Способ получения человеческой М @ О @ -дисмутазы Советский патент 1992 года по МПК C12N15/52 C12N15/81 

Изобретение относится к биотехнологии и генетимеской инженерии, в частности к способам получения человеческой MnOjr-дисмутазы для терапевтических целей, например, в качестве антивоспалительного средства.

Способ заключается в том, что из плацентарной или печеночной ткани человека выделяют мРНК, получают поли (А)+РНК, синтезируют двунитевую кДНК, конструируют банк кДНК, выделяют

последовательность ДНК, кодирующую Мп-О-дисмутазу, при помощи зондо|

i С С С S -TGITA ТТ ТС TCIGTIACITT-3

,и Т- Т Т

АСА

S TCIGTIAC тт ТСССА TTIAT-J

G Т G

или последовательности кДНК гена Мп02-дисмутазы человека, последова- тельлость ДНК достраивают до стартового кодона или стоп-кодона, непосредственно за стартовым кодоном гена размещают митохондриальную лидерную /ш ;иГнальнУ последовательность ДНК Мп02-дисмутазы S.cerevisiae или человека, последовательность ДНК. ко Дирующую Мп02-дисмутазУ используют , Для конструирования вектора экспресо о

СА)

317 И6104

сии, состоящего из промоторов ADHI ЁВ1 1161/EBI 1164 + EBI 1167/EBI 1160 ADHII, пар олигонуклеотидов формулы

EBI 1161 Sph I 5«

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAGl С

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTCTTCT TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAAATAGTGAAGAACAAA

EBI 1164 5 TG

EBI 1167 5

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA GAAGAACCATTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGAT ТСААСТАТТААС AGTTGATAATTGAGCT 5 EBI 1160

Xho I

EBI 1161/EBI 1164 + EBI 1159/EBI 1168 формулы EBI 1161

5

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAG С - «

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTCTTCT TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAAAiAGTGAAGAACAAA

EBI 1164 5 TG

EBI 1159 5

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA. GAAGAACCATTTTATCTTATAGTTCGATGTtTTTCGTATGTTAGTTGAT TCAACTATTAACTATATCf

AGTTGATAATTGATATAGAGCT5 EBI 1168

Xho I

EBI 1161/EBI 1164 + EBI 1165/EBI 1166 формулы EBI 1161 5

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAG С

AAATATTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTCTTCT TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAAATAGTGAAGAACAAA

EBI 1164 5 TG

EBI 1165 5

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA GAAGAACCATTATCXTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGAT TCAACTATTAACTATATCGTAATAC

AGTTGATAATTGATATAGCATTATGAGCT 5 EBI 1166 Xho I

или CUP1, сигнала инициирования стоп-кодона и терминатора ADHII, по- митохондриальной лидерной или- - лученными векторами экспресии pWS550A, сигнальной последовательности. Saccha- или pWS4$OA, или рИ8491А, или готчусев cerevisiae или человека pWS371A, или pWS372A или pWS373A,

или - АВ, или рЕ025 - АС, или рЕ02Т - AD, или , или pEOAl, или , или , или рЈОМ, или , или рЕ050, или pЈ05t трансформируют штаммы Saccharomyces cerevi- siae или плазмиду pSV2 dhfr -SOD1 или pSV2 dhfr, которой трансформируют штаммы культивируемых клеток, культивируют трансформированные клетки, выделяют и очищают целевой продукт путем экстракции, осаждения и хроматографии ,

При осуществлении предлагаемого способа используют промотор ADHI (pES103), регистрационный номер DSM 013 (фрагмент Ваш Hl/XhoI с длиной 1500 п.о. (пар оснований); ускоренный промотор ADHI, регистрационный номер DSM 4016 (pWS 323E) (фрагмент Bam HI/Xho I с длиной М)0 ПлО.);

терминатор AIHII (pGD2), регистрационный номер DSM 4014, (фрагмент

ХЪа I/Hind III с длиной 336 п„о.); буфер Bam HI: 150 мй NaCl, 6 мМ трис-HCl, рН 7,9, 6 мМ MgCl2, 100 мкл/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота (АСКРС); буфер Коре: 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgClft, 50 мН NaCl; раствор денатурации: 0,5 М NaOH, 1,5 М NaCl;

раствор Денхардта (50х}:.1 г поливини л пи рроли дона с мол,массой ЗбОООО, 1 г Фиколла, 1 г АСКРС, до 100 мл;

E.coli С 600: F, sup Е44, thil, thrl, leuB6, lac YT, ton A21tfTATCC 3372);

E.coli IM fOlrsup E, thiA (lac-pro AB), F, tra B36 pro AB, lac , Д15;

буфер X: 100 мМ NaCl, 50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ MgClfc, 1 мМ дитиотрие- тола (ДТТ);

буфер Y: 10 мМ трис-HCl, рН J,5, 60 мМ NaCl, 10 мМ MgCl4 1 мМ каптоэтанола, 100 мкг/мл АСКРС - -- раствор гибридизации соответствует - раствору предварительной гиЬ 0иди$аг1Л ции, но без ДНК из спермы лосося содержащий фрагмент Кленова реакцией ный раствор 22 мкл ДНК/Н20, 2,5 мкл 10-буфера НТР (0,5 М трис-HClг рН 7,2, 0,1 M MgS04, 1 мМ ДТТ, 500 мкя/ /мл АСКРС} по 1 мкл 2 мМ dATP, dCfP

dTTP, 2,5 ед. фрагмента Кленова (0,5 мкл);

17 11610

0

5

0

- Л-буфер: 100 мМ трис, рН 7,5, 0 мМ MgCJ4, 1 мМ этилендинитрилотетраук- сусной кислоты ЭДТУК); агар ЛБ: жидкая среда ЛБ, 15 г/л бак- тоагара;

жидкая среда ЛБ: 10 г/л бактотрипто- на, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 М NaOH до рН 7, раствор лигирования: 66 мМ трис-НС1, рН 7,6, 10 мМ MgCl2, 5 мМ ДТТ, 1 мМ АТР, 1 ед. Т -ДНК-лигазы; раствор нейтрализации: 0,5 М трис- HCl, рН 7,50,t,5 M NaCl; буфер Z:50 мМ КС1, 50 мМ NaCl, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgCla; раствор предварительной гибридизации: 5 ч буфер SSC, 5 раствор Денхардта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 6,8, 1 мМ Na2P407, 100 мкМ АТР, 0,1% додецилсульфата натрия( 100 (50) мкг/мл денатурированной обработанной ультразвуком ДНК из спермы лосося;

5 pURA3 регистрационный номер ISM 4015; S.cerevisiae DBY47:a,leu 2, his 3, trpl Ura 3;

среда СЦ-УРА: 0,67 % BYNB(Difco), 2% глюкозы, 2% 50 смеси аминокислот (г/л): гистидин 1; лейцин 6; триптофан 2,5; лизин ; аденин 1,2; аргинин 2; меТионин t, фенилаланин 6; треонин 5; изолейцин 6; буфер Sma I: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 20 мМ КС1, 10 мМ MgClЈ, 10 мМ 2-мер- каптоэтзнола, 100 мкг/мл АСКРС; буфер Sph I: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl, 10 мМ 2- меркаптоэтанола, 100 мкг/мл АСКРС; SSC (20X): 3,0 М NaCl, 0,3 М Na3- цитрата, рН 7,0;

SSPE (20X): 3,6 М NaCl, 0,2 М NatHP04. 20 мМ ЭДТУК, NaOH (Юн.) до рН 7,; буфер ТЕ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТУК;

буфер Tha l: 50 мМ трис-НС1„ рН 8,0, 10 мМ MgClЈ;

топ-агароза: жидкая среда ЛБ, 0,7% агарозы;

раствор предварительной промывки: IM NaCb50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТУК, 0,1$ ДСН„ Пример,

Конструирование генобанка кДНК. X Свежую человеческую плаценту подвергают быстрому замораживанию в жидком азоте, растирают в порошок при температуре ниже -80 С, экстрагируют РНК, из которой получают поли(А)РНК.

0

5

0

5

0

5

10

20

Синтезируют ДНК, клонируют ее в EcoRI gtlO, используя E.coli СбОО. Титр кДНК фaгoв gt 10 составляет 1, бляшкообразующих ед. мл, а число независимых клонов

П р и м е р 2 о Амплификация гено- банка %t 10.

Штамм-реципиент E.coli {например, С 600, Генотип F, , sup E44. thill, thrl, leu B6, lac YI, ton А2ЦГвы- ращивают при в течение ночи в среде Л&, содержащей 0,2% мальтозы.

Культуру центрифугируют и суспендируют в 10 мМ раствора сульфата маг-j5 ния до оптической плотности ,0 при ЬОО нм. Полученные Mg -клеткихранят при 4° С а Клетки смешивают с суспензией фагов (по 50000 бляшкообразующих единиц генобанка ДНК на пластину) и инкубируют в течение 20 мин при 37°С. Затем добавляют расплавленную и доведенную до топ-агарозу (содержащую 10 мМ сульфата магния), смешивают, выливают на предварительно 25 нагретые ЛБ-агаровые пластинки (диа- метром 13,5 см), содержащие 10 мМ сульфата магния, и инкубируют в течение 6 - 12 ч при 37°С«

ПримерЗ. Первичный скрининг для идентификации рекомбинантных -фагов.

а). Обработка нитроцеллюлозных фильтров.

Пластинки по окончании инкубации охлаждают до А°С. Нитроцеллюлозные фильтры кладут на поверхность пластинок. Через 1 мин после пропитки фильтры осторожно удаляют, кладут в раствор денатуратора и инкубируют в течение одной минуты при комнатной температуре., Нейтрализацию осуществляют в растворе нейтрализатора в течение 5 мин при комнатной темпера- туре, затем инкубируют в течение 30 с в буфере при той же температуре. С пластины изготовляют копии. Фильтры высушивают, ДНК фиксируют при 80°С,t

б). Получение Р-маркированных зондов ДНК о

Синтез олигонуклеотидов проводят на синтезаторе 381 А. Олигонуклео- тиды очищают электрофорезом в поли- акриламидном геле (20&-в 8 М мочевине) с последующим обессоливанием на , Сефадексе G-50, Синтезированные та- ким образом ДНК-зонды комплементарны последовательностям оснований РНК,

;

5

30

55

35

40

45

50

10

20

j525

,

610 8

; кодирующим аминокислоты 39 b(a) и 200 - 207(6): Они имеют следующие последовательности оснований:

5

-f

,1

,г

30

С С С

а)5r TG ITA ТТ ТС ТС IGT IAC ITT

Т Т Т

АСА

б)51 ТС IGT IAC ТТ ТС CCA TT IAT

G Т G

в). Гибридизация in situ.

С целью удаления с нитроцеллюлозы остатков агарозы и бактерий фильтры инкубируют в растворе предварительной промывки при 65°С в течение нескольких часов при перемешивании. Фильтры инкубируют в течение 1 - 12 ч при температуре 37 С в растворе предварительной гибридизации, который подвергают предварительной вакуумной дегазации.

Используемые для гибридизации радиоактивно меченные ДНК-зонды (около срм/мкг) добавляют к нагретому до 37°С и дегазированному раствору гибридизации. Для поддержания на высоком уровне концентрации ДНК в растворе гибридизации используют минимальное количество жидкости. Гибридизацию осуществляют в течение 12 - 18 ч при 37°С.

Нитроцеллюлозные фильтры три раза промывают в буфере и 0,05% ДСН (t°C), два раза в течение 30 мин при °С, а также в свежеприготовленном растворе, содержащем 3 И хлорида тетраметиламмония, 50 мМ трис-HCi, рН 8,22 мН ЭДТУК и 0.05S ДСН следующим образом: три раза при комнатной температуре, два раза в течение 30 мин при комнатной температуре и три раза в течение 30 мин при 9°С, после чего сушат на воздухе. Рентгеновскую пленку .экспонируют в течение 2-8 дней при - 70°С.

Пример1. Очистка бляшек.

После проявления авторадиограмм из агаровой пластинки выделяют те участки, которые дают положительный сигнал гибридизации на обоих нитроцеллюлозных фильтрах. Для этого желаемое место удаляют из агара и переводят в 0,3 - 0,6 мл fl-буфера. 55 Добавляют по одной капле хлороформа, фагам дают диффундировать из агара в течение ночи при 1°С и каждую отдель-, ную фаговую суспензию в виде несколь- . ких разбавлений наносят на пластинки.

35

40

45

50

Пластинки, имеющие 300 - 1000 бляшек снова используют для изготовления копии нитроцеллюлозного фильтра, который подвергают гибридизации с использованием обоих ДНК-зондов, Этот процесс повторяют до тех пор, пока все бляшки одной пластинки не дадут положительный сигнал гибридизации.

П р.1и м е р 5 о Анализ полученных фаговых клонов, . а). Титрование 71-фагов.

Суспензии фагов разбавляютfl-буфером в соотношении Т:10, смешивают и наносят на пластинки„ После инкубации при 37 С определяют титр в бляшкообразующих единицах. Для очищенных фаговых суспензий титр составляют 2,2 - 8,6М010 ед. мл„

б), Получение fl-фаговой ДНК„

После выделения и титрования гомогенных фаговых клонов их наносят плотностью единиц ( см чашки Петри с культуральной средой следующего состава: 1,5% агарозы, 10 г/л триптофана, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 мМ MgS(4 и 0,2% глюкозы) вместе с 200 мкл Mg- клеток E.coli С 600 (оптическая плотность Ц при 600 нм), инкубируют в

течение 5 ч при

37°С

и затем охлаждают до Ц С, Элюцию фагов осуществляют переслаиванием пластинок 8 мл Д-оуфера и несколькими каплями хлороформа при слабом качании при 4°С в течение ночи. Очищенную центрифугированием надосадочную жидкость удаляют и фаги центрифугируют при 5000 об/мин, в течение 30 мин при комнатной температуре. После добавления 500 мкл -буфера и инкубации с рибо- нуклеазой А (10 мкг/мл) и дезоксириб нуклеазой (1 мкг/мл) в течение 30 ми при 37 С и концентрацию соли повыг шают добавлением 25 мкл 0,5 М ЭДТУК, 12 мкл 1 М трис-HCl, рН 8;0 и 6,5 мкл 20% ДСН и инкубируют при 70вС в течение 15 мин. После экстракции фенолом и двукратной экстракции смесью хлороформа и изоамилового спирта () ДНК осаждают добавлением 0,1 объема ЗМ ацетата натрия с рН 5,2 и 2 объемов спирта, центрифугируют, промывают 70%-ным спиртом, сушат и, растворяют.в 50 мкг буфере ТЕ.

в). Рестрикционный анализ.

По 2 мкл раствора ДНК инкубируют с 5 ед. EcoRI в буфере X в течение 2 ч при 37 С, полученные фрагменты

0

5

разделяют в 1%-ном агароэном геле. Фрагменты длиной 500 - 1000 п.о, элю- ируют из геля и подвергают анализу.

г). Анализ последовательностей.

100 нг фрагментов встраивают в соответственно приготовленную форму дзДНК (репликативная форма, 50 нг) вектора путем инкубации в течение 2 - 12 ч при Й°С в И) мкл раствора лигирования. Рекомбинантной конструкцией с обозначениями BS3, BS5, BS8, BS9, BSJ2. BSt3, BSXIII трансформируют компетентные клетки E.coli (штамм Ш 101).

Выделяют однонитееую ДНК реком- бинантных фагов и проводят анализ последовательностей по Сангеру при использовании вычислительных программ о,

Выделенный клон 8 (BS8) содержит кодирующую последовательность аминокислоты 22 зрелого энзима.

П р и м е р 6. Конструкция эксп- рессионной кассеты.

Для экспрессии человеческой МпОд- лисмутазы (чМп-д) в дрожжах используют промотор ADHI первоначальной длиной около 1500 п.о., укороченный 0 промотор ADHI длиной около 400 п.о. и ADHII терминатор,

а). Пополнение гена.

Так как у выделенного клона 8 кДНК на N-конце отсутствует участок, соответствующий 21 аминокислоте, для пополнения гена конструируют и синтезируют с учетом выбора дрожжевого ко- дона 2 пары олигонуклеотидов (фрагмент XhoI/Xbal) согласно формуле (ОП1):

0

5

5

0

5

0

5

5 TCGAGTATACAATGAAGCACTCTTTGCCAGACTTG 3 CATATGTTACTTCGTGAGAAACGGTCTGAAG Xho I

CCATACGAGTACGGTGCT GGTATGCTGATGCCACGAGATC Xba I

и (фрагмент Xba I/Ncol согласно формуле (ОП 2):

5 CTAGAACCACACATCAATGCTCAAATCATGCAA 3 TTGGTGTGTAGTTGCGAGTTTAGTACGTT Xba I

TTGCACCACTCTAAGCAC AACGTGGTGAGA TTCGTGGTAC

Nco I i

ОП1 вставляют через Xho I/Xba I

в плазмиду VI7 (полученную из pUCl8 после рестрикции Hinc II и введения

11

линкеров Xho I (dCCTCGAGG) и рестрикции Smal полученной плазмиды pES102 с последующим выделением линкеров Nco I (dCCCATGGG), а ОП2 через Xba I/Nco I следующим образом.

По 4 мкг ДНК VI7 переваривают 10 ед. Xba I и NcoЛ или Xho I и Xba I в течение 2 ч при 37&С и очищают путем гельэлектрофореза (0.7% агарозы). По 5 мкл синтезированных нитей ОПТ и ОП2 (каждый раз 10 рМ/

/мкл) перемешивают, инкубируют в

mi6io

плаэмиду PKHI, соответственно РКН2 через Xho I/Eco RI.

В плазмиду РЕЗ 103, содержащую промотор ADHI в качестве фрагмента Bam I/ Xho I длиной 1500 п.о. в PES 102 (PES 102 представляет собой производное , которое в месте разреза Hinc II содержит линкер Ю Xho 1У, вводят линкер Bgl II яосле рестрикции Sma I (1 мкг плазмиды подвергают перевариванию 5 ед. Sma I в буфере Sma I в течение 2 ч

течение 10 мин при температуре 65 С и медленно охлаждают до комнатной температуры. По 1/ТО полученного объема подвергают лигированию с 50 разрезанного ХНо I и Xba I вектора (в случае ОП1) или разрезанного

при 37°С), очистки и выделения. По- 15 лученную таким образом плазмиду

превращают в плазмиду Р15 #рестрик- нг цией инкубацией с фрагментом Кле- нова и повторным лигированием.

После переваривания Xho I и Hind

Xba I и Nco I вектора (в случае ОП2)„ 20 IJI 8 буфере Коре в плазмиду pES103

После двойного переваривания Sea I и Xba I в буфере Коре в течение 2 ч при 37 С, очистки и выделения разрезанных векторов путем гельэлектрофореза USOD2 и HSOD3 Подвергают лигированию (клонирование олигонук- леотидных пар-ОП1 и ОП2) с получением плазмиды HSODY, которую гидролизугот рестриктазой Nco I, инкубируют с фрагментом Кленова и гидролизуют рестриктазой Eco RI. При этом 5 мкг ДНК инкубируют с 18 ед. Nco I в течение нескольких часов в 50 мкл буфера X при 37°С, разрезанную ДНК очищают гельэлектрофорезом и половину инкубируют с фрагментом Кленова.

ДНК очищают гельэлектрофорезом, выделяют и гидролизуют 7,5 ед. Eco RI в 20. мкл буфера X, еще раз очищают и выделяют. Плазмидой BS8, содержащей выделенный клон 8 кДНК, трансформируют компетентные клетки E.coli .(штам IM101) и получают плазмиду.

10 мкг плазмиды переваривают с 25 единицами Tha I в 0 мкл буфера Thai в течение 8 ч при 6и°С, фрагмент длиной 75У п.о., гидролизуют с помощью ECO RI с последующей очисткой гельэлектрофорезом. Фрагмент Tha I/ /Eco RI объединяют с плазмидой HSOD4, получая HSOD6 Плазмида HSOD6 содержит полную кДНК для , включая Met г При этом сохраняется рамка считывания.

б). Конструкция экспрессионной кассеты.

Плазмиду HSOD6 переваривают с Xho I и Eco RI в буфере Коре, вы- детимат фрагмент Xho I и вводят в

25

30

35

вставляют синтезированный линкер - Xho I, Eco RI, Xba I, Hind III. Этот линкер имеет следующую последовательность:

TCGAGGAATTCTCTAGAA

CCTTAAGAGATCTTTCGA, В плазмиду р150/1 (после переваривания Xba I/Hind III в буфере Коре вставляют терминатор ADHII, получая плазмиду 150/2. Терминатор ADHII получают следующим образом. Плазмиду pMW5 ADHII переваривают сначала Hind III затем Spn I и фрагмент длиной 605 ПсОо клонируют в вектор VI8 и в место разреза Hindi вставляют линкер Xba I (CTCTAGAG). Фрагмент Xba I/Sph I длиной 335 п.о. вводят в pUCIS (pGD2),

Вектор VI8 получают за счет того, что в pUd8 вводят линкер Hind III по сайту Sma I. Место мультиклонирования в VI8 содержит Eco RI, Sst I, Kpn I, Hind III, Bam. HI, Xba I, Sall Pst, Sphl. После переваривания Xba I

45 и Hind III терминатор ADHII выде- ляюто Таким образом, за исключением вводимого через Xho I Eco RI гена плазмида р150/2 содержит необходимые для экспрессии гена промотор длиной около 1500 и.о., линкер Xho I длиной 7 п.о, линкер Eco RI длиной. 6 п.о., линкер Xba I длиной 7 п.о., терминатор длиной 329 ПоО. Эти единицы вста ляют через Bam Hi/Hind III в вектор

55 . В получаемой плазмиде рКН1 заменяют промотор ADHI на укороченны промотор ADHIk из фрагмента Bam HI/ /Xho I (длиной Й12 п.о.) плазмиды рКН2.

40

50

i6io

плаэмиду PKHI, соответственно РКН2 через Xho I/Eco RI.

В плазмиду РЕЗ 103, содержащую промотор ADHI в качестве фрагмента Bam I/ Xho I длиной 1500 п.о. в PES 102 (PES 102 представляет собой производное , которое в месте разреза Hinc II содержит линкер Ю Xho 1У, вводят линкер Bgl II яосле рестрикции Sma I (1 мкг плазмиды подвергают перевариванию 5 ед. Sma I в буфере Sma I в течение 2 ч

при 37°С), очистки и выделения. По- 15 лученную таким образом плазмиду

превращают в плазмиду Р15 #рестрик- цией инкубацией с фрагментом Кле- нова и повторным лигированием.

После переваривания Xho I и Hind

5

0

5

вставляют синтезированный линкер - Xho I, Eco RI, Xba I, Hind III. Этот линкер имеет следующую последовательность:

TCGAGGAATTCTCTAGAA

CCTTAAGAGATCTTTCGA, В плазмиду р150/1 (после переваривания Xba I/Hind III в буфере Коре) вставляют терминатор ADHII, получая плазмиду 150/2. Терминатор ADHII получают следующим образом. Плазмиду pMW5 ADHII переваривают сначала Hind III затем Spn I и фрагмент длиной 605 ПсОо клонируют в вектор VI8 и в место разреза Hindi вставляют линкер Xba I (CTCTAGAG). Фрагмент Xba I/Sph I длиной 335 п.о. вводят в pUCIS (pGD2),

Вектор VI8 получают за счет того, что в pUd8 вводят линкер Hind III по сайту Sma I. Место мультиклонирования в VI8 содержит Eco RI, Sst I, Kpn I, Hind III, Bam. HI, Xba I, Salll, Pst, Sphl. После переваривания Xba I

5 и Hind III терминатор ADHII выде- ляюто Таким образом, за исключением вводимого через Xho I Eco RI гена плазмида р150/2 содержит необходимые для экспрессии гена промотор длиной около 1500 и.о., линкер Xho I длиной 7 п.о, линкер Eco RI длиной. 6 п.о., линкер Xba I длиной 7 п.о., терминатор длиной 329 ПоО. Эти единицы вставляют через Bam Hi/Hind III в вектор

5 . В получаемой плазмиде рКН1 заменяют промотор ADHI на укороченный промотор ADHIk из фрагмента Bam HI/ /Xho I (длиной Й12 п.о.) плазмиды рКН2.

0

0

13

В обе плазмиды вставляют по сайтам Xho I/Eco RI полный ген кДНК, вырезанный из HSOD6,, Получаемые плазмиды HSOD7/1 и HSOD7/2 отличаются друг от яруга только различными промоторами ADHI и ADHIk, После двойного переваривания Bglll/Hind III и выделения экспрессионных фрагментов изготовленные экспрессионные кассеты вставляют в соответственно подготовленные дрожжевые трансформационные векторы YHp13 (ATCC 37 115 PIDB207 (DSM J181) pEAS102 YIpb (ATCC ) через места разреза Bam HI и Hind III,

Пример. Получение пригодного для экспрессии дрожжевого мутанта .

Ген дрожжевого мутанта содержится в качестве фрагмента Bam HI в векторе PL41. После рестрикции Bam HI фрагмент длиной п„о. очищают гельэлектрофорезом,, выделяют и субклонируют по сайту Bam HI в вектор VO.

Вектор VO получают за счет того, что%1 мкг pVC18 гидролизуют рестрик- тазой Hind in, фрагмент выделяют из геля, выступающие концы пополняют полимеразой Кленова и лигируют лигазой

Полученную плазмиду SODY1 превращают в SODYJ путем гидролиза рест- риктазой Nrv1 и встраиванием линкера Hind III (CAAGCTTG). В место разреза вставляют ген URA3, полученный из pURA3. SODY3 переваривают с Hind III идефосфорилируют в следующих условиях, К 0 мкл реакционной смеси добавляют 0 мкл hjO, 10 мкл 1 мМ ЭДТУ 5 мкл трис-HCl, рН 9,5, 1 мкл 100 мМ спермидина и 1 мкл (1 мг/мл ) щелочной фосфатазы кишечника теленка (ФТК) и инкубируют при 36°С. По истечении 15 мин еще раз добавляют 1 мкл ФТК и инкубируют в течение 15 мин. Дефосфорилированный вектор очищают электрофорезом в агаровом геле. 2 мкг плазмиды pVRA3 режут Hind III и фрагмент длиной 1,2 т.п.о содержащий дрожжевой ген VRA3, выделяют и вставляют в подготовленный вектор.

Получаемые таким ооразом плазмиды SODY7 и SOUY8 содержат ген UKA3 в дрожжевом гене Mn-Д и различаются ориентацией гена UKA относительно ,гена Мп-Д

,

10

15

20

25

30

35

40

45

50

610I

Ориентацию гена URA3 относительно, гена Mn-Л можно устанавливать, так как ген URA3 содержит асимметричное место Pst Io

Плазмидой SODY7 и SODY8 трансформируют штамм DBY 7 7 (генотип а, leu 2, his 3, trpl, ura3) следующим образом. 2 мкг SODY7 и SODY8 режут 50 ед. Bam HI в 200 мкл буфера Bam HI (150 мМ NaCl, 6 мМ трис-НС1, рН 7,9, 6 мМ MgCIa, 1 мМ ДТТ) и всю смесь (без отделения части pUC) экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. ДНК растворяют в воде и используют для трансформации дрожжей.

Трансформанты выращивают в среде SC-VRA в течение ночи при 28°С. Клетки отделяют центрифугированием, разрушают и исследует на содержание в них Mn-Д/ При этом для определения

Mn-Д, с одной стороны, и Cu/Zn fl, с другой стороны, работают по известным методикам с использованием гель- электрофореза путем разделения протеинов с последующим окрашиванием нитросиник тетразолием,, Повысить чувствительность можно путем окрашивания дианизидино м„ Для обеспечения дальнейшего анализа применяют спектрометрический метод с использованием щелочного диметилсульфоксида в качестве выделяющей кислород системы и цитохрома С в качестве восстановителя, Мп Л и Cu/Zn-Д можно различать путем добавления KCNt Штаммы SUDY/72, SODY7/6, SODY7/8 и SODY7/10 не проявляют активности Мп-Д.

П р и м е р 8, Получение экспрессионных векторов.

Из плазмид HSOD7/1 и HSOD7/2 вырезают фрагменты Bg III Hind III. Плазмиды YEp13, pIDB и pEAS 102 также гидролизуют Hind III и Bam HI о По 50 мкг векторной ДНК и 200 мкг вставки лигируют и трансформируют в штамм E.coli HB 101

В табл,1 приведено обозначение соответствующих плазмид.

55

Таблица 1 Вектор (Вставка HSOD7/1 IHSOD7/2

II

pWS 550A pWS 490A pVV 491A

pVV 371A pWS 372A pWS 373A

Примеру, Получение пригодного для трансформации дрожжевого штамма (WS30-5g).

Получают дрожжевой штамм, который кроме описанных для штамма SOUY/2 генетических маркеров, дополнительно содержит мутацию в одной из лизосо- мальных основных протеаз и, таким образом, при разрушении дрожжевых клеток выделяет меньше протеаз.

Для этого дефицитный -Mn-Д штамм SODY7/2 скрещивают с дефицитным по протеазам штаммом (a, Ieu2, his3, trpt, ura3, рер4) „ Штамм WS30-5g можно трансформировать, он отвечает соответствующим требованиям

Такие скрещивания можно с успехом осуществлять с другими известными дрожжевыми штаммами, например, с 20 В-12.

Пример 10. Трансформация дрожжей и экспрессия в дрожжах.

Штамм SODY/2 трансформируют плаз- мидами pWS371A, pWS372A n pWS373A. Трансформанты исследуют на экспрессию. Трансформанты выращивают в жидкой среде SC-lleu при встряхивании. ( 100 мкл культуры инокупируют в k мл YP5%D (% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 5% глюкозы) и выращивают в течение ночи, клетки отделяют и расщепляют согласно примеру 7. На активирующий гель наносят такое количество сырой жидкости клеток, ко- торое соответствует 1 мл культуры. Опыт по определению активности проводят по примеру 7о I

Дрожжевой штамм WS30-5g (Ieu2,

his3, trpl, pep4, sodt) также трансформируют плазмидами pWS550A, pWS490A, PW491A,

Измеренное в дрожжах в этих ус- , ловиях количество-Мп-Д соответствует

примерно 0,5 мг/л культуры.

Пример Т1„ Синтез линкера.

Изготавливают шесть различных олигонуклеотидов EBI656, EBI636, EBI643, ЕВ1643 ЕВ1646, EBI660 и EBI638 со следующей последовательностью и длиной

Изобретение относится к биотех- нологии и генетической инженерии, в частности к способам получения человеческой дисмутаэы Мп04 для терапевтических целей, например, в качестве противовоспалительного вещества. Способ получения человеческой дисмутазы предусматривает конструирование плаз- мидной ДНК pWS 550A, или pWS 490A, или p-WS 49tА,или pWS 371А, или pWS 372А, илирМЗ 373А,или AB, или рЕ025 -АС, илирЕ02б -AD, илирЕО 0, м или рЕОЬ2, или , или рЕО, или , или рЕ050, или рЕ051, которой трансформируют штаммы Saccharomyces cerevisiae, или плазмидУ pSV2 dhfr SOD1 или pSV2 dhfr SOD2, которой трансформируют штаммы культивируемых клеток, культивируют трансформированные клетки, выделяют и очищают целевой продукт путем экстракции, осаждения и хроматографии, k табл.

EBJ, 5

656:.

TCOAGTATACMTGTTCGCGAAAACAGCTGCAGCTAATTTA

EBI 536: 5

TCTTGGTTAAATTAGCTGCAGCTGTTTTCGCGAACATTGTATAC -

М п.о.

EBI 643: 5

AACAAGMGGGTGGTTTGTCATTGCTCTCCACCACAGGAAGGAGAACC

W п.о.

EBI 646: .5

Г AGTGCTTGGTTCTCCTTGCTGTGGTGGAGAGCAATGACAAACCACCCT , EBI 660: ЦВ п.о.

3

AAGUACTCTTTGCCAGACTTGCCATACGAGTACGGTGCT EBI 638:,„ п .

/JJ П.О.

CTAGAGCACCGTAGTCGTATGGCAAGTCTGGCAAAG

36 п.о.

Олигонуклеотиды EBI636, EBI643, EBI646 и EBI660 фосфорилируют с 5 -концов в следующих условиях.

Исходная реакционная смесь № 1 содержит 2 мкл EBI 636 (100 пмоль), 1 амкл Юхлинкерного буфера киназы, 3 мкя 10 мМ АТР, 1 мкл Т -полинук

3

41

ПгО .

3

3

W п.о.

3

леотидкиназы (10 ед./мкл), 3 мкл воды.

Исходная реакционная смесь V2 аналогична- смеси N t, но с 2 мкл (100 пмоль EBI 660.

Исходная реакционная смесь If 3 содержит 2 мкл олигонуклеотида EBI 643

лигазы ДНК (7 ед./мкл). Реакцию осуществляют а течение 15 ч при .

ДНК разделяют в 1%-ном агарозном геле и фрагмент ДНК длиной 128 п.о. выделяют из геля путем элюции

П р и м е р 12, Конструкция экс- рессионных векторов.

Плазмиду HSOD6 переваривают рест(100 пмоль), 1 мкл Шлинкерного буфера киназы,. 3 мкл 10 мМ АТР, 1 мкл Тй-полинуклеотидкинэзы (10 ед./ /мкл, 1 мкл воды)„

10 линкерный буфер киназы состоит из 0,7 М трис-HCl, рН 7,6, 0,1 М , MgClj, 0,05 М ДТТ.

Реакцию осуществляют в течение

30 мин при 37°С. Затем Т -полинуклео- ю риктазами Xho I и ХЬа I и вставляют тидкиназу инактивируют путем нагрева в нее линкер длиной 128 и.о. (Xho I - до 100°С.митохондриальный лидер - ХЬа I) иэОлигонуклеотиды EBI 656 и EBI 638, вестным методом (pE022-Ah Ген чМп-Л, которые образуют 5 -концы готовой снабженный митохондриальной дрожжевой вставки ДНК длиной 128 п.о, t5 лидерной последовательностью ДНК,

р Т1 подвергают двойному перевариванию

xh° „Xho I и Eco RI и через Xho I - Eco RI

5 л

Старт

вставляют в рКН1 (рЕ023 А). TCGAGTAfACAATGTTCGCGAAAACAGCTGCAGCTAA Изготовленную таким образом экс- CATATGTTACAAGCGCTTTTGTCGACGTCGATT20 прессионную кассету вставляют аналогично примеру 8 через Bgl II/Hind III TTTAACCAAGAAGGGTGGTTTGTCATTGCTC AAATTGGTTCTTCCCACCAAACAGTAACGAG

в дрожжевые трансформационные векторы. YEpl3 pIDB207 и pEAS102 по сайтам Вага HI и Hind III,

Лизин

TCCACCACAGCAAGGAGAACCAAGCACTCTTT AGGTGGTGTCGTTCCTCTTGGTTCGTGAGAAA I

GCCAGACTTGCCATACGACTACGGTGCT 3 CGGTCTGAACGGTATGCTGATGCCACGA

Xba I

не фосфорилируют, чтобы избежать образования мультимерных вставок ДНК на последующей стадии реакции лигирова- ния.

Линкер конструируют из отдельных олигонуклеотидов по схеме:

5 Щ656 Р ЕВ|6АЗ JLI5I6.6. 3

3 55Ш6... LJIIi6.6. Ј 1§1§38 5

К реакционной смеси № 1 добавляют 2 мкл (100 пмоль) EBI656, а к реакционной смеси № 2 - 2 мкл EBI 638

25 Лример13° Трансформация дрожжей и экспрессия в дрожжах,

Дрожжевой штамм WS30-5g (пример трансформируют полученными плаэмида ми и трансформанты исследуют на их

30 экспрессию (пример 10),

Штамм WS30-5g выращивают в культуре следующего состава, г/л: дрожжевой экстракт 6,7; глюкоза 10; аргинин 0,16; лизин 0,25; триптофан

35 0,06; метионин 0,08; цистеин 0,03 гистидин 0,10; тирозин 0,16; фенйл- аланин 0,17; треонин 0,16; изолейци на 0,18; валин 0,21; глутаминовая кислота 0,0; глицин 0,21; цистеин

40 0,02; эланин 0,15; аспарагиновая кислота 0,20; пролин 0,20; серин 0,15; аспарагин 0,10; глутамин 0,20 аденин 0,025; урацил 0,050, Процесс выращивания осуществляют при аэра(100 пмоль) и проводят реакцию гиб- 45 ции до достижения оптической плотридизации олигонуклеотидов друг с другом,

В исходной реакционной смеси содержатся уже 2 комплементарных олигонуклеотида (EBI 643, EBI 646). 3 смеси нагревают в течение 2 мин при 100 С и медленно охлаждают.

Получаемые в реакциях № 1 - 3 короткие двухнитевые фрагменты ДНК литируют друг с другом следующим образом: 10 мкл смеси №1 (EBI 636 + EBI 656)| 10 мкл смеси № 2 (EBI 660 EBI 638)} 10 мкл смеси К 3 (EBI 643 EBI 646); 3 мкл 10 мМ АТР; 1 мкл

лигазы ДНК (7 ед./мкл). Реакцию осуществляют а течение 15 ч при .

ДНК разделяют в 1%-ном агарозном геле и фрагмент ДНК длиной 128 п.о. выделяют из геля путем элюции

П р и м е р 12, Конструкция экс- рессионных векторов.

Плазмиду HSOD6 переваривают рестриктазами Xho I и ХЬа I и вставляют в нее линкер длиной 128 и.о. (Xho I - митохондриальный лидер - ХЬа I) иэвставляют в рКН1 (рЕ023 А). Изготовленную таким образом экс- прессионную кассету вставляют аналогично примеру 8 через Bgl II/Hind III

в дрожжевые трансформационные векторы. YEpl3 pIDB207 и pEAS102 по сайтам Вага HI и Hind III,

Лример13° Трансформация дрожжей и экспрессия в дрожжах,

Дрожжевой штамм WS30-5g (пример 9) трансформируют полученными плаэмида- ми и трансформанты исследуют на их

экспрессию (пример 10),

Штамм WS30-5g выращивают в культуре следующего состава, г/л: дрожжевой экстракт 6,7; глюкоза 10; аргинин 0,16; лизин 0,25; триптофан

0,06; метионин 0,08; цистеин 0,03 гистидин 0,10; тирозин 0,16; фенйл- аланин 0,17; треонин 0,16; изолейци- на 0,18; валин 0,21; глутаминовая кислота 0,0; глицин 0,21; цистеин

0,02; эланин 0,15; аспарагиновая кислота 0,20; пролин 0,20; серин 0,15; аспарагин 0,10; глутамин 0,20; аденин 0,025; урацил 0,050, Процесс выращивания осуществляют при аэра

ности 0,01 при нм с испбльзо- ванием магнитной мешалки

Основную культуру состава: 8,0 г/ /л {Ш4)г.504; 2,56 г/л (

1,16 г/л КС1; 0,60 г/Л MgS04-7H20;

0,56 г/л СаС12«2Н20; 0,04 мг/л биотина; 80 мг/л м-инозита; 40 мг/л Са- пантотената; 8 мг/л тиамина; 2 мг/л пиридоксина; 3,1 мг/л CuS04

Х5НгО; 19 мг/л FeCl3 6HZ0; 12 мг/л ZnSO4 7%0; 14мг/л MnS04 HzO; 3 мг/ /л Ы3бО,; 1 мг/л KI; 2 мг/л Na2MgS04x 2НгО; -1 г/л дрожжевого экстракта ; 0,2 г/л урацила; 0,1 г/л аденина;

19

10

0,5 г/л литонной кислоты; 15 г/л ) глутаминраой кислоты; 0,2 г/л гис- тидина; 0,5 г/л триптофана; 100 г/л глюкозы, получают в ферментере емкостью 20 л. В качестве инокулята используют 5% количества предварительной . Выращивание осуществляют аэрацией при размешивании (100 об/мин) и постоянном значении рН 5,0 при 28°С.

После снижения содержания глюкозы до 50 г/л еще раз добавляют 50 г/л глюкозы и продолжают ферментацию до тех пор, пока содержание глюкозы не составит 10 г/л (примерно через kS ч) охлаждают, центрифугируют и биомассу замораживают с Выход биомассы 18 г/л влажных клеток.

П р и м е р И с Получение дрожжевых митохондрий

Для того чтобы установить приводит ли введение дрожжевой мито- хондрйа/тьной лидерной л,оследователь- ности перед геном чМп-Д к импорту протеина в митохондрии, изготовляют дрожжевые митохондрии и определяют активность Mn-Д в митохондриях и цитоплазме

Культуру выращивают путем встряхивания (300 об/мин) при 28°С в течение ночи, инокулируют в 225 мл среды YPD и выращивают в указанных условиях в течение ночи. После достижения оптической плотности 5 - 7 при 6000 нм клетки центрифугируют при 6500 об/мин в течение 5 мин. Клетки промывают водой, суспендируют в1 Мманни-та,.

исследовать активность Mn-Д. Красн коричневый, центрифугат промывают б фером (белые цитоплазматические ко поненты выливают) и затем митохонд суспендируют в 2,5 мл того же буфе Загрязнения еще раз удаляют путем центрифугирования при 000 об/мин течение 5 мин. Митохондрии удаляют из насадочной жидкости путем повто ного центрифугирования (при 122000 об/мин в течение 10 мин). Митохонд разрушают при помощи стеклянных ша , ри ков и, используя активирующий ге 15 их исс ледуют на содержание Мп-Д.

П р и м е р 15. Очистка чМп-Д. - Стадия 1: разрушение клеток.

I

Клетки (пример 13) промывают в 10 мл дистиллированной воды на 1 г влажной массы и центрифугируют при 16000 об/мин в течение 15 мин Оса повторно суспендируют в натриево- калиевом фосфатном буфере (50 мМ, рН 7,0) при соотношении 1:3- Затем клетки разрушают в мельнице при по щи стеклянных шариков диаметром 0,1 мм при расходе 6 л/ч„ Экстракт клеток центрифугируют в течение 30 15 мин (16000 об/мин °С) и осадок удаляюто

Стадия 2: осаждение полиэтилени мином.

К надосадочной жидкости первой ,5 стадии добавляют 5%-ный водный рас вор полиэтиленимина (рН 8,0) конеч концентрации 0,5& Затем продолжаю размешивать еще в течение 30 мин и осадок удаляют центрифугированием

20

25

20 мМ КР;(КНгР04/КгНРОл), рН 7,,

добавляют 1 мг/мл цимолазы с мол. мас- 40 ПРИ 1боо° об/мин в течение 30 мин. } сой 500 и 2 ч встряхивают (50 об/мин) при 28 С, получая сферопласты. Их

центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, промывают раствором

Стадия 3: осаждение путем термо обработки с

Надосадочную жидкость второй ста дии при перемешивании нагревают до

1 М маннита, 20 мМ КР; , рН 7,, 1 мМ 45 6 О С в водяной бане с температурой

„ . . . ОпО Г . w

фторида фенилметилсульфонила (ФФМС) Надосадочную жидкость удаляют и добавляют стеклянные шарики диаметром 0,1 мм в количестве, соответствующем 1 - 2 объема промытых клеток.

Клетки разрушают, суспендируют в 2,5 мл 0,65 М маннита, 1 мМ ЭДТУК, 1 мМ ФФМС, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин„ Митохондрии выделяют из надосадочной жидкости путем центрифугирования при 12000 об/ /мин в течение 10 мин. Надосалоч- ная жидкость содержит цитоплазму и поэтому ее хранят с тем, чтобы потом

80°С, находящейся в стальных стака нах. Затем в ледяной бане охлаждаю до комнатной температуры. Выпавший протеин удаляют центрифугированием 50 ™ об/мин в течение 10 мин пр гС)„

Стадия k: осаждение сульфатом аммония„

Надосадочную жидкость стадии 3 55 сыщакгг сульфатом аммония до 20% и осадок отделяют центрифугированием О 0000 об/мин в течение 15 мин при 4 С). Затем концентрацию сульфата аммония повышают до 90$ и осадок

10

.

и а,.

7М61020

исследовать активность Mn-Д. Красно- коричневый, центрифугат промывают буфером (белые цитоплазматические компоненты выливают) и затем митохондрии суспендируют в 2,5 мл того же буфера. Загрязнения еще раз удаляют путем центрифугирования при 000 об/мин в течение 5 мин. Митохондрии удаляют из насадочной жидкости путем повторного центрифугирования (при 122000 об/мин в течение 10 мин). Митохондрии разрушают при помощи стеклянных ша- , ри ков и, используя активирующий гель, 15 их исс ледуют на содержание Мп-Д.

П р и м е р 15. Очистка чМп-Д. - Стадия 1: разрушение клеток.

I

Клетки (пример 13) промывают в 10 мл дистиллированной воды на 1 г влажной массы и центрифугируют при 16000 об/мин в течение 15 мин Осадок повторно суспендируют в натриево- калиевом фосфатном буфере (50 мМ, рН 7,0) при соотношении 1:3- Затем клетки разрушают в мельнице при помощи стеклянных шариков диаметром 0,1 мм при расходе 6 л/ч„ Экстракт клеток центрифугируют в течение 30 15 мин (16000 об/мин °С) и осадок удаляюто

Стадия 2: осаждение полиэтилени- мином.

К надосадочной жидкости первой ,5 стадии добавляют 5%-ный водный раствор полиэтиленимина (рН 8,0) конечной концентрации 0,5& Затем продолжают размешивать еще в течение 30 мин и осадок удаляют центрифугированием

20

25

ПРИ 1боо° об/мин в течение 30 мин.

Стадия 3: осаждение путем термообработки с

Надосадочную жидкость второй стадии при перемешивании нагревают до

6 О С в водяной бане с температурой

6 О С в водяной бане с температурой

ОпО Г . w

80°С, находящейся в стальных стаканах. Затем в ледяной бане охлаждают до комнатной температуры. Выпавший протеин удаляют центрифугированием ™ об/мин в течение 10 мин при гС)„

Стадия k: осаждение сульфатом аммония„

Надосадочную жидкость стадии 3 на- сыщакгг сульфатом аммония до 20% и осадок отделяют центрифугированием О 0000 об/мин в течение 15 мин при 4 С). Затем концентрацию сульфата аммония повышают до 90$ и осадок

2117

отделяют центрифугированием (10000 об/мин в течение 15 мин при гС), Осадок поглощают в незначительном количестве (50 мМ, рН 6,0) буфера мор- фолиноэтансульфоната - 2-морфолино- этансульфоновой кислоты (буфер МЭС) и диализуют в течение ночи с использованием того же буфера.

Стадия 5: хроматография на катио- ните.

Колонку, содержащую катионит мо- но-S-HR 5/5 уравновешивают 5 объемами буфера МЭС. После подачи экстракта на

колонку несвязанные протеины промывают объемами буфера МЭС. Затем чМп-,1 элюируют 20 объемами буфера МЭС с линейным градиентом от 0 до 50 мМ NaCl. Фракции, содержащие активность Mn-Д, объединяют и диали- зуюТ с использованием натриево-ка- лиевого фосфатного буфера (5 мМ, рН 7,0).

Стадия 6: хроматография на гид- роксилапатите,

На уравновешенную фосфатным буфером (5 мМ, рН 7,0) колонку гидро силапатита подают диализат стадии и чМп-Д элюируют 20 объемами нат- риево-калиевого фосфатного буфера рН 7,0 с линейным градиентом от 5 до 300 мМ указанных солей. За степенью очистки чМп-Д наблюдают при помощи электрофореза в полиакрил- амид ном геле с использованием ДСН.

В результате очистки получают 21 мг (1,16 мг/клетки) чМпО2-дисмуТЭЗЫо

Пример1б, Характеристика чМп-Д.

Очищенную чМп-Д анализируют при помощи жидкостной-гельхроматографии под давлением, жидкостной хроматографии с обратной фазой под давлением, гельэлектрофореза с использованием ДСН, нативного гель- электрофореза и изоэлектрического фокусирования и сравнивают с естественной чМп-Д.

а). Жидкостная гельхроматографил под давлением

т

Колонка: Уотерс Протеин Пак I 125,2Х(7,.мм), диаметр частиц геля 10 мкм; элюент: 0,5 М , 0,02 М NaH/jLP04, рН 7,0, 0,04% Теин 20, 25% пропиленгликоля; скорость подачи 0,5 мл/мин; детекция: поглощение УФ, 21 нм„

22

Естественная и получаемая предлагаемым способом чМп-Д показывает главный пик тетрамера энзима при мол. массе 70000 и 76000 соответст0

5

0

5

0

ляют с использованием четырех стандартных протеиново

б). Жидкостная хроматография с обратной фазой под давлением.

Колонка: Бакербонд Bfl , 4,6 t 250 мм, 5 мкм диаметра частиц, диаметр пор: 30 нм; элюент А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде; элюент Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле; градиент: 20% Б в течение 2 мин, 20 - 68% Б в течение 2k мин, 68% Б в течение 10 мин, 68 - 20% Б в течение 1 мин; скорость подачи 1,0 мл/мин; детекция: поглощение УФ, 21ft нм и 280 нм,

Естественная и получаемая предлагаемым способом чМп-ДП проявляют время удерживания около 21 мин (20,7 и 5 20,9 мин, соответственно),

в). Гельэлектрофорез с использованием ДСН,

Разделительный гель - 15% акрил- амида; стекинг-гель -ft% акриламида; 0 окраска серебром; величина геля 0,75 мм (8хЮ см); режим: 60 мин, 150 В,

При подготовке проб для чМп-Д пробы смешивают с ДТТ в качестве восстановителя и кипятят. В геле ДСН обнаруживается мономер чМп-Д с мол„. массой около 25000, В зависимости от степени полноты реакции восстановления можно доказать также наличие тетрамера с мол, массой около 90000,

г), Нативный гельэлектрофорез.

Разделительный гель - 7,5% поли- акриламидный гель; стекинг-гель - 2% акриламида + сахароза; величина ге- 5 ля 0,75 мм ( см); режим: 75 мин, 150 Bj окрашивание кумасси голубым,

Получаемая после хроматографии на гидроксилапатите чМп-Д проявляет после электрофореза как после окра- 0 шивания кумассисиним (нанесенное

количество чМп-Д 0,3 мкг), так и после активирующего окрашивания о-диани- зидином единую и находящуюся в том же положении полосу

д). Изоэлектрическое фокусирование,

Пределы значения рН 3,5 - 9,5; геяевые пластинки LKB (1 мм( см); электродные растворы: 1 М фосфорная

23

кислота (анод), 1 М натриевый щелок (катод); температура охлаждения объем проб 4,0 и 6,5 мкг соответственно; режим: предварительное фокусирование 500 Вч; фокусирование 3000 Вм в-целом;; окраска: кумасси - голубой, о-дианизидйНо

В качестве изоэлектрической точки определяют ,15.

Пример 17 Конструкция кДНК- генобанка из печеночной ткани человека.

17

Реакцию ведут в течение 1 ч при 14°С и прекращают добавлением 5 мкл 250 мН ЭДТУК. Несвязанную радиоактивность удаляют на колонке с биогеАналогично примеру 1 из свежей ne-.„„™«,,i, ,Ма.™. па ™j. t ииоге- ченочной ткани (приблизительно 1 кг) Sлем P6-DG. В качестве элюента ис- выделяют Р.НК, получают поли (А) РНК ипользуют буфер ТЕ. Гибридизацию осу- „, „nut/ п.,.,.,, л „« 1 п.ществляют согласно примеру 3.

Пример 19. Включение мито- хондриальной человеческой лидерной 20 ДНК-последовательности MnOj-дисмута- зы перед геном МпО -дисмутазы.

Совместной гибридизацией двух синтезированных олигонуклеотидов (EBI 917, EBI 919) получают ДНК- фрагмент длиной 122 п.о. с Xho I/ /Xba I выступающими концами. Этот фрагмент соответствует приведенной в примере 6 формуле ОП1, с той разницей, что между стартовым кодоном

синтезируют кДНК. Получениеflgt10- генобанка осуществляют аналогично примеру t.

П р и м е р 18о Использование гена Мп02-дисмутазы в качестве ДНК- зонда .

Полная кДНК гена МпО -дисмутазы (пример 6) используется в качестве радиоактивно маркированного ДНК- зонда. 5 мг плазмидной ДНК HSOD6 гидролизуют рестриктазами EcoRI и Xho I. После разделяют в 1%-ном ага25

.-.-..I-W f Vf- J % r ,/f4

розном геле из геля выделяют ДНК-фраг-30 АТС и кодоном для лизина AAG вклюмент с длиной 600 п.о., содержащий ген- Мп04-дисмутазы, его радиоактивно метят и используют в качестве ДНК-зонда.

Реакционная смесь: 5 мкл трансляционного буфера; 10 мкя ДНКчают человеческую лидерную ДНК-пос- ледовательност ь.

ДНК -последова тельност ь, сод ержа - щая вставку с человеческим геном 35 МпО -дисмутазы, имеет следующую . структуру.

Xho I

Pvu II

Старт

EBI 9t7 S ICGAGTATACAATGTTGAGCCGGGCAGTGTGCGGCACCAGCAGGCAGCTGCCTCCG

CATATGTTACAACTCGGCCCGTCACACGCCGTGGTCGTCCGTCGACGGAGGC

EBI 919 3

Lys

GTTTTGGGGTATCTGGGeTCCAGGCAGAAGCACTCTTTGCCAGACTTGCCATACGACTACGGTGCT CAAAACCCCATAGACCCGAGGTCCGTCTTCGTGAGAAACGGTCTCAACGGTATGCTGATGCCACGA

Плазмиду HSOD6 гидролизуют рестриктазами Xho I и Xba I и вставляют линкер с длиной 122 п„о„ (Xhol-чело- веческий митохондриальный лидер - Xba I), Получают плазмиду рКН22-А, переваривают ее pecfpnKTasaMH Xho I и Eco RI (по 5 ед. мкг ДНК) и вставляют в рКН 1. Получают плазмиду РКН23-А.

Полученную таким образом экспрес- сионную кассету аналогично примеру 12 по сайтам Bglll/Hind III(после двойного переваривания плазмид и

16102k

фрагмента; 15 мкл0Г Р 1СТР/3000 Cf (ммоль, водный раствор); 1 мкл 1 мМ dATP{ 1 мкл ТТР; 1 мкл 1 мМ dCTP; 5 ед ДНК полимеразы 1; вода до. 50 мкл.

трансляционный буфер содержит 0,5 М трис-HCl, рН 7,2; 0,1 м MgS04; 1 ММ дитиотреитола; 500 мкг/мл альбумина из сыворот- Ю ки крупного рогатого скота.

Реакцию ведут в течение 1 ч при 14°С и прекращают добавлением 5 мкл 250 мН ЭДТУК. Несвязанную радиоактивность удаляют на колонке с биоге.„„™«,,i, ,Ма.™. па ™j. t ииоге- Sлем P6-DG. В качестве элюента ис- пользуют буфер ТЕ. Гибридизацию осу- ществляют согласно примеру 3.

30 АТС и кодоном для лизина AAG включают человеческую лидерную ДНК-пос- ледовательност ь.

ДНК -последова тельност ь, сод ержа - щая вставку с человеческим геном 35 МпО -дисмутазы, имеет следующую . структуру.

0

выделения экспрессионной кассеты) вставляют векторы YEp13, pIDB207 и pEAS102 no сайтам Ban HI и Hind III. Y В табл.2 указаны соответствующие плазмиды.

Таблица2 Получаемая плазмида

Вектор

5

I

PIDB207 PEAS102 YEP13

РКН24-АВ РКН25-АС РКН26-А

Дрожжевой штамм WS3C-5g аналогично примеру 10 .трансформируют экс- прессионной плазмидой рКН

Экспрессию плазмиды в 5 штамме WS30-5g подтверждают, используя методику примера 13.

Для подтверждения того, приводит ли введение дрожжевой митохондриаль- ной лидермой последовательности перед ш геном МпО -дисмутазы к тому, что протеин вводится в митохондрии, получают дрожжевые митохондрии согласно примеру И и анализируют активность МпО -дисмутазы в митохондриях, а так- 15 де в цитоплазме

Пример 200

Конструкция экспрессионной кассеты с промотором ADHII (спиртовой дегид- рогеназы II)„20

В экспрессионной кассете рКН1 (пример 66) промотор ADHI заменяют промотором ADHII по сайтам Xho I/ /Вата HI. Промотор ADHII выделяют из плазмиды pMW 5 - ADH II/B/X, Плазмида 25 pMW 5-ADHII В/Х содержит фрагмент Bam Hi/Hind III, содержащий промотор ADHII и имеющий участок гена ADHII 760 п.о, EcoRI-сайт рестрикции в начале кодирующего участка с помощью 30 линкера превращают в Xho I-сзйт рестрикции, причем получают два Bam HI- сайта, расположенные с обеих сторон EBI 1161 SphI

Xho I-сайта Sph I « Xh содержащий стыковое мес промотором и геном, зам нукпеотидными ларами дл удалить кодирующий учас ADHII и вставить правил к гену MnOg-дисмутазы. 3 различные олигонуклео OL1, OL2 и OL3 аналогич или 36, которые незначит чаются длиной нуклеотид вательности промоторной

Согласно примеру 11 о реакции гибридизации ком олигонуклеотидов:

W 1 EBI 1161/EBI 1164 № 2 EBI 1I67/EBI 1160 № 3 EBI 1159/EBI 1168 № 4 EBI 1165/EBI 1166

Синтезы EBI И64, EBI 11 EBI 1165 и лигирование о тидов

№ 1 + № 2 OL1

№ 1 -f If 3 OL2

№ 1 + м i| « QL3

с тем, чтобы получить тр леотидные пары OL1, OL2 следующими ДНК-последова

Олигонуклеотидная пар из EBI 1161/EBI 1164 + E /EBI 1160

5f

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG

GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAG

Ј

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTCTTCT TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAAATAGTGAAGAACAAA

EBI 1164 5

TG EBI

rt

1167

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA GAAGAACCATTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGAT

TCAACTATTAAG

AGTTGATAATTGAGCT 5 EBI 1160

Xho I Олигонуклеотидная пара № 2 (OL2) из

EBI 1161

5

I

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG

GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATGGCTGAAAAAAGTGTGAG Г

Xho I-сайта Sph I « Xho I-фрагмент содержащий стыковое место между промотором и геном, заменяют олиго- нукпеотидными ларами для того, чтоб удалить кодирующий участок гена ADHII и вставить правильный переход к гену MnOg-дисмутазы. Конструируют 3 различные олигонуклеотидные пары OL1, OL2 и OL3 аналогично примеру 1 или 36, которые незначительно отличаются длиной нуклеотидной последовательности промоторной части.

Согласно примеру 11 осуществляют реакции гибридизации комплементарных олигонуклеотидов:

W 1 EBI 1161/EBI 1164 № 2 EBI 1I67/EBI 1160 № 3 EBI 1159/EBI 1168 № 4 EBI 1165/EBI 1166

Синтезы EBI И64, EBI 1167, EBI 1159 EBI 1165 и лигирование ояигонуклео- тидов

№ 1 + № 2 OL1

№ 1 -f If 3 OL2

№ 1 + м i| « QL3

с тем, чтобы получить три олигонуклеотидные пары OL1, OL2 и OL3 со следующими ДНК-последовательностями:

Олигонуклеотидная пара IP 1(OLf) из EBI 1161/EBI 1164 + EBI 1167/ /EBI 1160

EBI 1161/EBI 1164 + EBI П59/ЕВ1 1168

.it

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTCTTCT TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAAATAGCGAAGAACAAA

EBI 1164 5 TG

EBI 1159 5

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA GAAGAACCATTTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGAT TCAACTATTAACTATATC AGTTGATAATTGATATAGAGCT 5 EBI 1168 Xho I

Оли гону клеотидная пара М 3 (OL3) /EBI 1166 из EBI И61/ЕВ1 1164 + EBI 1165/ t5

EBI 1161

5

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG

GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAG С

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTCTTCT TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAAATAGTGAAGAACAAA ,

EBI H64 5 TGADHII - промоторную часть выделяют путем последовательного гидролиза рестриктазами переваривания Xho I и Bam HI и вместо ADHI-промо- тора вводят в экспрессионную кассету рКН1. В результате использования тре различных олигонуклеотидных пар получают три различные экспрессионные кассеты:

рКН1 - ADHII-OL1

pKHI - ADHII-OL2

рКН2 - ADHII-OL3

Ген MnOg -дисмутазы выделяют из плазмиды рЕ022-А (пример 12) в виде Xho I - Есо RI-фрагмента и лигируют во все три АШИ-экспрессонные кассеты. Снабженные геном ЙпО -дисмутазы экспрессионные кассеты.вырезают с помощью Bg1II и Hind III и через сайты рестрикции Bam HI и Hind III лигированием вводят в дрожжевые векторы pID207 и YEp13 аналогично примеру 8.

50

Промотор CUP1 аналоги 20путем замены ADHII-пр встраивают в pKHI по сай рикции Bam HI и Xho I. Д промотор CUP1 лигируют с нуклеотидами, синтезиров логично примеру 36 или 1

Дрожжевые экспрессионные плазмиды с промотором ADHII приведены в

ТабЛ 3 EBI1691 йат HI

5

GATCCCATTACCGACATTTGGGCGCTATACGTGCATATGTTCATGTATGTA TCTGTATTTAAAACACTTrTGTATTATTTTTCCTCATATATGTGTATAGG TTTATACGGATGATTTAATTATTACTTCA EBI 1692

.it

CT

ТаблицаЗ

Вектор + промотор

Экспр ессионная плазмида

PIDB207-ADHII-OL1рЕ040

PIDB207-ADHII-OL2рЕ041

PIDB207-ADHII-OL3рЕ042

YEP13-ADHII-OL1рЕ043

YEP13-ADHII-OL2.рЕ044

YEP13-ADHII-OL3 рЕ045

Дрожжевой штамм WS30-5g трансформируют экспрессионнымиплаэмидами, указанными в табл.3, и продукты трансформации аналогично примеру 13 исслелуют на экспрессиюс

П р и м е р 21„

Конструкция экспрессионной кассеты с промотором тионеина/меди (CUP1).

Промотор CUP1 аналогично примеру 20путем замены ADHII-промотора встраивают в pKHI по сайтам рестрикции Bam HI и Xho I. Дрожжевой промотор CUP1 лигируют с 8 олиго- нуклеотидами, синтезированными аналогично примеру 36 или 11.

29-17М6103°

j

5/

GGGTGGTGAAGTAATAATTAAATCATCCGTATAAACCTATACACATATA

TGAGGAAAAATAATACAAAAGTGTTTTAAATACAGATACATACATGA

ACATATGCACGTATAGCGCCCAAATGTCGGTAATGG

EBI 1696

5 CCACCCTTTATTTCAGGCTGATATCTTAGCCTTGTTACTAGTTAGAAAAAG

ACATTTTTGCTGTCAGTCACTGTCAAGAGATTCTTTTGCTGGCATT1CTT

EBI 1704 5

CTAGAAGAAATGCCAGCAAAAGAATCTCTTGACAGTGACTGACAGCAAA

AATGTCTTTTTCTAACTAGTAACAAGGCTAAGATATCAGCCTGAAATAA

A

EBI 1711

Xba I

5

CTAGAAGCAAAAAGAGCGATGCGTCTTTTCCGCTGAACCGTTCCAGCAAA

AMOACTACCMCGCMTATGGATTGTCAGAATCATATAAAAGAGAAG

CAAATAA

EBI 1710

5

CAAGGAGTTATTTGCTTCTCTTTTATATGATTCTGACAATCCATATTGCGT

TGGTAGTCTTTTTTGCTGGAACGGTTCAGCGGAAAAGACGCATCGCTGTTT

TTGCTT

Xba I

EBI 1716

5

CTCCTTGTCTTGTATCMTTGCATTATAATATCTTCTTGTTAGTGCAATAT

CATATAGAAGTCATCGAAATAGATATTAAGAAAAACAAACTGTACAA

TCAATCAATCAATCATC

Xho I EBI 1717 5

TCGAGATGAITGATTGATTGATTGTACAGTTTGTTTTTCTTAATATCTAT TTCGATGACTTCTATATGATATTGCACTAACAAGAAGATATTATAATGC

Для достижения желаемого сочета- олигонуклеотидами EBI 1691/1692/ ния CUP1-промотора с отдельными /1696/1704/1711/1710/1716 по схеме:

Bam HIXba I

GATCC EBI 1631 EBI 1696 EBI 1711 EBI 1716

EBI 1692 EBI 1704 CTAG EBI 1710 EBI 1717 AGTC

I

1)синтез олигонуклеотидов EBI ,с олигонуклеотидами If 1 и 2, соглас- 1692, EBI 1704, EBI 1710, EBI 1716 но примеру 11; ДНК-фрагмент элюи2)реакции гибридизации олигонук- . из 2%-ного агарозного геля и по леотидов . 55 сайтам Bam HI - Xba I вводят в pES102v

N 1EBI 1691/EBI 1692 (пример 6а). Получают, плазмиду рЕОЧЬ,

If 2EBI 1696/EBI 1704Олигонуклеотиды К 3 и k лигируют

If 3EBI 1711/EBI 1710друг с другом, ДНК-фрагмент элюируют .

(f 4EBI 1716/EBI 1717из 2%-н ого агарозного геля и вводят

3117ЈЯ610

по сайтам Xba I - Xho I в Получают плазмиду Теперь весь CUP 1-промотор можно лигировать в рКН1 по сайтам Bam H1 и Xho I, Получаемую экспрессионную кассету называют рЕОй8

Ген МпОя-дисмутазы выделяют из плазмиды рЕ022-А (пример 12) с помощью рестрикции энзимами Xho I иЕсо RI и лигируют в экспрессионную кассету . Снабженную геном МпОг-дисмута- зы экспрессионную кассету гидролизуют рестриктазой Bglll и аналогично примеру 8 по сайтам Bam HI и Hind III вводят в дрожжевые векторы pIDB207 и 15 уЕр13.

Дрожжевые экспрессионные плазмиды с CUP 1-промотором приведены в таблЛо

10

20 д 25

Т а б л и ц а 4

AGCTTACAAGCAATGTCTTCAGAAAACCTAGGGTCCAAGGTTAAGCCATA

TCCCAGCTCAGTAAAGCCAGGAGCATCCTCATTTCCCAATG

OL40:

5

AAATGAGGATGCTCCTGGCTTTACTGAGCTGGGATATGGCTTAACCTrGGA

CCCTAGGTTTTCTGAAGACATTGCTTGTA

OL 41:

5

GCCC7CCTGTTCCCTCTACTGGCAGCCCTAGTGATGACCAGCTATAGCCCTG

TGGATCTCTGGGCAAGCACAGCCTCCCCGACCTGCCCTACGACTACGGTGCT

OL42:

5

CTAGAGCACCGTAGTCGTAGGGCAGGTCGGGGAGGCTGTGCTTGCCCAGAGA

TCCAACAGGGCTATAGCTGGTCATCACTAGGGGTGCCAGTAGAGGGAACAG

GAGGGCCATTGGG

получают фрагмент ДНК длиной 192 л„о с выступающими концами Hind III/

Hind IIICAP сайт

5

AGCTTACAAGCAATGTCTTCAGAAAACCTAGGGTCCAAGGTTAAGCCATA ATGTTCGTTACAGAAGTCTTTTGGATCCCAGGTTCCAATTCGGTAT

лидер

TCCCAGCTCAGTAAAGCCAGGAGCATCCTCATTTCCCAATGGCCCTCCTGTT CC

AGGGTCGAGTCATtTCGGTCCTCGTAGGAGTAAAGGGTTACCGGGAGGACA

32

5

Дрожжевой штамм WS30-5g трансформируют аналогично примеру 13 экспрес-1 сионными плазмидами, указанными в табл., и продукты трансформации исследуют на экспрессию

П р и м е р 22. Экспрессия МпО,- дисмутазы в эукариотических клетках животного происхождения о

а)о Конструкция экспрессионных плазмид.

Ген MnOg- дисмутазы с помощью синтетических олигонуклеотидов снабжают на конце 5 соответствующими контрольными и лидерными последовательностями. Необходимыми контрольными последовательностями являются сайт САР и стартовый сигнал АТС. Для секреции в среде используют ли- 0 дерную последовательность омега- интерферона (СО-ИФ)«, Для внутриклеточной продукции используют человеческую митохондриальную лмдерную последовательность МпОг-дисмутазы. 5 Путем сочетания четырех синтетических олигонуклеотидов 01,39,, OL40, OL41, OL42, получаемых согласно примеру 36 или 11:

/Xba I.

3317М6Ю34

AGG

CTCTACTGGCAGCCCTAGTGATGACCAGCTATAGCCCTGTTGGATCTCTGGG

GAGATGACCGTCGGGATCACTACTGGTCGATATCGGGACAACCTAGAGACC С

-ys-старт Мп02-дисмутазы

Xba I

CAAGCACAGCCTCCCCGACCTGCCCTACGACTACGGTGCT GTTCGTGTCGGAGGGGCTGGACGGGATGCTGATGCCACGAGATC

Этот фрагмент ДНК представляет собой 5 -нетранслируемый участок (0-ИФ с .сайтом САР, стартовым сигналом АТС,СО-ИФ-лидерной последовательностью (21 аминокислота) и ко-

дирующий участок первых тринадцати

«

OL43:

с I

TTGAGCCGGGCAGTGTGCGGCACCAGCAGGGAGCTGCCTCCGGTTTTGGGGTA TCTGGGCTCCAGGCAGAAGCACAGCCTCCCCGACCTGCCCTACGACTACGGTG

СТ

OL44:

5

CTAGAGCACCGTAGTCGTAGGGCAGGTCGGGGAGGCTGTGCTTCTGCCTGGA

GCCCAGATACCCCAAAACCGGAGGCAGCTGCCTGCTGGTGCCGCACAGTGCCC

GGCTCAACATTGGG

получают ДНК-фрагмент длиной 196 п. о с выступающими концами Hind III/

САР сайт

Hind HI 5

AGCTTACAAGCAATGTCTTCAGAAAACCTAGGGTCCAAGGTTAAGCCATA ATGTTCGTTACAGAAGTCTTTTGGATCCCAGGTTCCAATTCGGTAT

старт лидера МпОг-дисмут

TCCCAGCTCAGTAAAGCCAGGAGCATCCTCATTTCCCAATGTTGAGCCGGGC A

AGGGTCGAGTCATTTCGGTCCTCGTAGGAGTAAAGGGTTACAACTCGGCCC GT

GTGTGCGGCACCAGCAGGCAGCTGCCTCCGGTTTTGGGGTATCTGGGCTCCAG CACACGCCGTGGTCGTTCGTCGACGGAGGCCAAAACCCCATAGACCCGAGGT С

Lys-старт протеина Мп02-дисмутазы ,Xba I

GCAGAAGCACAGCCTCCCCGACCTGCCCTACGACTACGGTGCT CCGTCTTCGTGTCGGAGGGGCTGGACGGGATGCTGATGCCACGAGATC

Этот ДНК-фрагмент представляет .. собой часть нетраислироваиного $ - участка СО-ИФ с сайтом САР и стартовым сигналом АТС, а также с мито- хондриальной лидерной последовательностью МпОг-дисмутазы человека (2k аминокислоты) для внутриклеточной продукции Мп02-дисмутазы и кодирующего участка первых тринадцати аминокислот дисмутазы.

аминокислот МпСи-дисмутаэы (от лизина до аланинаТ

Путем сочетания синтетических олигонуклеотизов OL39, OL40 указанных формул и синтетических олигонук- леотидов OL43 и OLA4

УХЬа I.

ь

Олигонуклеотиды OL39, OLA2 и OL44 фосфорилируют на Ь1-конце при помощи Т -полинуклеотидной киназы с тем, чтобы обеспечить осуществле- ние последующей реакции лигирования.

Реакционная смесь: 2 мкл олиго- нуклеотида (100 пмоль); 1 мкл фер линкерной кинаэы; j мкл 10 мМ АТР; 1 мкл ТА-полинуклеотидной киназь, 10 ед/мкл.,

35

10 буфера линкерной киназы содержит 0,7 М трис-HCl, рН 7,6; 0,1 М MgClj ; 0,05 М дитиотреитола.

Реакцию ведут 30 мин при 37°С, энзим инактивируют путем нагревания до 100°Сс

Олигоиуклеотиды OL40, OLA1 и OL43 образующие 5 концы готовых ДНК- фрагментов, не фосфорилируют во избежание образования мультимерных ДНК-вставок при последующей реакции лигирования.

Гибридизацию комплементарных оли- гонуклеотидов друг с другом осуществляют следующим образом:

Олигонуклеотиды А и Б представляют собой комплементарные олиго- нуклеотидыо

Реагенты: № 1 : А OL39 № 2 : А N 3 : А 01ЛЗ Реакционная смесь:

Б 01ЛО Б Б OIM 1 мкл олигонуклеотида А (100 пмоль); 1 мкл оли- гонуклеотида Б (100 пмоль); 8 мкл воды„

Реакционные смеси № 1 - 3 нагревают при 100°С в течение 2 мин и-медленно охлаждают в водяной бане до комнатной температуры,,

Получаемые результаты реакций 1 - 3-короткие двунитевые фрагменты ДНК лигируют друг с другом следующим образом:

ЛидерW-ИФ: 5 мкл реакционной смеси № 1; 5 мкл реакционной смеси № 2; 1,5 мкл/мл 10 мМ АТР; 0,5 мкл/ /мл ДНК-лигэзы (7 ед/мкл)о

Митохондриальная лидерная после- довательность МпО -дисмутазы: 5 мкл реакционной смеси № 1; 5 мкл реакционной смеси If 3; 1,5 мкл 10 мМ АТР 0,5 мкл ДНК-лигазы (7 ед.К

Реакции протекают в течение 15 ч при температуре 4°С,

ДНК разделяют по размерам на 2%-ном агарозном геле и желаемые ДНК-фрагменты длмной 192 и 196 п.о„ элюируют из геля.

Готовый ДНК-фрагмент длиной 192 п.о, с лидером О)-ИФ для секреции МпО -дисмутазы в среду- лигируют в HgOD6 по сайтам Hind III и Xba I. Получают плазмиду HSODJ U Плазмиду гидролизуют по сайтам Eco R1 и обрабатывают фрагментом Кленова с обра- зованием тупых концов Затем переваривают Hind III и большой ДНКМ

17 161036

фрагмент длиной приблизительно 700 п ;

0

5

о. выделяют из 1,5%-ного агарозного геля, ДНК-фрагмент лигируют в эука- риотический вектор pSV2 gptdhfr, который получают из pBR 322 dhfr разрезанием Esp I и Hind III, заполнением фрагментом Кленова и лигировани- ем в вектор pSVigpt по сайтам Eco RI - Bam HI, заполненным фрагментом Кленова и обработанным щелочной1 фасфата- зой„

Лигирование выделившегося большого ДНК-фрагмента, имеющего приблизи- 5 тельно 700 п.о. в вектор pSV2gptdhfr осуществляют после предварительного гидролиза вектора с помощью Ара I, заполнения сайта рестрикции фрагментом Кленова и дополнительного гидролиза с помощью Hind III Таким образом, ген gpt заменяют в векторе на ген МпО -дисмутазы„ Смесь лигирования используют для трансформации E.coli НВ101с После рестрикционного анализа плазмидной ДНК положительных клонов получают экспрессионную плаэмиду, которую обозначают как pSV2dhfrSOD1.

Аналогично ДНК-фрагмент с мито- хондриэльным лидером Мп02-дисмутазы длиной 196 Лео по сайтам Hind III - Xbalлигируют в HS016, Получают плазмиду HSOD12 Ген с регуляторными последовательностями.клонируют в эукариотический вектор pSV2gptdhfr по сайтам рестрикции Hind III - Eco RI после предварительного заполнения выступающих концов Eco RI энзимом Кленова с Получаемую экспрессионную плазмиду обозначают как pSV2dhfrSOD2c Экспрессию pSV2dhfrSOD1 и pSV2dhfrSOD2 осуществляют в клетках СНО с дефицитом дегидрофолатредуктазы, которые культивируют вв -МЕМ-средё (10% эмбриональной телячьей сывооот- i ки , гипоксантин, тимидин) „ Транс- фекцию клеток СНО экспрессионными плазмидами pSV2dhfrSOD1/D2 осуществляют известным образомо За день до трансфекции клеток подают на питательные пластинки

Клетки обрабатывают продуктом осаждения фосфатом кальция, содержащим до 10 мкг плазмидной ДНК, при 37°С в течение k ч. Затем среду от- А сасывают и заменяют селекционной 55 средой 06-МЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячей сыворотки, которую каждые два дня заменяют. Колонии трансформированных клеток появляются

0

5

0

4S

50

37

по истечении 12-16 дней. Надоса- дочную жидкость (среду) исследуют на наличие активности МпО/,-дисмутазы

П р и м е р 23. Очистка Мп02-дис- мутазы,

а)Разрушение клеток. Аналогично примеру 15 клеточную

массу промывают дистиллированной водой и в концентрации 30% суспендируют в 50 мМ трис-уксусной кислоты, рН 8,5. Клетки разрушают в мельнице, содержащей стеклянные шарики диаметром 0,5 0,5 мм„ Экстракт клеток центрифугируют (16000 об/мин, 15 мин, °С и осадок удаляют).

б)Осаждение нагреванием и кис лотой о

Надосадочную жидкость со стадии

II- Н

а нагревают до 60 С, в ледяной бане охлаждают до 20°С, добавлением t М уксусной кислоты рН среды устанавливают до 5,5, центрифугируют при 16000 об/мин и подвергают диализу с помощью трис-уксусной кислоты (60 мМ. рН 5,5).

в)Катионообменная хроматография Содержащий MnOg-дисмутазу диализат со стадии б подают на колонку с СМ-сефарозой, уравновешенную 60 мМ трис-уксусной кислотой, рН 5,5, элюируют линейным градиентом, (15 объемов колонки) от 60 мМ трис-уксус,ной кислоты до 0,12 М ацетата натрия

г)Гельпроникающая хроматография. Фракции с активностью МпО -дисмутазы со стадии в собирают и подают на колонку, содержащую сефакрил S 300 HR или суперозу 12, уравнорешен- ную 0,1 М фосфатным буфером, ,8.

EBI 1161 Sph I 5«

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGXG С

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTCTT TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAAATAGTGAAGAACAAA

EBI 1164 5 TG

EBI 1167 5

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA GAAGAACCATTTATCTTATAGTrCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGAT ТСААСТАТТААС AGxrGATAATTGAGCT 5 EBI

16103#

Элюцию проводят тем же буфером.

Получают 20 мг 0,1 мг/r клетки) чМпОг-дисмутазы.

s

Формула изобретения

Способ получения человеческой JQ MnO -дисмутазы, заключающийся в том, что из плацентарной или печеночной ткани человека выделяют мРНК, получают поли(А), синтезируют двуни- тевую кДНК, конструируют генбанк 15 кДНК, далее выделяют последовательность ДНК, кодирующую Mn-0-дисмута- зу, при помощи зондов:

С С С 20 5( TGITA ТТ ТС TCIGTIACITT ,

Т Т Т ИАСА ,

S TCIGTIAC гг ТСССА TTIAT з с т с

г

или последовательности кДНК гена дисмутазы человека, последовательность ДНК достраивают до стартового кодона или стоп-кодона, непосредстг венно за стартовым кодоном гена размещают митохондриальную лидерную или сигнальную последовательность ДНК МпО -дисмутазы S,cerevisiae или человека, затем последовательность ДНК, кодирующуя МпОг-дисмутазу, используют для конструирования вектора экспрессии, состоящего из промоторов ADHI или ADHII, пар олигонуклео- тидов EBI 1161/EBI 1164 + EBI 1167/ /EBI 1160 формулы

39 1741610 Ю

Xho I

EBI 1161/EBI 1164 + EBI 1159/EBI 1168 формулы EBI 1161 5

CCTATCACATATAMTAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAG ; С.

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTCTTCT TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAAATAGTGAAGAACAAA

EBI 1164 5

TG .

EBI 1159

5

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA GAAGAACCATTTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGAT TCAACTATAACTATATC AGTTGATAATTGATATAGAGCT 5 EBI 1168 .

Xho I

EBI 1161/EBI 1164 + EBI 1165/EBI 1166 формулы EBI 1161 5

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGG TCATCGCTGAAAAAAGTGTGAG С

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTCTTCT TTTATGAGAATCATGACGAGAGAACAACAAAAATAGTGAAGAACAAA

EBI 1164 5 TG

EBI 1165

5

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA GAAGAACCATTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGAT TCAACTATTAACTATATCGTAATAC AGTTGATAATTGATATAGCATTATGAGCT 5 EBI 1166

Xho I

I

или CVP1, сигнала или pE042, или , или , или инициирования, митохондриальной ли- , или рЕФ50, или рЕ051, которой дерной или сигнальной последователь- 0 трансформируют штаммы Saccharomyces . ности Saccharomyces cerevisiae или cerevisiae, или плазмиду pSV2dhfrSODt человека, стоп-кодона и терминатора ( или pSV2dhfrSOD2. которой трансфор- ADHII, далее конструируют плазмиду мируют штаммы культивируемых клеток, PWS550A, или pWS490A, или pWS491A, культивируют трансформированные клет- или PWS371A, или PWS372A, или pWS373A, 4$ Ки, выделяют и очищают целевой про,- или рЕ02Ч - АВ,.или рЕ025 - АС, или , дукт путем .экстракции, осаждения и - AD, или рЕОЧО; или , хроматографии.