Способ определения гидроперекисей липидов в крови Советский патент 1990 года по МПК G01N33/52 G01N33/92 

W

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано в научных исследованиях. Цель изобретения - повышение точности способа. Способ заключается в обработке плазмы и эритроцитов антиоксидантом ионолом, треххлористым железом, тиобарбитуровой кислотой и додецилсульфатом натрия в 0,44 М солянокислом буфере PH 3,6. Проводят инкубацию в течение 30-60 мин при 90-92°С, затем экстрагируют окрашенное соединение смесью ледяной уксусной кислоты и хлороформа и определяют оптическую плотность при 532-534 нм. Способ обеспечивает повышение точности способа за счет образования стабильного окрашенного комплекса гидроперекисей с тиобарбитуровой кислотой.

Изобретение относится к клинической биохимиии и может быть использовано в медико-биологических исследованиях.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут 3 - 5 мл крови из вены в предварительно охлажденные флако нчики, содержащие 3-5 капель 6% - ного раствора этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА). Отделяют плазму от эритроцитов путем центрифугирования (при количестве оборотов, равном 1000 об./мин) в течение 5 мин. Проводят З-кратную промывку эритроцитов охлажденным физиологическим раствором, разводят тем же раствором до получения 25%-ной суспензии.

Берут 0,5 плазмы крови и обрабатывают ее путем добавления 0,1 мл 1%-ного спиртового раствора антиоксиданта ионо- ла, 0,1 мл 0,27%-ного спиртового раствора

греххлористого железа. 1,1 мл глицин-солянокислого буфера (1 М, рН 3,6 мл тиобарбитуровой кислоты (ТЕК) (500 мг/100 мл) в додецилсульфате натрия (300 мг/мл). Берут 0,1 мл 25%-ной суспензии эритроцитов и обрабатывают их путем добавления 0,1 мл 1 %-ного спиртового раствора ионола, 0,1 мл 0,27%-ного раствора хлористого железа, 1,5 мл глицин-солянокислого буфера (рН 3,6) и 1.5 мл ТБК, Приготавливают контрольную пробу для плазмы путем использования 0.5 мл физиологического раствора и всех необходимых указанных компонентов. Приготавливают контрольную пробу для эритроцитов путем использования 0,1 мл физиологического раствора и всех указанных компонентов.

Инкубируют опытные и контрольные пробы в термобане при 90-92° С в течение 30-60 минут. Охлаждают опытные и контрольные пробы в ледяной бане. Проводят экстракцию гидроперекисей липидов в

о о

00 N Ю Ю

опытных пробах путём добавления 1 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл хлороформа в каждую пробу - опытную и контрольную.

Центрифугируют все пробы при 3000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают верхний окрашенный слой для спектрофо- тометрическай оценки интенсивности окраски опытных проб. Определяют гидроперекиси липидов по интенсивности окраски опытных проб относительно контрольных по величине оптической плотности Е при длине волны 532-535 нм на спектрофотометре типа СФ - 26.

Определяют в опытных пробах (в эритроцитах и плазме крови)содержание белка по Лоури. Рассчитывают содержание гидроперекисей липидов (ЭГП) для каждой опытной пробы, т.е. вэритроцитахи плазме, поформуле

::

Б- 1,56-10 S

где ГП - содержание гидроперекисей липидов, нмоль/мг белка;

Е - величина оптической плотности: Б - содержание белка в эритроцитах и плазме, мг/мл;

В табл. 1 и 2 представлены данные конкретного эксперимента.

Зависимость содержания гидроперекисей в плазме крови от режима инкуба- .ции (температурный режим)

Примечания: 10;

- остальные условия определения: 0,1 мл плазмы: использован 1 М глмцин-солянокислый буферу конечная концентрация 0,44 м; иТчкубацию осуществляли в течение бОмин.

-сравнение с 1 группой; Р 0,05:

- сравнение с 3 группой; Р 0,05.

Из таблицы следует, что оптимальный режим инкубации 90-92° С, при нем достигается увеличение интенсивности окраски на 43 и 47% соответственно.

Таким образом, продолжительность инкубации - существенный фактор при выбранном температурном режиме.

Для реализации предлагаемого способа можно использовать эритроциты и плазму в количестве 0,05 - 0,1 мл.

Изобретение позволяет повысить точность исследования за счет создания оптимальных условий реакции гидроперекисей с ТЕК.

Формула изобретения

Способ определения гидроперекисей липидов в крови путем инкубации проб эритроцитов и плазмы в присутствии анти- оксиданта, солей железа, додецилсульфата натрия, глицин-солянокислого буфера с последующей обработкой тиобарбитуровой кислотой, экстрагированием окрашенного продукта смесью уксусной кислоты и хлороформа и спектрофотометрированием, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве антиоксиданта используютионол, инкубацию проводят при 90-92° С в течение 30-60 мин при концентрации буфера 0,44 М. .

Т а б л и ц а 1

Зависимость содержания гидропероксидов в плазме крови от времени инкубации

от 5 до 10;

-инкубационная смесь кроме прочих ингредиентов содержит 0,1 мл плазмы и 1,5 мл 1 М глицин-солянокислого буфера; температурный режим -90°С; -Р 0.001.

Таблица2