растворяют в 20 мкл дистиллированной через стекло воды.
Около 2 мкл рестрикционного фрагмента BamHI2Hpal размером около 3,42 kb плазмиды pUC19TPAF E прибавляют в 2 мкл рестрикциОнно го фрагмента Scal-ВатНГ
размеромокЪлОТ,015 kb плазмиды рТРАЮЗ вместе с 2 мкл 10Х лигазного буфера и 1 мкл (около 1 единицы Вейса); лигаза получена из Промега Биотек, 2800 С.Фиш Хэтчери Роуд, Мэдисон, Биосконсин 53711/Т4 ДНК-лига- зы, и полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Лигированная ДНК составляет желаемую плазмиду pBW25. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pBW25 представлены на фиг.9.
Лигированную ДНК используют для трансформации E. coll K12 I M105 (поставляют их BRL), которые были сделаны компетентными для трансформации в основном в соответствии с методикой примера 3 за исключением тогоГчто в методике используют 50 мМ CaCI2. Трансформированные клетки Вйс евают на В HI (Дифко Лабораториез, Детройт, Мичиган), содержащий 100 мкг/мл ампициллина, и транспорируют E. coll K12 IM105/pBW25, идентифицируют анализом на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК. Переваривание плазмиды pBW25 pe- стрикционным ферментом Eco R I приводит к получению рестрикционных фрагментов размером 3,38 kb и около 1,08 kb. Плазмиду pBW25 получают для использования в дальнейших конструированиях в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 1.
С. Сайт-специфический мутагенез АПТ- кодирующей области и конструирование плазмиды pBW28.
Около 5 мкл плазмиды pBW25 в 10 мкл, дистиллированной через стекло воды прибавляют к приблизительно 10 мкл 10Х реакционного буфера HindiII и 80 мкл воды. Около 1 мкл (около 20 единиц) рестрикционного фермента Hlndlll прибавляют к раствору ДНК плазмиды pBW25, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 90 мин. Около 3 мкл (около 24 единиц) рестрикционного фермента Eco R I и 10 м кл ТМ трис-HCI, рН 7,6, прибавляют в раствор Hindlll-переваренную ДНК плазмиды pBW25, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 90 мин при 37°С. Eco R l-Hlndlll-переваренную ДНК плазмиды pBW25 концентрируют осаждением этанола, нагружают на 1,5%-ный агарозный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока реакционный фрагмент EcoRI-Hlndlll размером около 810 пар оснований не отделится от других продуктов переваривания. Около 0,5 мкг рестрикционного фрагмента Eco R l-Hindlll размером около 810 пар оснований выделяют из геля, приготавливают для лигирования и ресуспендируют в 20 мкл дистиллированной через стекло воды.
Около 4,5 мкг репликативной формы (РФ) ДНК М13тр8 (поставляется из Нью- Инглэнд Биолабс) в 35 мкл дистиллированной через стекло воды прибавляют к 10 мкл 10Х буфера Hlndlll и 55 мкл воды. Около 1 мкл (около 20 единиц) рестрикционного фермента Hindlll прибавляют к раствору ДНК М13тр8, и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение часа. Около 3 мкл (около 24 единиц) рестрикционного фермента ЕсоР1иоколо 10мкл 1Мтрис-НС1. рН 7,6, прибавляют к раствору Hlndlll-nepe- варенной М13тр8 ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение часа. Hindlll-EcoRI-переваренную М13тр8 ДНК собирают осаждением этанола, ресуспендируют в препарате для электрофореза в агарозном геле и большой рестрикционный фрагмент выделяют гель- электрофорезом. Около 1 мкг большого рестрикционного фрагмента Eco R l-Hindlll ДНК М13тр8 получают и суспендируют в 20 мкл дистиллированной через стекло воды. Около 2 мкл большого рестрикционного фрагмента Eco R l-Hlndll N13 mp8, 2 мкл 10Х лигазного буфера, 12 мкл воды и около 1 мкл (около 1 единицы Вейса)Т4 ДНК-лига- зы прибавляют в 3 мкл рестрикционного фрагмента Eco R l-Hlndlll размером около 810 пар оснований плазмиды pBW25, полученную смесь реакции лигирования инкубируют при 16°С в течение ночи.
Клетки IM103 Е. coli, поставляемые фирмой BPL, делают компетентными итрансфе- цируют лигационной смесью в основном в соответствии с методикой, описанной в руководстве по дидезокси (секвенирования) клонирования М13 BRL за исключением того, что изменяют количество ДНК, используемой при трансфекции. Рекомбинатные бляшки идентифицируют инсерционной инактивацией гена, кодирующего о:-фрагмент/ -галактозидазы, что приводит к потере способности расщеплять X-gal в его индиго-окрашенный продукт расщепления. Для целей скрининга шесть белых бляшек собирают в 2,5 мл L-бульона, куда прибавляют 0,4 мл IM103 К12 Е. coli, культивируют в минимальных средах с тем, чтобы гарантировать удерживание эписомы Г, которая несет,ргоАВ в фазе логарифмического роста, бл яш косо держащие растворы инкубируют в воздушной качалке при 37°С в течение 8 ч. Клетки из 1,5 мл - аликвот осаждают и ДНК РФ (репликативной формы) выделяют в основном в Соответствии с методикой щелочного минискринига, описанной Бернобоймом и Доули, 1979, Nuc, Acids Res. 7:1513. Оставшуюся часть каждой культуры сохраняют при 4°С для популяции. Желаемый фаг, обозначенный pM88W26, содержит рестрикционный фрагмент EcoRI-Hlndlll размером около 810 пар оснований плазмиды pBW25, лигиро- ванный к рестрикционному фрагменту Eco R
l-Hlnd ll размером около 7,2 kb M13 mp8.
Около50 мл IM103 Е. coli лог-фазы заражают рМ 8BW26 и инкубируют в воздушной качалке при 37°С в течение 18 ч. Зараженные клетки осаждают путем центрифугирования с малой скоростью, односпиральную ДНК рМ8В W26 получают из культурального надосадочного слоя путем пропорционального увеличения методики, приведенной в руководстве. Односпиральную pM8BW26
мутагенизируют в основном в соответствии сдоктриной Адельманаидр., 1983. ДНК2(3). с. 183-193, за исключением того, что реакцию Кленова осуществляют при комнатной температуре в течение 30 мин, затем при
37°С в течение 60 мин, затем при 10°С в течение 18 ч. Кроме того, обработку SI осуществляют при 20°С, солевая концентрация буферного раствора составляет половину той, которую рекомендуют использовать изготовители и также применяют праймер секвенирования М13 (BRL). Синтетический олигодезоксирибонуклеотидный праймер.
30
543GGAA3TCO GAAATATCC CCTGOGGCCTG CA-3
используют для делеции кодирующей последовательности для аминокислотных остатков с 87 по 261 нативного АПТ.
Полученную мутагенезную смесь ис5 пользуют для трансфекции IM103 К12 Е. coli в основном в соответствии с описанной методикой заражения. Желаемые мутанты идентифицируют анализом на рестрикционный фермент ДНК РФ и секвенированием
0 ДНК по Максаму и Гилберту. Желаемый мутант, который имеет кодирующую последовательность для аминокислотных остатков с 87 по 261 делецированного нативного АПТ. обозначают pM8BW27.
5 Для построения плазмиды pBW28 необходимо большое разнообразие ДНК-фрагмент. Первый из этих фрагментов получают путем прибавления около 20 мкг ДНК РФ pM8BW27 в 20 мкл дистиллированной через
0 стекло воды к 10 мкл 10Х буфера Ndll и 60 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Ndll прибавляют к смеси ДНК плазмиды pM8BW27, полученную реакционную смесь инкубируют
5 при 37°С в течение 2 ч, Ndll-переваренную ДНК плазмиды pM8BW27 осаждают этанолом, собирают центрифугированием и ресуспендируют в 10 мкл 10Х буфера EcoRI и 90 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента EcoRI прибавляют к раствору Ndll-переваренной ДНК плазмиды pM8BW26, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37°С, Eco R l-Ndll-переваренную ДНК плазмиды pM8BW27 подвергают электрофорезу на агарозном геле до отделения от других продуктов переваривания рестрикционного фрагмента Ndel-Eco R I размером около 560 пар оснований, который содержит часть по- следовательнЬсти, кодирующей АПТ, которая охватывает сайт делеции. Рестрикционный фрагмент Mdel-EcoRf размером около 560 пар оснований выделяют из геля, получая при этом около 0,5 мкг желаемого фрагмента, которые суспендируют в 20 мкг дистиллирован- ной через стекло воды.
Второй фрагмент, необходимый для построения плазмиды pBW28, синтезируют (одну спираль одновременно) на автоматизированном ДНК-синтезаторе Две ком племен- тарные спирали, которые гибридизируют с образованием двухспирального сегмента ДНК с областями перекрытия Xbal и Ndel киназируют и ренатурируют в основном в соответствии с методикой примера 2. Линкер имеет следующую структуру
Xbal
5- CTAGAGGGTATTAATAATGTATCGA ТСС С АТА АТТАТТА С ATAG СТ
TTTAAATAAGGAGGAATAACA -3
AAATTTATTCCTCCTTATTGTAT.
Третий фрагмент, необходимый для построения плаЗмиды pBW28, получают путем прибавления около 20 мкг плазмиды рТРА- 103 в 20 мкл буфера ТЕ к 10 мкл 10Х буфера BamHI и 60 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавляют к раствору ДНК плазми- ды рТРАЮЗ, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. BamHI-переваренную ДНК плазмиды рТРАЮЗ осаждают этанолом, собирают центрифугированием и ресуспёндируют в 10 мкл 10Х буфера Eco R I и 80 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Eco R I прибавляют к раствору BamHI- переваренной ДНК плазмиды рТРАЮЗ, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. BamHI- Eco R l-переваренную ДНК плазмиды рТРАЮЗ нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока не отделится от других продуктов перевари- вания рестрикционный фрагмент Eco R I- BamHl размером около 689 пар оснований, который содержит последовательность, кодирующую карбокси-конец АПТ. Около 0,5 мкг фрагмента размером около 689 пар оснований выделяют из геля и затем ресуспёндируют в 10 мкл дистиллированной через стекло воды.
Последний фрагмент, необходимый для построения плазмиды pBW28, выделяют из плазмиды pL110, конструирование которой раскрывается в примере 9. Около 25 мкг плазмиды в 25 мкл буфера ТЕ прибавляют к 10 мкл 10Х буфера Xbal (0,5 М NaCt, 60 мМ трис-HCI, рН 2,9. 60 мМ MgCl2 и 1 мг/мл БСА) и 55 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Xbal прибавляют к раствору ДНК плазмиды pL110, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2ч.ХЬа -переварен- ную ДНК плазмиды осаждают этанолом, собирают центрифугированием и ресуспёндируют в 10 мкл 10Х буфера BamHI и 89 мкл воды. Около 1 мкл (около 5 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавляют к раствору Xbal-переваренной ДНК плазмиды pL110, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин с получением частичного BamHI-nepe- варивания. Xbal - частично - BamHI - переваренную ДНК плазмиды pL110 нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока от других продуктов переваривания не отделится фрагмент Xbal-BamHI размером около 6 kb. Рестрикционный фрагмент Xbal-BamHI размером около 6 kb выделяют из геля, получая при этом около 0,5 мкг рестрикционного фрагмента Xbal-BamHI размером около 6 kb, которые суспендируют в приблизительно 40 мкл дистиллированной через стекло воды. Этот рестрикционный фрагмент Xbal- BamHI размером около 6 kb содержит всю плазмиду pLHO за исключением ВК-ВСН- кодирующей ДНК.
Для построения плазмиды pBW28 следующие фрагменты смешивают друг с другом: около 0,1 мкг (около 8 мкл) рестрикционного фрагмента BamHI-Xbal размером около 6 kb плазмиды pL110, около 0.5 мкг (около 2 мкл) рестрикционного фрагмента Ndei-Eco R I размером около 560 пар оснований плазмиды pM8-BW27, около 0.1 мкг (около 2 мкл) рестрикционного фрагмента Eco R l-BamHI размером около 689 пар оснований плазмиды рТРА-ЮЗ, а также около 0,02 мкг (около 1 мкл) синтетического линкеры Xbal-Ndel размером около 45 пар оснований. Около 2 мкл 10Х лигазного буферного раствора и 1 мкл (около 1 единицы Вейса)ДНК-лигазы Т4 прибавляют к смеси ДНК, полученную смесь реакции лигирования инкубируют при 4°С в течение ночи, Лигированная ДНК составляет желаемую плазмиду pBW28 Ректрикционный сайт и функциональная карта плаз- миды pBW28 представлены на фиг.10.
Лигированную ДНК используют для трансформации клеток ММ294 К12 Е. coll (NRRL В-15625), которые делают компетентными в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 3 за исключением того, что в методике используют 50 мМ СаСЬ. Вследствие присутствия лямбда-pL- промотора и гена, кодирующего температур- но-чувствительный лямбда-pL-penpeccop на плазмиде pBW28, методику трансформации и культивирование трансформантов изменяют некоторым образом. Клетки не подвергают воздействию температуры свыше 32°С во время трансформации и последующего культивирования. Искомые трансформанты E.coll К12 MM294/pBW28 идентифицируют по их тетрациклинустойчивому, ампициллинчувст- вительному фенотипу и путем анализа на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК.
Д. Окончательное конструирование плазмиды pBW32,
Приблизительно 10 мкг ДНК плазмиды pSV2- / -глобин (NRRL B-15928) растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буферного раствора Hindlll, 5 мкл (около 50 единиц) ре- стрикционного фермента Hindlll и 85 мкл воды, реакционную смесь помещают на 2 ч при 37°С. Затем реакционную смесь доводят до концентрации 0,15 М в LICI и после прибавления 2,5 объема этанола и инкубации в ванне с сухим льдом и этанолом ДНК осаждают центрифугированием.
Осадок ДНК после центрифугирования растворяют в 10 мкл 10Х буфера Bglll, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента BglH и 85 мкл воды, реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37°С. После Bglll-переваривания реакционную смесь нагружают на 0,85%-ный агарозный гель и фрагменты разделяют электрофорезом. Гель визуализируют с использованием бромида этидия и ультрафиолетового света и полосу, содержащую желаемый фрагмент Hindlll-Bglll размером около 4,2 kb, отрезают от геля, как описано, Осадок ресуспенди- руют в 10 мкл воды и получают около 5 мкг желаемого рестрикционного фрагмента Hindlll-Bglll размером около 4,2 kb плазмиды pSV2-/3 -глобин. Рестрикционный фрагмент Hlndlll-BamHI размером около 2 kb плазмиды рТРАЮЗ, который кодирует АПТ, выделяют из плазмиды рТРАЮЗ в основном в соответствии с вышеприведенными положениями. Около 5 мкг рестрикционного фрагмента Hindlll-BamHI размером около 2
kb плазмиды рТРАЮЗ получают, суспендируют в 10 мкл воды и сохраняют при -20°С. 2 мкл рестрикционного фрагмента Bglll-Hindlll размером около 4,2 kb плазмиды pSV2- ft -глобин и 4 мкл фрагмента Hlndlll-BanHI размером около 2kb плазмиды рТРАЮЗ смешивают друг с другом и затем инкубируют с 2 мкл 10Х лигазного буфера, 11 мкл воды и 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (около 500
0 единиц) при 4°С в течение ночи. Лигирован- ная ДНК составляет искомую плазмиду рТРА301. Лигированную ДНК используют для трансформации клеток RRI K12 Е. coli (MRRL В-15210), которые делают компетентными
5 для трансформации в основном в соответствии с методикой примера 3. Плазмидную ДНК получают из трансформантов Е. coli K12 RRI/pTPA301 в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт
0 и функциональная карта плазмиды рТРА301 представлены на фиг. 10.
Плазмида р5У2-дгфр содержит ген ди- гидрофолятредуктазы (дгфр), пригодный для селекции трансформированных эукариоти5 ческих клеток и амплификации ДНК, кова- лентно связанной с геном дгфр. 10 мкг плазмиды р5 /2-дгфр, выделенной из Е. coli К12 HBIOI/pSV-2-дгфр, АТСС 37146, смешивают с 10 мкл 10Х буфера PVUII, 2 мкл
0 (около 20 единиц) рестрикционного фермента PVUII и 88 мкл воды, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Реакцию завершают экстракциями фенолом и хлороформом, после чего PVUI 1-перева5 ренную ДНК плазмиды рЗУ2-дгфр осаждают и собирают центрифугированием.
Линкеры BamHI (5 - CCCATCCCG -3 ) киназируют и подготавливают для лигиро- вания следующим образом. К 1 мкг линкера
0 в 5 мкл воды прибавляют 10 мкл 5Х солей киназы 300 мМ трис-HCI, рН 7,8, 50 мМ MgCI2 и 25 мМ (ДТТ), 5 мкл 5 мМ АТФ, 5 мкл БСА(1 мг/мл), 5 мкл 10 мМ спермидина, 19 мкл воды и 1 мкл полинуклеотидкиназы (10
5 единиц/мкл). Эту реакционную смесь затем инкубируют при 37°С в течение 60 мин и сохраняют при -20°С. 5 мкл (около 5 мкг) PVUII-переваренной плазмиды рУ2-дгфр и 12 мкл (околоО,25мкг)киназированных лин0 керов BamHI смешивают и инкубируют при 16оС в течение ночи вместе с 11 мкл воды. 2 мкл 10Х лигазного буфера и 1 мкл (около 1000 единиц) ДНК-лигазы Т4.
10 мкл 10Х реакционного буфера
5 BamHI, 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента BamHI и 48 мкл воды прибавляют в смесь реакции лигирования, которую затем инкубируют при 37°С в течение 3 ч, Реакционную смесь нагружают на 1%-ный агарозный гель и искомый фрагмент размером около 1,9 kb, содержащий ген дгфр, выделяют из геля. Все прибавления линкеров, осуществляемые в данном примере, очищают традиционным образом на агарозном геле с тем, чтобы уменьшить вероятность присутствия многолинкерных последовательностей в конечном векторе. Полученный фрагмент в количестве около 3 мкг суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ.
Затем приблизительно 15 мкл (около 1 мкг) плазмиды рТРА-301 переваривают ре- стрикционным ферментом BamHI, как указано выше. Поскольку существует уникальный сайт BamHI в плазмиде рТРА301, данное BamHI-переваривание генерирует линейную ДНК плазмиды рТРА301. BamHI-переварен- ную плазмиду рТРАЮЗ осаждают этанолом и ресуспендируют в 94 мкл и фосфатазируют с использованием 1 мкл телячьекишечной щелочной фосфатазы (Коллаборатив Рисерч, Инк., 128 Спринг Стрит, Лексингтон, Минне- сета 02173) и 5 мкл 1 М трис-HCI, рН 9, при 65°С в течение 45 мин. ДНК экстрагируют фенол: хлороформом, затем экстрагируют хлороформ: изоамиловым спиртом, осаждают этанолом и ресуспендируют в 20 мкл воды. 10 мкл (около 0,25 мкг) фосфатазированной плазмиды рТРАЗО прибавляют к 5 мкл BamHI, дгфр-генсодер- жащего рестрикционного фрагмента (около 1,5 мкг), 3 мкл 10Х лигазного буфера, 3 мкл (около 1500 единиц) ДНК-лигазы Т4 и 9 мкл воды. Эту смесь реакции лигирования инкубируют при 15°С в течение ночи; лигирован- ная ДНК составляет желаемую ДНК плазмиды рТРАЗОЗ.
Плазмиду рТРАЗОЗ используют для трансформации Е. coli K12 RRI (NRRL В- 15210), полученные трансформанты Е. coli К12 RRI/рТРАЗОЗ идентифицируют по их ампициллинустойчивому фенотипу и анализом на рестрикционный фермент их плаз- мидной ДНК. Плазмиду рТРАЗОЗ выделяют из трансформантов в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды рТРАЗОЗ представлены на фиг. 10.
Для выделения рестрикционного фрагмента Eco R l-Bglll размером около 2,7 kb, который кодирует репликон рВ R 322 и ген /3-лактамазы из плазмиды рТРА301, около 10 мкг плазмиды рТРА301 переваривают в 400 мкл полного реакционного объема с использованием 20 единиц рестрикционного фермента Bglll в IX буфера Bglll при 37°С. После Bglll-переваривания концентрацию трис-HCI доводят до 110 мМ и 20 единиц рестрикционного фермента Eco R I прибавляют к Bglll-перевэренной ДНК
Данную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Eco R l-Bglll-ne- реваренную ДНК нагружают на агарозный гель и подвергают э л ёктрофорезу до тех 5 пор, пока рестрикционный фрагмент Eco R l-Bglll размером около 3,7 kb не отделится от других продуктов переваривания, после чего фрагмент размер ом около 2,7 kb выделяют и подготавливают для лигирования. 0 Для выделения рестрикционного фрагмента, содержащего ген дгфр, плазмиду рТРАЗОЗ подвергают двойному перевариванию рестрикционными ферментами Hindlll Eco R I, в результате чего выделяют и вос5 станавливают рестрикционный фрагмент Eco R l-Hindlll - размером около 2340 пар оснований, который содержит указанный ген дигидрофолятредуктазы.
Для выделения рестрикционного фраг0 мента Hlndlll-Sstl размером около 2 kb плазмиды рТРАЗОЗ, который содержит область кодирования карбокси-конца тканевого активатора плазминогена человека и промотор SV40. плазмиду рТРАЗОЗ подвер5 гают двойному перевариванию рестрикционными ферментами Hindlll и Sstl в IX буфере Hindlll. Фрагмент размером около 1,7 kb выделяют из геля и подготавливают для лигирования.
0 Для выделения рестрикционного фрагмента Xholl (совместимого для лигирования с областью перекрытия Bgl(ll)-Sstl) размером около 680 пар оснований плазмиды pBW28, который содержит область кодиро5 вания аминоконца модифицированного АПТ, около 10 мкг плазмиды pBW28 переваривают ферментом Xholl в IX буфере Xholl (0,1 М трис-HCI, рН 8, 0,1 м MgCl2, 0,1% тритон X - 100 и 1 мг/мл БСА),
0 Xholl-переваренную ДНК извлекают осаждением этанола и затем переваривают ферментом Sstl. Xholl-Sstl-переваренную ДНК нагружают на акриламидный гель и желаемый фрагмент выделяют из геля и под5 готавливают для лигирования.
Около 0,1 мкг каждого из указанных фрагментов: рестрикционного фрагмента Eco R l-Bglll размером около 2,7 kb плазмиды рТРА301, рестрикционного фрагмента
0 Eco R l-Hindlll размером около 2,34 kb плазмиды рТРАЗОЗ, рестрикционного фрагмента Sstl-Hindlll размером около 1,7 kb плазмиды рТРАЗОЗ и рестрикционного фрагмента Sst l-Xholl размером около 0,68 kb плазми5 ды pBW28 лигируют вместе с образованием плазмиды pBW32. Лигационную смесь используют для трансформации Е. coli K12 ММ293, как описано в примере 3 за исключением того, что в методике используют 50 мМ СаС12. Трансформанты идентифицируют
по их ампициллинустойчивому фенотипу и анализом на рестрикционный фрагмент их плазмидной ДНК. ДНК плазмиды pBW32 получают из трансформантов Е. coll K12 MM294/pBW32 в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pBW32 представлены на фиг.10.
П р и м е р 17. Конструирование плазмид pLPChd 1 и pLPChd 2.
Около 20 мкг плазмиды pBW32 в 20 мкл буфера ТЕ прибавляют к 10 мкл 10Х буфера Bam HI и 60 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавляют к раствору ДНК плазмиды pBW32, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. BamHI-ne- реваренную ДНК плазмиды pBW32 осаждают этанолом, собирают центрифугированием и суспендируют в 5 мкл 10Х буфера Кленова, 45 мкл воды и 2 мкл (около 100 единиц) фермента Кленова. Реакционную смесь инкубируют при 1б°С в течение 30 мин, затем реакционную смесь нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до полного разделения продуктов переваривания. Обработанный раствором Кленова BamHI-рестрикционный фрагмент размером около 1,9 kb плазмиды pBW32. содержащий ген дгфр, выделяют из геля и подготавливают для лигирования в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 12А. Около 4 мкг искомого фрагмента получают и суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ.
Около 200 мкг плазмиды pLPChyg 1 в 100 мкл буфера ТЕ прибавляют к 15 мкл 10Х буфера Eco R I и 30 мкл воды. Около 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Eco R I прибавляют к раствору ДНК плазмиды pLPChyg 1, полученную реакционную смесь инкубируют при 37оС в течение 10 мин. Короткий период реакции рассчитывают для получения частичного Eco R l-nepe- варивания. Плазмида pLPChyg 1 имеет два рестрикционных сайта Eco RI, один из которых находится в пределах кодирующей последовательности гена, придающего устойчивость к гидромицину (HmR), и желательно инсерцировать дгфр-генсодержащий рестрикционный фрагмент в сайт Eco RI плазмиды pLPChyg 1, который не содержится в гене дгфр. Частично - Eco R I - переварен-, ную ДНК плазмиды pLPChyg 1 нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока отрезанная ДНК плазмиды pLPChyg 1 не отделится от неотрезанной плазмидной ДНК и других продуктов переваривания. Отрезанную ДНК выделяют из геля и подготавливают для лигирования в основном в соответствии с методикой примера 12А. Около 2 мкг Eco R I - отрезанной плазмиды pLPChyg 1 получают и суспендируют в 25 мкл буфера ТЕ. К данной пробе прибавляют около 5 мкл (около 25 единиц)
фермента Кленова, 5 мкл 10Х буфера Кленова и 40 мкл воды, полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение 60 мин.Кленов - обработанную, частично - Есо RI - переваренную ДНК затем экстрагируют
0 дважды фенолом и затем один раз хлороформом, осаждают этанолом и ресуспенди- руют в 25 мкл буфера ТЕ.
Около 5 мкл Кленов - обработанного рестрикционного фрагмента ВатН1размером
5 около 1,9 kb плазмиды pBW32 и около 5 мкл Eco R I - разрезанной ДНК плазмиды pLPChyg 1 смешивают друг с другом, в смесь ДНК прибавляют 1 мкл ЮХлигазного буфера, 5 мкл воды, 1 мкл (около 500 единиц) Т4 ДНК0 лигазы и 1 мкл (около 2 единиц) Т4 ДНК-лига- зы и полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Лигиро- ванная ДНК составляет искомую плазмиду pLPChyg 1 и искомую плазмиду pLPChyg2, ко5 торые отличаются друг от друга только в отношении ориентации фрагмента размером около 1,9 kb, который содержит ген дгфр.
Лигированную ДНК используют для трансформации клеток Е. coli K12 НВ101,
0 которые делают компетентными для трансформации в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Трансформированные клетки высевают на L-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина, ампи5 циллинустойчивые трансформанты анализируют анализом на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК с тем, чтобы идентифицировать трансформанты Е. coli K12 НВ101 (pLPChdl иЕ-. coli K12 НВ101) pLPChd2. Для
0 целей данного раскрытия плазмиду pLPChdl обозначают плазмидои pLPChd. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pLPChd представлены на фиг. 11. ДН К плазмиды р LPChd 1 и pLPChd2
5 выделяют из соответствующих трансформантов в основном в соответствии с методикой примера 1.
Пример 8. Конструирование плэзми- ды phd.
0 Для конструирования плазмиды phd необходимо получить ДНК плазмиды pLPChdl, используемую в качестве исходного материала при конструировании плазмиды phd из клеток хозяина Е. coli, которые не содержат
5 аденинметилазу, такую, которая кодируется геном dam, продукт которого метилирует адениностаток в последовательности 5 - GATC З1 . Ecoli K12 GM48 (NRRL В- 15725) не содержит функциональную dam-мё- тилазу и поэтому представляет собой
пригодный хозяин Для использований Qe- лях получения ДНК плазмиды pl PChdl, применяемой в качестве исходного материала при конструировании плазмиды phd.
Клетки Ё. coli K12 GM48 культивируют и делают компетентными для трансформации, плазмиду pLPChygl используют для трансформации клеток Е coll K12 GM48 в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Трансформирование клетки высевают на L-arap, содержащий ампициллин и как только ампициллинустойчи- вые трансформанты Е. coli K12 GM48/ - pLPChdl образуют колонии, одну такую колонию используют для получения ДНК плаз- миды pLPChdl в основном в соответствии с методикой примера 1 Около 1 мг ДНК плазмиды pLPChdl получают и суспендируют в приблизительно 1 мл буфера ТЕ
Около 2 мкг ДНК плазмиды pLPChdl в 2 мкл буфера ТЕ прибавляют к 2 мкл 10Х буфера BCI1 (750 мМ KCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,4,100 мМ MgCl2,10 мМ ДТТ и 1 мг/мл БСА) и 14 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента BCII прибавля- ют к раствору ДНК плазмиды pLPChdl, полученную реакционную смесь инкубируют при 50оС в течение 2 ч Реакцию прекращают экстрагированием смеси oflViri раз фенолом и два раза хлороформом
Около 1 мкл ВСИ - переваренной ДНК плазмиды pLPChdl прибавляют к 2 мкл 10Х лигазного буфера, 8 мкл воды и 1 мкл (около 50 единиц) Т4 ДНК-лигазы Смесь реакции лигирования инкубируют при 16°С в тече- ние ночи и лигированная ДНК составляет искомую плазмиду phd. Плазмида phd происходит в результате делецИи дополнителШШ линкеров ВСИ, которые присоединяются Тзо время конструирования плазмиды pLPea и двух смежных рестрикционных фрагментов ВСИ, имеющих общий размер около 1,45 kb от плазмиды pLPChdl. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды phd представлены на фиг.11. Плазмида phd со- действует экспрессии любой ДНК-последовательности из энхансера вируса ВК-позднего промотора аденовируса в соответстви с1 йа стоящим изобретением, поскольку экспресси- руемая ДНК легко поддается инсерцйи в правильном положении для экспрессии в единственном сайте BCI на плазмиде phd.
Лигированную ДНК используют для трансформации Е. coli K12 GM48 в основном в соответствии с методикой, описанной в приме- ре 3. Трансформированные клетки высевают на L-arap, содержащий ампициллин- и ампи- циллинустойчивые трансформанты Е. coll K12 GM48 (phd идентифицируют анализом на рё- стрикационный фермент их плазмидной ДНК).
При мер 19 Конструирование плазмиды pH1-HD.
Плазмида рСН2А5 содержит фрагмент кДНК, который кодирует вариабельную область тяжелой цепи мышиного монокло- нального антитела KS1/4, присоединенный к фрагменту геномной ДНК, который кодирует человеческую постоянную область тяжелой цепи иммуноглобулина Е. coli K12 ММ294/рСН2А5 можно получить из Нор- зерн Риджионал Рисерч Лаборатори под депозитарным HONfep tiM NRRL В-18360 Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды рСН2А5 представлены на фиг.13 прилагаемых чертежей. Плазмидную ДНК экстрагируют из культуру в основном в соответствии с методикой примера 1, за исключением того, что температура инкубации составляет 37°С.
Около 10 мкг плазмиды рСН2А5 разрезают рестрикционным ферментом Eco R I в основном в соответствии с методикой примера 5. ДНК обрабатывают Кленовым и ликерами BamHI (поставляются Нью Инглэнд Биолабэ) и затем прибавляют в основном в соответствии с методикой примера 2, ДНК переваривают рестрикционным ферментом BamHI в основном в соответствии с методикой примера 5. Рестрикционный фрагмент BamHI-Eco R l/BamHI размером около 7,4 kb затем выделяют из агарозного геля в основном в соответствии с методикой примера 12. Данный фрагмент затем лигируют в ВСИ - переваренный вектор phd в основном в соответствии с методикой примера 2. ДНК затем трансформируют в Е. coll, повторно выделяют, плёзмиду с правильной ориентацией (доказываемой фрагментом Maell -Stu2 размером около 780 пар оснований) обозначают плазмиды pHI-HD.
П р и м е р 20. Конструирование трансформантов эукариотных клеток хозяев векторов экспрессии.
Настоящие векторы экспрессии содержат энхансер ВК. Энхансер ВК стимулирует экспрессию гена в присутствии генного продукта Е1 А. Поскольку клетки 293 существенно экспрессируют генный продукт Е1А, клетки 293 представляют собой эффективный хозяин и для векторов эукариотической экспрессии настоящего изобретения. Клетки 293 являются клетками человеческой первичной почки, трансформированными аденовирусом типа 5 (следует отметить, что в способе настоящего изобретения может быть использован любой тип аденовируса с тем, чтобы обеспечить получение генного продукта Е1А), и они доступны из АТСС под flenosnYapHbiM номером С RL 1573. Однако векторы экспрессии настоящего изобретения функционируют в широком круге клеток хозяина, даже если генный продукт Е1А от- сутствет. Кроме того, генный продукт Е1А может быть интродуцирован в не-Е1А-про- дуцирующую клеточную линию либо трансформацией вектором, который содержит ген Е1А, либо разрезанной аденовирусной ДНК, либо путем заражения аденовирусом.
Описанная ниже методика трансформации касается клеток 293 в качестве линии клеток хозяина, однако методика как правило приемлема для большинства линий эука- риотических клеток. Клетки 293 получают из АТСС под депозитарным номером CRL1573 в 25 мм2 колбе, содержащей конфлюентный монослой около 5,5 хЮ6 клеток в минимальной питательной среде игл с 10%-ной термо- инактивированной лошадиной сывороткой. Колбу инкубируют при 37°С, среду меняют дважды в неделю. Клетки субкультивируют путем удаления среды, промывки раствором сбалансированных солей Хэенка (Гибко), прибавления 0,25%-ного трипсина в течение 1-2 мин, промывки свежей средой, аспирации и розлиаа в новые колбы при соотношении субкультивации 1:5 или 1:10.
За один день до трансформации клетки высевают при 0,7 хЮ6 клеток на чашку. Среду меняют за 4 ч до трансформации. Стерильную, этанолосажденную плазмидную ДНК, растворенную в буфере ТЕ, используют для получения 2Х ДНК-СаС1-раствора, содержащего 40 мкг/мл ДНК и 250 мМ CaCl2 2Х HBS, получают содержащим 280 мМ Nad, 50 мМ HepeS и 1,5 мМ фосфат натрия, при этом рН раствора доводят до 7,05 -7,15. Раствор 2Х ДНК-СаСг прибавляют по каплям к равному объему стерильного 2Х HBS, 1 мл стерильную пластмассовую пипетку с хлопчатобумажной пробкой вставляют в смесительную пробирку, которая содержит 2Х HBS, и пузырьки вводят продувкой при одновременном прибавлении ДНК. Кальций фосфатный ДНК-осадок образуют без перемешивания в течение 30- 40 мин при комнатной температуре.
Затем осадок смешивают путем отсасывания пипеткой, используя пластмассовую пипетку, и 1 мл (на чашку) осадка прибавляют непосредственно к 10 мл питательной среды, которая oxBaYbmaef рёпйциентныё клетки. Через 4 ч инкубировали при 37°С среду заменяют DMEM с 10%-ной сывороткой плода коровы и клетки инкубируют 72 ч перед подачей селективного давления. Для плазмид, которые не содержат селектируемый маркерГфункцио нйрующий в эукариот- ных клетках, методика трансформации включает смесь плазмид: вектора экспрессии, который не содержит се лёктируемый
маркер, и вектора экспрессии, который содержит селектируемый маркер, функционирующий в эукариотных клетках. Эта методика совместной трансформации позволяет осуществить идентификацию клеток, содержащих обе трансформирующие плазмиды.
Для клеток, зараженных плазмидами, содержащими ген, придающий устойчи0 вость к гигромицину, гигромицин прибавляют в питательную среду до конечной концентрации около 200-400 мкг/мл. Затем клетки инкубируют при 37°С в течение 2-4 недель при замене сред с 3-4-дневными
5 интервалами. Полученные гиромицину- стойчивые колонии переносят в отдельные колбы с культурами для определения характеристик. Выбор неомицин (G418 также используют вместо неомицина) - устойчивых
0 колоний осуществляют в основном в соответствии с методикой отбора для гигроми- цинустойчивых клеток за исключением того, что неомицин прибавляют до конечной концентрации 400 мкг/мл, а не гигромицин.
5 Клетки 293 являются дгфр-положительны- ми, так что трансфоманты 293, которые содержат плазмиды с геном дгфр, не отбирают просто на основании дгфр - положительного фенотипа, что является способностью ра0 сти в средах, не содержащих гипоксантин и тимин. Линии клеток, которые не содержат функциональный ген дгфр и которые трансформированы дгфр-содержащими плазмидами, могут быть отобраны на основании
5 фенотипа дгфр+.
Использование гена дигирофолят ре- дуктазы (дгфр) в качестве селектируемого маркера для введения гена или плазмиды в линию клеток, лишенных дгфр. и последую0 щее использование метотрексата для амплификации числа копий плазмиды хорошо известно в литературе. Хотя использование дгфр в качестве селектируемого и амплифи- цируемого маркера в дгфр-продуцирующих
5 клетках еще не исследовано достаточно, можно предположить на основе литературных данных, что дгфр можно использовать в качестве селектируемого маркера в дгфр- продуцирущих клетках и для генной амплифи0 кации. Использование настоящего изобретения ограничивается селектируемым маркером. Более того могут быть использованы амплифицируемые маркеры. Такие, как гены металлотионеина, гены аденозиндеами5 назы или члены многогенустойчивого семейства, например, Р-гликопротеид. В клетках 293 выгодно осуществлять трансформацию вектором, который содержит селектируемый маркер, такой, как ген. придающий устойчивость к гигромицину В, а затем амплификацию
с использованием метотрексата, который не может быть испрльзован для селекции мышиных дгфр - содержащих плазмид в клетках 293.
Линия клеток AV12 (АТСС С RL9595) трансформируется в основном в соответствии с методикой, описанной для клеток 293. Клетки AV12 также существенно экспресси- руют продукт гена Е1А и являются предпочтительным хозяином для эукариотичесКйх векторов экспрессии настоящего изобретения. Однако в отличие от клеток 293 клетки AV12 непосредственно отбирают метотрек- сатом (200-500 нМ) при трансформации вектором, содержащим мышиный ген дгфр. Для экспрессии тяжелой цепи необходимо трансформировать клетки AV12 любым вектором экспрессии, который кодирует тяжелую цепь. Однако тяжелая цепь не будет секретировать в надосадочный слой, если клетки AV12 не будут совместно трансформироваться вектором, кодирующим лёгкую цепь. Легкие цепи будут секретировать из клеток хозяина после трансформации вектором, кодирующим легкие цепи. Таким образом, путем совместной трансформации и селекции клеток AV12 экспрессированы различные комбинации легких и тяжелых цепей. Для исследования получения полностью собранного секретируемого иммуноглобулина необходимо таким образом исследовать присутствие секретируемой тяжелой цепи.
Пример21. Исследование получения иммуноглобулина.
Метотрексатустойчивые трансформанты, полученные в примере 17, выращивают на 100 м чашках для культивирования тканевой культуры при плотности несколько сотен клеточных клонов на чашку для культивирования тканевой культуры. Среды декантируют и клетки промывают дважды 5 мл-аликвотами раствора сбалансированных солей Хэнка (Гибко). Раствор стерильного 0,45%-ного агара (агароза типа 4 Сигма, каталожный номер А3643, Сигма Кемикал Ком- пани, P.O. Бокс 14508, Сент-Луис, Мисмури 63178) получают смешиванием 1 мл 1,арного агара (47оС) с 3 мл Дульбекко модифицированной соли Игл (Д М Е) (Гибко) (37°С) и 2 мл этого 0,45%-ного агарового раствора наслаивания вокруг клеток.
Нитроцеллюлозные фильтры (Шлейшер энд Шуелл, Инк., Киин, Нью-Гемпшир 03431) кипятят и затем автоклавируют 2 ч для удаления смачивающего вещества, которое является токсичным для клеток. Фильтры затем помещают поверх агарового слоя и после удаления пузырьков воздуха чашки инкубируют при 37°С в течение 1 -3 ч. Фильтры, ранее меченые для того, чтобы указать
первоначальную ориентацию фильтра на чашке с тем, чтобы облегчить дальнейшую идентификацию колонии, затем снимают и помещают и PBS (50 мМ трис-HCI, рН 7,2 и 5 150 мМ NaCI).
Для сохранения клеток на чашке жизнеспособными во время анализа фильтров клетки покрывают слоёМ смеси объемом 8 мл, содержащей 2 мл 1,8%-ного агара (47°С), 2 мл
0 солей ОМЕ(37°С)и4мл солей ДМЕ с20%-ной сывороткой плода коровы (37°С). Клетки затем помещают в инкубатор при 37°С.
Все промывки и реакции, осуществляемые в отношении фильтров, проводят в тот
5 момент, когда фильтры находятся на качающейся платформе. Фильтры вначале блокируют инкубированием при комнатной температуре в 5%-ном молоке в pBS. Затем фильтры промывают (5 мин промывка) четы0 ре раза в PBS, 10 мкг/мл биотинилирован- ного козлиного античеловеческого тяжелоцепного (Вектор Лабораториез, Инк., 30 Ингоулд Rd., Берлингэйм, Калифорния 94010) в 2,5%-ном бычьем сывороточ5 ном альбумине прибавляют к фильтру (в достаточном количестве с тем, чтобы покрыть фильтр), который затем инкубируют при 37°С в течение 1 ч.
Поликлональное антитело можно пол0 учить методом, описанным в структурных концепциях в иммунологии и иммунохимии Е.А.Кабатом; опубликованы в 1968 году Хол- том, Ринехартом и Уинстоном. Моноклональ- ное антитело, которое также пригодно для
5 использования в анализе, можно получить, как раскрыто в работе Кеглера и Милстейна, 1975, Нэйчур, 256, 495 или, как раскрыто в патенте США № 4696895, Европатенте № 205046; Лауреллом и др., 1985, FEBS 191/1):
0 75, Сузуки и др., 1985, J. Biochem 97:127-138 и Европатенте № 138222. Авидин Д и биоти- нилированную пероксидазу ложечницы приморской (HR Р), используемые в анализе, получают в оборудовании Вектастаин ТМ
5 (вектор Лабораториез, Инк.). Биотин также получают из Вектор Лабораториез, Инк.
Фильтры промывают четыре раза PBS при 4°С. Затем получают авидин D и биоти- нилированную пероксидазу ложечницы
0 приморской и прибавляют, как описано в руководстве изготовителей в оборудовании Вектастаин ТМ (Вектор Лабораториез, Инк). Фильтры инкубируют HRP-сопряженным авидином D в течение 1 ч при 4°С (более
5 длительные периоды инкубирования, т.е. в течение ночи, могут быть использованы в том случае, когда секретирует небольшое количество протеина); затем фильтры промывают 4 раза в PBS при 4°С.
Для проявления индикаторного цвета на фильтрах около 30 мг HRP - цветопрояв- ляющего реагента (4-хлор-1 -нафтол, Сигма), растворенного в охлажденном на льду 100%-ном метаноле прибавляют к 50 мл PBS и 30 мкл 30%-ного раствора НаОа. Эту смесь прибавляют к нитроцеллюлозным фильтрам, которые инкубируют при комнатной температуре до проявления цвета. Колонии, секретирующие наибольшую часть антитела изобретения, отмечаются на фильтрах не только посредством наиболее раннего появления цвета, но также посредством более темных пятен на фильтре.
После появления цвета фильтры вновь перегруппируют с первоначальными чашками для определения того, какие колонии ассоциируются с какими пятнами на фильтре. Колонии, секретирующие большую часть антитела, затем отбирают и используют для получения антитела.
Специалист поймет, что приведенный анализ является только иллюстративным атрибутом способа идентификации высоко- секретирующих линий клеток. В способе можно также использовать целый ряд методик анализа, например реакцию двойного
антитела можно использовать таким образом, что бмотинилированное козлиное античеловеческое тяжелоцепочечное антитело замещают козлиной античеловеческой тя- желой цепью (IgG) и биотинилированным антикозлиным IgG антителом.
Формула изобретения Способ экспрессии цепей химерного антитела, заключающийся в том, что конст- руируют рекомбинантную плазмидную ДНК pPI-HD, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела RSI/4-антиге- на с аминокислотной последовательностью
Gln Ile «л V.I Gin Чет Gly ProGlu leu Lyi
Lys Pro Cly Glu Thr V.I ly. He Ser Cyt Lys AlaSer Cly Tyr
Thr Phe Thr Asc T/r Gly Met A.n Trp V.I ly, GinThe Pro Gly
Ly. Gly Leu Ly Trp Met Gly Trp lie Ala Thr TyrThr Gly Olu
Pro Thr Tyr Al« Aip Phe Lyt Oly Ar| Phe AltPhe Ser Leu
Clu Tbr Ser Al. Ser Thr Al. Phe Leu Gin lie GinGin Pro Gin
Asn Met Arg Tbr Met Al. Thr Tyr Phe Cyi V.I ArgPhe lie Ser
Lye Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser V.I ThrV.I Ser Ser
полученной плазмидой трансформируют штамм культивируемых эмбриональных клеток почки человека, зараженных вирусом типа 5, и культивируют.
Использование: в иммунологии и медицине для диагностики прогнозирования и лечения болезненных состояний, включая аденокарциному. Сущность изобретения: сконструированы эукэриотические векторы экспрессии, которые могут быть использованы для создания модифицированных и химерных производных KSI/4.
PvuII
PstI
tern HI
CH2AS1G3
Eco RI I -45Јbp
Bam HI СН2А5Ю4-
EcoRI
-458 bp
Hind ПЬ
-7ССОЬр
Hindni
-eocobp
PvuII
. 2.
Bam HI
1780541
Hind II
Ao
Xbal
НраП PvuII
PvuII Bam HI
Pvu II Bam HI
Xbal
PvuII
PvuII
Фиг.З
StuI
SstI
Ace I
stul /| Shi I
Hindm Bglll
P
PstI
Hind III
Pvu ll Hind III
Bglll
f.5
SstI
PvuII
Hind III SstI
Slul Pvu II
c° RI .Hind III EcoRI Kpnl
Bgln PstI PvuH Smal PvuII PstI
Hpal
Bam HI EcoRl PvuU
Bglll Hind III
Ndol- /( N-Hindm
AccIStuI Bell
PstI
JI 1 Bell
Stul Stul/Pvull . Stu I
1780541
EcoRI PstI
Bam HI
EcoRI
PstI
Bam HI
Hind III
Фиг 6
ГУ
Г
Bam HI/RI Bgl III Bam HI
Hlndm I/Bam H;
Bell
J4de I/Bam HI
/
-:Hindm
Eco
Pvull
Bell Hind III Bell
Stu I/Pvu П Stu I/Bam HI
Bgfll pLPChd
Bgtn
Bam HI/RI
BsmHI
Hind Ш R I/Bam HI
Nde I/Cam HI
Bell
-Bell
-SluI/Pvu П
SluI/BsmHI
oR Hindm -513 bp
Mae II
-GAA ATA AAA CGT ЈrЈ I L-Glu lie Lys Arg
Ec°1Rl/H:ndm 513bp Mae II
r GAA ATA AAA GGT
EcoRl lle 1У8 G|y
Ndal
CHKC2 ia
Фиг 12
EcoRI
I -432 bp
Mae III Hind III
Bam HI
CH2A5
PstI
TT Eco RI P™11 I -458 bp
HinciHI
-5700 bp
EcoRl
-513 bp
39 II
5S4bp
Bgll
EcoRI
PGKC2310
EcoRl 435bp Мэе III
-1,133 bp
EcoRl
pG2A52
Й/г. /4
| Навесной террасер-рыхлитель | 1958 |
|
SU120694A1 |
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
| Приспособление для закрепления концов арматурной проволоки | 1959 |
|
SU125023A1 |
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
| 0 |
|
SU88994A1 | |
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
