Способ определения диеновых конъюгатов в биологическом материале Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения интенсивности свободнорадикаль- ного окисления липидов в биологическом материале

Цель изобретения - повышение чувствительности при одновременном ускорении способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Биологический материал в объеме 0,2 мл помещают в пробирку с плотно фиксируемой пробкой, добавляют 4 мл гептан-пропанольной смеси (1:1) и 1 мл раствора НСЈ с рН 1-2, закрывают пробкой, интенсивно встряхивают 3- 3,5 мин, затем добавляют 1 мл 4%-но- го раствора додецилсульфата натрия (из расчета 2,5-4:1 к белку пробы по весу) и 2 мл гептана, встряхивают 0,5-1 мин. Через 10 мин после расслоения смеси отбирают верхний гептано-

вый слой и измеряют оптическую плотность при 233 нм.

Содержание диеновых конъюгатов жирных кислот (ЖК) выражают в величинах оптической плотности при 233 нм на 1 мл плазмы крови, 1 мл эритроцитов, 1 г ткани..

Пример 1„ Определено содержание диеновых конъюгатов ЖК в плазме и эритроцитах крови здорового мужчины С., 35 лет. Диеновые конъю - гаты плазмы крови 3,30 ( плазмы); диенконъюгаты эритроцитов 2,48 (йДй5з/мл эритроцитов).

Пример 2. Определено содержание диеновых конъюгатов в плазме и эротрицитах крови у больного Р., мужчины 46 лето Диагноз: ишемическая болезнь сердца. Стенокардия напряжения, Атеросклеротический кардиосклероз. Атеросклероз аорты, коронарных артерий. Нр. Желудочковая экстрасистолия.

4ь 00 СО О5 OS

Диенконъюгаты плазмы крови 6,00 ( Д Д«гзз/мл плазмы); диеновые конъюга- ты эритроцитов 4,80 ( Д Д2Э5/мл эритроцитов).

Пример 3 о Исследована динамика содержания диеновых конъюгатов в интактной митохондриальной фракции печени крысы и фракции митохондрий, инкубированной при 37°С в присутстви 0,1 мм ГеО, что приводило к активации СПОЛ в начале инкубации, а через 10 мин к его торможению (табл01)0

В табл.2 представлены данные, характеризующие рабочий диапазон экстракции диеновых конъюгатов жирных кислот в зависимости от нарастающего соотношения додецилсульфата натрия (ДЦ8-Ка) к белку плазмы крови в мг.

Как видно из табл02, максимальная экстракция диеновых конъюгатов Ж наступает при соотношении flflS-Na/белок 3,5:1, но в пределах 2,5:1-4,5,1. Определение диеновых конъюгатов достоверно не отличается от условий максимальной экстракции

В предложенном способе определения содержания диеновых конъюгатов жирных кислот в биологических тканях чувствительность по сравнению с прототипом возросла более чем в 3 раза (на 35% за счет добавления раствора НСЈ в геп

0

5

0

тан-изопропаноловую смесь до экстракции и на 285% за счет введения в смесь после экстракции 4%-ного раствора ДД5).

Предлагаемый способ обеспечивает высокую чувствительность, хорошую воспроизводимость, а также быстр и

прост в осуществлении i

Способ может быть использован в научных, экспериментальных, биохимических и клинических исследованиях.

Формула изобретения

Способ определения диеновых конъюгатов в биологическом материале пу- тем добавления к исследуемой пробе гептан-изопропанольной смеси, соляной кислоты, гептана для расслоения фаз, встряхивания с последующим спектрофотометрированием гептановой фазы при 233 нм, отличающий- с я тем, что, с целью повышения чувствительности при одновременном ускорении способа, соляную кислоту добавляют одновременно с гептанизо- пропанольной смесью, встряхивают, затем дополнительно добавляют раствор додецилсульфата натрия, который вносят вместе с гептаном, при этом додецилсульфат натрия используют в соотношении (2,5-4,0): к белку пробы,

Таблица 1

Изобретение относится к способам определения продуктов перекисного окисления липидов, а именно к способам определения первичных продуктов липопереокисления - диеновых конъюгатов полиненасыщенных высших жирных кислот /ацилгидроперекисей липидов/. С целью повышения чувствительности и упрощения способа проводится экстракция жирных кислот гептан - изопропанольной смесью в присутствии раствора соляной кислоты, которая осуществляется в течении 3-3,5 мин, а после завершения экстракции в смесь вносят 6%-ный раствор додецилсульфата натрия в соотношении 2,5:1 - 4,0:1 к белку исследуемого биологического материала. 2 табл.

Диеновые конъюга- ты ЖК ДДе„

2,28 5,86 9,07 6,01 3,95

Среднее арифметическое пяти параллельных опытов

Таблица 2