Способ получения антигенов карбофоса Советский патент 1991 года по МПК G01N33/531 

СП

С

Изобретение относится к иммунохимии (иммунобиотехнологии) и может быть использовано для получения антител к карбофосу, а также в иммуноанализе. Целью изобретения является повышение специфичности и антигенной активности. Новый ряд производных карбофоса, обладающий новым комплексом свойств, позволяет использовать их в качестве антигенов для получения антител, специфичных к карбофосу, и в иммунохимических способах определения карбофоса и его производных. Получение соединений данного класса осуществляют путем синтеза хлорангидрида карбофоса и конъюгирования его с высокомолекулярным носителем, содержащим аминогруппы. 1 табл.

Изобретение относится к иммунохимии (иммунобиотехнологии) и может быть использовано для получения антител к карбофосу, а также в иммуноанализах: иммунофермент- ном и радиоиммунном способах определения карбофоса и его производных.

Цель изобретения - повышение специфичности и антигенной активности.

Получение соединений данного класса осуществляют путем синтеза хлорангидри- да карбофоса и конъюгирования его с высо- комолекулярным аминосодержащим носителем.

//

с-с

II

с-с

:о с2н5онt:60-65CCH-COOH

2г

О

сн-соос2н5

Малеиновый Абсолютный Полуэфир ангидрид спирт малеиновой

кислоты

1 2. Получение монокарбофосной кислоты реакцией присоединения диметилди- тиофосфорной кислоты по двойной связи к полуэфиру малеиновой кислоты

(СН,0)2Р5СЦ-СООН

ГСООН McHjWX сн-соос2н5s

СНг СООС,Н5

s сиа- соон

II I

(CM jO)2 РЬСМ-COOCjHs

CS VJ

о с о

00

Изомеры монокарбоновой кислоты при 20 - 22°С в течение 3 дней.

S CH2-COOC2H5

n i 2 l 4socio-

(CH30)2PSCH-COOH2

t 60-65°CSCH2-C Ci

, i u

4 (CH30)2PSCH-COOC2H5 Диметилформамид 2. Получение конъюгата карбофос - R

S CH2-COOC2H5 ii I+ (NH2)hRn(CH30)2PSCH-COCl2n

S CH2-COOC2H5

(CH30)2PSCH-CO

(NH)nR

П p и м e p 1. Получение хлорангидридов монокарбофосных кислот.

К 24,5 г расплавленного малеинового ангидрида (0,25 М) в 4-горлой колбе с обратным холодильником, нагретой на водяной бане до 50 - 55°С, по каплям приливают при непрерывном перемешивании 11,6 г абсолютного спирта (0,252 М). Температуру поднимают до 60 - 65°С и выдерживают 2 ч. После охлаждения полуэфир малеиновой кислоты нейтрализуют насыщенным раствором карбоната катрия до рН 7,0 - 7,1. Примесь среднего эфира малеиновой кислоты удаляется 3-кратной экстракцией серным эфиром по 100 мл. Водный раствор подкисляют концентрированной серной кислотой до рН 3,0 и полуэфир экстрагируют 100 мл эфира 3 раза. Эфир из экстракта отгоняют водоструйным насосом и процедуру очистки полуэфира повторяют еще раз. Продукт обезвоживают прокаленным сульфатом магния. Показатель преломления чистого полуэфира по20 1,4548 -1,4550. Если показатель преломления продукта отличается от показателя чистого продукта, очистку повторяют еще раз. Выход полуэфира 30,4 г (84,4%).

К 36 г 96,6 диметилдитиофосфорной кислоты (ДДФК) (0,22 М) в 30 мл бензола на водяной бане при перемешивании в течение 20 мин прикапывают 28,8 г полуэфира малеиновой кислоты (0,2 М). Реакционную смесь оставляют на 3 дня, периодически встряхивая колбу. Избыток ДДФ К (3,16 г) нейтрализуют 10%-ным раствором бикарбоната натрия (16,6 мл). Нижний водный слой экстрагируют 10 мл бензола. Бензольные растворы объединяют. Бензол отгоняют под вакуумом. Показатель преломления по20 1,516. Выход монокар- бофосфорной кислоты 49,8 г (80,84%).

В 4-горлую колбу с механической мешалкой и обратным холодильником с хлор- кальциевой трубкой, содержащую 20,6 г

0

5

5 5

0

5

0

5

0

0

5

монокарбофосной кислоты (0,116 М). 1 мл диметилформамида в качестве катализатора и 50 мл бензола, при перемешивании прикапывают 5,4 мл хлористого тионила в 20 мл бензола. Молярное соотношение реагентов 1:1,1. Температуру реакционной среды осторожно повышают до 60°С и выдерживают 2,0 - 2,5 ч. Бензол и избыток хлористого тионила отгоняют водоструйным насосом при 60°С в течение 2 ч. Полученный продукт - маслянистая прозрачная жидкость буро-коричневого цвета.

Вычислено, %: Р 9,66; S 19,99; CI 11,05 Найдено, %: Р 9,75; S 20,74; CI 10,9. П р и м e p 2. Получение антигенов карбофоса.

а.Конъюгат карбофос - человечий сывороточный альбумин.

5 г человечьего сывороточного альбумина (ЧСА) растворяют в 100 мл 0,1 М натрий- фосфатного буфера (рН 8.0) при помешивании на магнитной мешалке, добавляют 20 мл ацетона. К раствору по каплям приливают 0,5 мл хлорангидрида карбофоса в 5 мл ацетона, рН среды, контролируемое рН-метром, поддерживают в пределах 7,6 - 8,0 добавлением 1 М NaOH. Среду выдерживают на водяной бане 2 ч. Коньюгат осаждают добавлением 49,0 г сульфата аммония (80%-ное насыщение). Осадок конъюгата переносят в диализный мешок и диализируют против физиологического раствора (0,11 М NaCI).

Получают 80 мл раствора конъюгата (60 мг/мл белка). Число карбофосных остатков на 1 молекулу ЧСА, определенное с помощью 2,4-динитрофторбензола, составляет 12- 16.

б.Конъюгат карбофос - ДНК.

0,118 г натриевой соли ДНК из селезенки крупного рогатого скота растворяют в 40 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера и денатурируют добавлением концентрированного NaOH до рН 12,0 - 12,5. К раствору добавляют 20 мл ацетона и рН понижают раствором HCI (1:1) до 8,0. После охлаждения на водяной бане до 4°С к раствору ДНК по каплям добавляют 0,1 мл хлорангидрида карбофоса в 3 мл ацетона, рН среды поддерживают на уровне 7,7 - 8,0 добавлением 1 М NaOH с помощью рН-метра. Реакционную смесь выдерживают на водяной бане при перемешивании магнитной мешалкой в течение 2 ч.

В таблице представлены характеристические данные НК-спектров.

П р и м e p 3. Применение и свойства антигенов карбофоса.

Иммунизацией животных (кроликов) конъюгатом карбофос - ЧСА получают антисыворотки по одной из известных методик. Синтезированный антиген и антисыворотки, полученные с помощью данного антигена, исследуют методом ИФА.

В 8 лунок (1 ряд) 96-луночной иммунологической полистироловой плашки вносят по 0,2 мл раствора 1 мкг/мл по ДНК (контроль на перекрест иммуногенной части коньюгата с антисывороткой). В остальные - по 0,2 мл коньюгата карбофос - ДНК в НФБ в той же концентрации. Плашки инкубируют в течение ночи при 4°С и отмывают 3 раза 0,01 М натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,1 М NaCI и 0,05%- ный детергент - тритон Х-100 или твин 20 (ТФБ). В отмытые лунки вносят антисыворотки по схеме:

123456 А О О 2 4 6 8 468 4 b 8 3579 3579

ВОО 2

СОО 2

Е21

F21

G21

Н 2 1

3 5 3 5

9 9

где О -ТФБ;

1- антисыворотка, полученная с по- мощью конъюгата по прототипу;

2- антисыворотка против карбофоса в разведении 1 : 200;

3- 9 - антисыворотка против карбофоса

в разведении 1 : 200, содержащая соответ- ственно 100000; 10000; 1000, ...1; 0,1 нг/мл карбофоса.

После инкубации с антивидовыми антителами, меченными пероксидазой, и перок- сидазным субстратом получены следующие результаты:

4 s б

4 1 2 4 4 1 2 4

4

4

1

1

1

1

1

2 4

24

34 3 4 3 4 3 4

где 0 - окраска отсутствует;

1 - 4 - степень окрашенности (от почти бесцветного до ярко-желтого цвета).

Из данных иммуноферментного анализа следует, что синтезированный антиген не связывается с антителами, полученными иммунизацией животных коньюгатом по прототипу.

Антитела, полученные с помощью синтезированного конъюгата, специфичны к карбофосу и могут быть использованы в им- мунохимических методах анализа карбофоса и его производных.

Формула изобретения

Способ получения антигенов карбофоса, включающий синтез активированного производного и конъюгацию его с высокомолекулярным носителем, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности и антигенной активности, в качестве активированного производного используют хлорэнгидриды монокарбофосных кислот, а конъюгацию ведут в 0,1 Н К-фосфатном буфере, содержащем 20 - 35% ацетона при молярном соотношении носителя к активированному производному 1:12-1:18.