Способ определения содержания гидроперекисей липидов в плазме крови Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

00

о

4 Изобретение относится к медицине а именно к клинической биохимии, Известен способ определения концентрации гидроперекисей липидов в биологических тканях, основанный на perHCTpani и ультрафиолетового (УФ) поглощения липидных экстрактов в области 232-234 нм, которое соответ ствует интеноивному максимуму погло щения коньюгированных диеновых стру тур полкненасыщенных гидроперекисей липидов 1. Однако данный метод довольно тру доемок и предназначен для научных исследований, где необходима максимально возможная экстрекция гидропе рекисей липидов. Реализация способа требует сложного биохимического обо рудования: специальной химической посуды,- роторного испарителя или системы для упаривания в токе инерт ногО газа Наиболее близким к пpeдлaгaeмoгvfy является способ определения гидроперекисей липидов в биологических тканях,- согласно которому к 1 г ткани или 1 мл плазмы крови добавляют 10 мл гептан-изопропанольной смеси. Полученную смесь встряхивают центрифугируют и отбирают супернатанто К супернатанту добавляют 1/10 объемную часть воды и после расслаи вания гептан-в одио-изопропанольной смеси отбирают гептановый слой.Концентрацию гидроперекисей определяют по поглощению в гептановой о ракции. Этот способ более прост,- так исключает дополнительную операцию п ревода липидов из хлороформ-метанол него экстракта :з гептан-метанольную фазу и не требует биохимического оборудования для упаривания липидных экстрактов 2.. Однако способ П.пацера имеет ряд существенных нел;ос гатков ; требует большого количества плазмы 1(роБИ; экстракция гиддроперекисай липидов происходит не полностью; при разделении фаз после добавления ВОДЕЛ к гептак-изопропанольному раствору липидов наблюдается образование мутной водно-изопропанольной фазы (в ряде случаев слабая мутность регистрирует ся и в гептанозом слое). Кроме того метод включает много операций. Целью изобретения является повыше ние чувствительнос-ги и ускорение спо С оба. Указанная цель достигается тем. что согласно способу определения содержания гидроперекисей липидов в плазме крови путем экстракции их гептан-изопропакольной смесью с последующим измерением оптической плот ности гептановой фракции в диапазоне 232-234 HMf к образцу плазмь: крови добавляют 15-25-краткое количество гептан-изопропанольной смеси в соотношении 1:1, а после экстракции в смесь вносят 1/10-1/7 объемную часть раствора соляной кислоты при рН 1- 2 К 0,2 мл плазмы крови, содержащей 1 мг,/мл ЭДТА в качестве антикоагулянта и антиоксиданта, добавляют 4 МП гептан-изопропанольной смеси (1:1). Интенсивно встряхивают в течение 5-10 мин. Определено, что это время достаточно для полной экстракции гидроперекисей липидов предлагаемым способом. Затем добавляют 1 мл раствора НСе с рН 1-2 и 2 мл гептана. Встряхивают 30-60 с. После расслоения гептан-водно-изопропанольной смеси не менее чем через 20 мин отстаивания образца отбирают гептановый слой и измеряют оптическую плотность при 233 нм (Д233 рийном спектрофотометре. В качестве контрольной пробы используют образец, содержащий вместо плазмы 0,2 мл воды и подвергнутый всем перечисленным процедурам. Величина Д235 обусловленная содержанием гидроперекисей липидов, равна разности между значениями Дтаоопытной и контрольной проб , яроперекис1л липидов) (опыт) - Д 25,(контроль) . Пример 1. Обследован практически здоровый мужчина С., 50 лет, направленный на профилактический осмотр в рамках эпидемиолргического кардкологическогО обследования. После исследования плазмЕл крови предлаiraetvibD-i способом получено значение Д2эз-0,09 или Д233/МЛ 184. Пример 2, Больной К., 46 лет, поступил в клинику с диагнозом хроническая ишемическая болезнь сердца,- стенокардия напря;кения, атеросклероз аорты и венечных артерий сердца. После обследования больного предлагаемым способом получено значение Д . или Д /мл - 3 f ,1 , Всего предлагаег ым способом было обследовано 10 здоровых и 12 больных хронической ишемической болезнью сердца (ИБС) мужчин в возрасте 40 59 л ет . В норме среднее значение концентрации гидроперекисей липидов в плазме крови бьмо равно Д„, /мл 1,42 + OfSO, ay больных ИБС этот показатель был в 1,4 раза выше и равнялся Ц2зз/ 2,05+0,60. Увеличение степени экстракции гидроперекисей липидов в основном зависит от величины рН водной фазы и максимально в диапазоне рН 1-2, в котором экстракция гидроперекисей .пипидов на 45-55 выше исходного уровня (таблица) , рН ВОДНОЙ фазы 17 I бГз Д-зз гептанового экстракта0,095 0,112 0,11 «232 0002 п/п я, 100 118 118 . Предлагаемый icnocne может применяться при массовых клинических Ю исследованиях при изучении заболеваНИИ, сопровождающихся повьаиением интенсивности перекисного окисления липидов. Предлагаемый способ определения гидроперекисей липидов в плазме крови по сравнению с сушествукицим способом Плацера имеет следующие преиму15Г 4 з1 fl Т 0,9 2 0,112 0,125 0,145 ОД40 0,139 118 132 153 147 146 щества: требует в 5 раз меньшее количество плазмы крови; упрощает исследование, так как не нуждается в использовании центрифугирования; улучшает разделение гептанрвой и водно-изопропанольной фаз и увеличивает экстракцию гидропец екисей липидов по сравнению с известным {Методом за счет относительного увеличения объема экстрагирукнцей смеси и изменения рН водной фазы.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГИДРОПЕРЕКИСЕЙ ЛИПИДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ путем экстракции их гептанизопрогганольной смесью с последующим измерением оптической плотности гептановой фракции в диапазоне 232234 им, отличающийс я тем, что, с целью повышения чувствитель ности и ускорения способа, к образцу плазмы крови добавляют 15-25-кратное количество гептан-изопропанЬльной смеси в соотношении 1:1, а после экстракции в смесь вносят 1/10-1/7 объемную часть раствора соляной кислоты при рН 1-2.