Способ первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои.

Цель изобретения - повышение достоверности первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои.

Способ заключается в инокуляции стерильных семян сои исследуемыми штаммами бактерий Phizobium, выращивание растений на 1 этапе в стерильных для корневой системы условиях в течение 15-20 сут до появления клубеньков на корнях растений, пересадке на 2 этапе растений в почву с природной популяцией клубеньковых бактерий сои и выращивание в течение 30-40 сут, определение сухой массы надземной части растений и отборе эффективных штаммов бактерий по наибольшей прибавке сухой массы растений.

Пример. В пробирку диаметром 21 мм и высотой 200 мм помещают полоску фильтровальной бумаги (ширина 200, высота 150 мм), сложенную гармошкой и затем свернутую в рулон. Для поддержания влажности вокруг семян в верхней части рулона делают углубление. В пробирку вносят 20-30 мл

1СЬ

00

to

СО 4ь 1C

питательной среды для растений следующего состава, г/л: KtHPO 1,0; MgS04 1,0, CaS04 0,5, FeS04,H,BO,, MnS04, и соль молибдена следы.

Пробирку закрывают и стерилизуют в автоклаве при 1 атм 30 мин. В подготовленную пробирку с фильтровальной бумагой высаживают по одному стерильному семени сои и вносят 1 мл суспензии клубеньковых бактерий сои с содержанием 1 млн. клеток/мл. Б контрольные пробирки вносят 1 мл стерильной воды. Пробирки, закрытые ватными пробками, термостатируют в течение 3-5 сут при 25-27°С до прорастания семян сои. Затем их выставляют на стеллажи с дополнительным освещением. Для затенения корневой системы растений на пробирки одевают колпачки из плотной бумаги или темной пленки. В день выхода семядолей из пробирки ватные пробки снимают, а вокруг стебля укладывают фильтр из ваты. По мере необходимости соблю- дал стерильность, в каждую пробирку дополнительно вносят по 10-20 мл питательного раствора. Растение сои в пробирках со стерильной корневой системой выращивают в течение 15- 30 сут. Выявлено, что для образования клубеньков на корнях за счет искусственной инокуляции достаточно выращивания растений сои в пробирках в течение 15-20 сут. К этому времени на корнях сои насчитывают в среднем 7-11 клубеньков в расчете на одно растение. Более короткий промежуток времени выращивания растений в пробирках (менее 15 сут) не в полной мере обеспечивает образование клубеньков на корнях сои. Достоверность данных проверяют по отсутствию клубеньков на корнях неинокули- рованных растений сои. На каждом ва- рианте выращивают не менее 15 растений сои.

На втором этапе способа 15-20-су точные растения сои с клубеньками на корнях извлекают из пробирки и сразу же пересаживают в почву с природной популяцией специфичных клубеньковых бактерий. Пересаженные в почву предварительно инфицированные растения сои некоторое время устойчивы к вторичному заражению клубеньковыми бактериями, обитающими в почве. Этого времени достаточно для проявления

эффективности исследуемых штаммов клубеньковых бактерий сои.

После высадки растений сои в почву проводят первичный полив. В течение 30-50 сут растения сои выращивают в почве с естественными (поле) или искусственными (теплица) условиями. По приросту сухого вещества надземной массы сои определяют эффективность испытываемых штаммов клубеньковых бактерий. / В опыте были изучены штаммы клубеньковых бактерий сои Rhizobium japonicum-646, 648а, 639а, ТС-37, ТД-55, АС-17 (табл.1.).

Испытание указанных штаммов сои лабораторно-полевым способом показало их существенно разную эффективность в повышении массы сухого вещества надземной части растений. Так штаммы 648а и 639а дают прирост сухого вещества надземной массы сои в 2,1-2,5 раза и более эффективны в сравнении с известным штаммом 646,

Определение длительности лабораторного и полевого этапа выращивания сои в способе.

При отработке способа установлено появление клубеньков на корнях сои на первом этапе на 12-15 сут после посева инокулированных семян в пробирки.

Однако некоторые штаммы клубеньковых бактерий через указанный выше период времени вызывали образование клубеньков на корнях сои только у 78-95% растений. При увеличении первого периода до 20 сут клубеньки на корнях сои отмечают практически у всех растений. Поэтому первый этап способа ограничивают 15-20 сут выращивания сои в стерильных пробирках.

Оптимальная продолжительность выращивания пересаженных в почву растений сои (второй этап способа) составляет 30-40 сут (табл.2). При увеличении продолжительности выращивания растений сои на втором этапе способа заметно снижается эффективность искусственной инокуляции. Более короткая продолжительность выращивания растений сои не обеспечивает оптимального проявления эффективности испытываемых штаммов клубеньковых бактерий.

Сравнительная оценка способов первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои.

Первичный отбор эффективных штаммов бактерий сои R.japonicum проводят известным лабораторным и лабора- торно-полевыми способами.

Описание постановки опыта согласно лабораторно-полевому способу описано выше, при этом используют сорт сои ВНИИС-1.

В анализируемых способах испытывают примерно одинаковое количество штаммов клубеньковых бактерий сои с различной эффективностью. В качестве стандарта-эталона используют известный эффективный штамм 646.

При использовании известного лабораторного способа с тремя видами

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Целью изобретения является повышение достоверности первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Способ заключается в инокуляции стерильных семян сои исследуемыми штаммами бактерий RHIZOBIUM, выращивании растений в стерильных для корневой системы условиях в течение 15-20 сут. до появления клубеньков, затем пересадке растений в почву с природной популяцией клубеньковых бактерий сои и выращивании в течение 30-40 сут., определении сухой массы надземной части растений и отборе эффективных штаммов по наибольшей прибавке сухой массы растений. Способ позволяет по сравнению с известными лабораторными, вегетационными и полевыми способами повысить достоверность первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий для последующей селекционной работы с ними и при этом снизить трудозатраты. 6 табл.

Известный лабораторный способ пер- 10 субстрата только в песчаной культуре

вичного отбора штаммов бактерий сои, заключается в выращивании инокулнро- ванных растений в сосудах емкостью 1 л на стерильной агаризованной среде, песчаной культуре или почве.

Агаризованная среда представляет собой раствор Прянишникова с 0,1 нормой азота и добавлением 2% агар-агара. Этот же раствор, но без агар- агара используют для песчаной культуры. Приготовленные сосуды с субстратами стерилизуют при 2 атм в течение 30 мин. В сосудах с песком и почвой поддерживают влажность на уровне 70% от полной влаго- емкости. Семена сои инокулируют из расчета 1 млн. бактериальных клеток на 1 семя. Используют сорт сои ВНИИС-1. В каждом сосуде оставляют по 4 растения, которые выращивают 30-40 сут. Дальнейшее выращивание растений сои ограничивают возможностями емкости сосудов, а также высокой агрессивности природных Phizo- bium japonicum. Использование многолитровых сосудов резко снижает объем испытываемых штаммов, что недопустимо при первичном отборе.

В лабораторно-полевом способе первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои также использовался сорт ВНИИС-1. Семена инокулировались из расчета 1 млн./мл клеток на одно семя.

Предлагаемьй способ состоит из двух этапов - лабораторного и полевого. В условиях лаборатории бактеризованные растения сои выращивали в пробирках на фильтровальной бумаге до фазы образования клубеньков в течение 15-20 сут. За счет выращивания растений сои со стерильной корневой системой в пробирках удается резко увеличить количество испытываемых штаммов.

Сравнивая известный (лабораторный) и лабораторно-полевой способы первичного отбора (табл.3), отмечают значительные преимущества последнего.

удается отобрать минимальное количество штаммов клубеньковых бактерий сои для последующих испытаний в полевых опытах. В сосудах, где используют в качестве субстрата агар-агар и почву, искусственная инокуляция семян сои не оказывает положительного влияния на продуктивность растений. В среднем из 45 испытываемых

штаммов известным способом только 2% повышают продуктивность растений сои на 25% в сравнении с контролем. В то же время при испытании этих же штаммов лабораторно-полевым способом 61% бактериальных культур повышают продуктивность растений сои более чем на 25% табл.З).

Способ позволяет выявить штаммы, вызывающие повышение продуктивности

растений сои в 2-2,5 раза по сравнению с контролем. Это дает возможность вести первичный отбор наиболее эффективны:: штаммов клубеньковых бактерий сои для последующе окончательного их испытания в полевых опытах (табл.4).

Такие данные приведены в табл.4 по сравнительному анализу эффективности штаммов лабораторно-полевым и

известным способом проведения первичного отбора.

Известный штамм 646 не эффективный при испытании его известным лабораторным способом с субстратами

агар-агар, песок,почва. Использование нового способа эффективности этого штамма подтверждается.

Штаммы 648а, 639а, ТС-37, ТД-55, АС-17, испытываемые известным способом, являются слабо эффективными или не эффективными. При испытании их лабораторно-полевым способом эти штаммы показывают высокую эффективность. Так, штаммы 648а и 639а

увеличивают прирост сухого вещества надземной массы сои в 2,1-2,5 раза.

Сравнивая результаты, полученные лабораторным и лабораторно-полевым

способами первичного отбора перспективных штаммов, установлены значительные преимущества последнего. Способ позволяет резко поднять результативность и достоверность первичного отбора новых штаммов клубеньковых бактерий сои, он менее трудоемок, дает возможность вести отбор штаммов не только в летний (поле), но и зимний (теплица) периоды, что ускоряет селекционный процесс.

В табл.5 .показаны результаты вегетационного опыта по оценке эффективности штаммов ризобий сои. В сравнении с лабораторно-полевым способом, в котором для этих штаммов установлены существенные различия в эффективности различных штаммов от -«-9 до +257%, в вегетационном опыте по приросту фитомассы эффективность штаммов значительно более близкая (от -13 до +11 % разница по отношению к контролю). По признаку зерновой продуктивности изменения по сравнению с контролем составляют -2 до +8%.г

Трудозатраты при проведении вегетационного опыта (40 сосудов Вагнера) 30 составляют (без закладки и учета урожая) 96 человекодней, тогда как при лабораторно-полевом способе (40- вариантный опыт) 24 человекодня на весь объем работ.

При выявлении эффективности штаммов ризобий в полевом опыте (10-ти вариантная схема, общая площадь делянки 50 м2) общие затраты достигают 120 человекодней при учете зерновой до продуктивности и 60-70 человекодней при учете показателя прироста и достоверность полученных данных по сравнению с лабораторно-полевым опытом также значительно ниже (табл.6). 45

Таким образом, лабораторно-поле- вой способ первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бакте- рий сои позволяет в сравнении с известными способами повысить объективность отбора и снизить трудозатраты .

Формула изобретения

Способ первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои, включающий инокуляцию стерильных семян растений исследуемыми штаммами бактерий рода Khizobium, выращивание растений в стерильных для корневой системы условиях, определение массы сухого вещества надземной части растений с последующим отбором штаммов бактерий по наибольшей прибавке сухой массы растений, отличающийся тем, что, с целью повышения достоверности способа, выращивание инокулированных растений в стерильных условиях осуществляют в течение 15-20 сут, затем растения пересаживают в почву с природной популяцией клубеньковых бактерий сои и выращивают 30-40 сут.

Т а в л и ц

1

Штаммы

Масса надземной части сои, % к контролю

стный

178 257 219 145 109 148

Таблица 2

онтроль 6390 ТС-31 АС-37 ТС-37 ТД-73 АС-17 АС-20 АС-26- ЗД-4

19,1 18,6 21,2 20,4 19,9 20,0 21,1 18,8 19,1 20,0

100 87 111 107 104 105 110 98 100 105

НСР . 1,6 г/сосуд,

Та-б лица 3

Таблица 4

9,6

9,4

10,5

10,3

9,8

9,6

10,4

9,5

9,5

9,7

100

98

109

107

102

100

108

99

99

101

9,5

9,2

10,7

10,1

10,1

10,4

10,7

9,3

9,6

10,3

5Х 0,5 г

6,8 7,6 7,2 6,6 6,2 5,5 6,2 7,6 7,3

Надземная сухая масса, г 6,8 1-ая фаза плодообразования, % к контролю 100 Урожай- семян

сои, ц/га 18,03 18,13 19,01 17,13 17,79 18,15 16,6318,1318,5517,5 % к контролю

100 112 106 97

91

81 91 112 107

100

100 105

95

99 101 103 100 103 97

НСР05. 2,33 ц/га (13%) х 0,81 ц (4,5%)

Т а б л и ц а 6

91

81 91 112 107

7,13 17,79 18,15 16,6318,1318,5517,5

95

99 101 103 100 103 97