РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PUR2N, КОДИРУЮЩАЯ КОРОТКУЮ ФОРМУ БЕЛКА NS1 ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ Советский патент 1996 года по МПК C12N15/33 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и может найти применение в микробиологической промышленности и медицине для разработки высокоэффективных профилактических и диагностических средств борьбы против вируса клещевого энцефалита.

Целью изобретения является конструирование рекомбинантной ДНК, кодирующей короткую форму белка NS1 ВКЭ. Получена плазмидная ДНК puR2N, кодирующая синтез короткой формы белка NS1 ВКЭ, которая имеет размер 7431 п.н. и состоит из следующих элементов: EcoRl-EcoRl фрагмента плазмиды puR290 размером 5,1 т.п.н. EcoRl-Clal фрагмента плазмиды pBR327 размером 27 п.н. Clal-Clal - синтетического фрагмента ДНК размером 21 п.н. содержащего терминирующий кодон, бактериальный участок связывания с рибосомами и инициирующий кодон; - Sall-Alul (3521) фрагмента плазмиды puC18SE размером 1074 р.н. содержащего кодирующую последовательность гена короткой формы белка NSl ВКЭ; Alul-Sall (3521) -фрагмента плазмиды puC18SE размером 1074 р.н. Alul-конец которого заменен на липкий EcoRl-конец, содержащего кодирующую последовательность гена короткой формы белка NS1 ВКЭ; -Clal-Sall-синтетического фрагмента ДНК размером 21 п.н. Clal-конец которого достроен фрагментом Кленова ДНК-полимеразы IE.соli, содержащего терминирующий кодон, бактериальный участок связывания с рибосомами и инициирующий кодон; EcoRl-ВаmHl-синтетического фрагмента ДНК размером 9 п.н. содержащего терминирующий кодон; BamHl-EcoRl-фpaгмента полилинкера плазмиды pTTQ18 размером 21 п.н. EcoRl-Hind lll-фрагмента полилинкера плазмиды pTTQ18 размером 52 п. н. Hind lll-EcoRl-фpaгмента плазмиды puC18SE размером 26 п.н. фрагменты содержат следующие сайты рестрикции: один участок расщепления рестриктазы Hind lll; один участок расщепления рестриктаэы Pst l, расположенный на расстоянии 7419 п.н. по часовой стрелке от единственного Hind lll-сайта; два участка расщепления рестриктазы BamHl, расположенные на расстоянии 7354 п.н. и 7400 п.н. по часовой стрелке от Hind lll-сайта; три участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенные на расстоянии 26 п.н. и 7379 п.н. по часовой стрелке от Hind lll-сайта; три участка расщепления рестриктазы Sall, расположенные на расстоянии 5174 п.н. 6271 п. н. и 7413 п.н. по часовой стрелке от Hind lll-сайта; фрагменты содержат следующие гены и регуляторные участки; -bla-ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, расположенный в участке от 0,5 до 1,4 т.п.н. по часовой стрелке от Hind lll-сайта; промотор plaс и неполный ген β-галактозидазы E.coll, расположенные в участке от 2,06 до 5,1 т.п.н. вправо от Hind lll-сайта; две копии гена короткой формы белка NSl ВКЭ, расположенные в участках от 5153 до 6227 п.н. и от 6227 до 7333 п.н. вправо от Hind lll-сайта, каждая из которых имеет собственный бактериальный участок связывания с рибосомами и инициирующий кодой; молекулярная масса рекомбинантной плазмиды ДНК равна 4,9 МДа.

П р и м е р 1. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК puR2N.

30 мкг плазмидной ДНК puC18SE расщепляют последовательно сначала рестриктазой Sall в реакционной смеси, содержащей 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgCl₂, 150 мМ NaCl, 6 мМ b-меркаптоэтанола, 60 ед.рестриктазы Sall, а затем рестриктазой EcoRl в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 60 ед.рестриктазы EcoRl, в объеме 60 мкл при 37^oС в течение 1 часа. Фрагмент ДНК размером 1250 п.н. включающий полную кодирующую последовательность гена NS1 ВКЭ, выделяют после электрофореза в ПААГ методом злектроэлюции из геля. Полученный ДНК-фрагмент (10 мкг) подвергают гидролизу рестриктазой Bgll в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl, 20 ед. рестриктазы Bgll, в объеме 200 мкл при 37^oС в течение 1 часа и выделяют через ПААГ фрагменты Sall- Bgll (3190) длиной 743 п.н. и Bgll (3190)-EcoRl длиной 507 п.н. 4 мкг фрагмента Bgll (3190)- EcoRl гидролизуют рестриктазой Alul в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl, 6 мМ b-меркаптоэтанола, 10 ед.рестриктазы Alul, в объеме 80 мкл при 37^oС в течение 1 часа и выделяют Bgll(3190)-Alul(3521)-фрагмент длиной 331 п.н.

Sall-EcoRl-векторную часть плазмиды pTTQ18 с "затупленным" EcoRl-концом готовят следующим образом. 5 мкг плазмидной ДНК pTTQ18 расщепляют рестриктазой EcoRl в объеме 100 мкл. Липкие EcoRl-концы достраивают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы IЕ.соll в реакционной смеси, содержащей 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MqCl₂, 0,05 мМ MdATP,0,05 мМ dTTP, 20 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы l Е.соll, в объеме 100 мкл при комнатной температуре в течение 5 мин. Обработанную таким образом ДНК гидролизуют рестриктазой Sall в объеме 100 мкл и очищают в ПААГ.

1 мкг суммарной ДНК, состоящей из эквимолярного количества фрагментов Sall- Bgll(3190), Bgll(3190)-Alul(3521) и векторной части плазмиды pTTQ18, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в растворе 20 мМ трисHCl, рН 8,0, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ b-меркаптоэтанола, 0,5 мМ АТР (10 ед.ДНК-лигазы) в объеме 20 мкл при 5^oС в течение 5 часов. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.coll DМ15, полученные методом обработки CaCl₂.

Клетки реципиентного штамма E.coll DМ15 растят на качалке в 5 мл LB-среды (10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl на 1 л H₂O) при 37^oС. "Ночной культурой" заражают 100 мл LB-среды. Инокулят подращивают до плотности клеток в среде 0,6 о.е. при 550 нм и центрифугируют при 7000 об/мин, 0^oС 10 мин. Осадок переносят в ледяную баню и суспендируют в 50 мл стерильного холодного раствора: 0,01 М трис-HCl, рН8,0, 0,05 М CaCl₂. Через 20 мин клетки осаждают и суспендируют в 5 мл указанного раствора. Через 30 мин инкубации в ледяной бане реципиентные клетки считаются подготовленными к трансформации их плазмидной ДНК.

К 0,2 мл суспензии клеток добавляют 10 мкл лигазной смеси, последовательно инкубируют в течение 25 мин в ледяной бане, 2 мин при 42^oС и 10 мин при комнатной температуре, в пробирку добавляют 1 мл LB- среды и подращивают культуру при 37^oС в течение 1 часа.

Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина, в течение ночи при 37^oС.

Клоны анализируют при помощи рестриктного анализа и отбирают плазмиду рТ18 SAR, из которой гидролизом выщепляют Dаll-EcoRl-фpaгмент ДНК длиной 1074 п.н. содержащий полную кодирующую последовательность гена короткой формы белка NS1 ВКЭ.

5 мкг плазмидной ДНК pTTQ18 расщепляют последовательно сначала рестриктазой BamHlI в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgCl₂, 150 мМ NaCl, 10 ед. рестриктазы BamHl, в объеме 100 мкл при 37^oС в течение 1 часа, а затем рестриктазой Sall в условиях, описанных выше. Обработанную таким образом ДНК очищают в ПААГ.

Для введения терминирующего кодона в конец кодирующей последовательности гена используют EcoRl-ВаmHl-синтетический фрагмент ДНК, имеющий следующую структуру: .

1 мкг суммарной ДНК, состоящей из эквимолярного количества выделенного Sall-EcoRl-фpaгмента (1074 п. н. ), синтетического EcoRl-ВаmHl-фрагмента и Sall- BamHl-векторной части плазмиды pTTQ18, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в условиях, описанных выше. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.coll Δ М 15.

Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина, в течение ночи при 37^oС. Клоны, содержащие искомый фрагмент, идентифицируют методом ДНК-ДНК-гибридизации и положительные по гибридизации клоны анализируют при помощи рестриктного анализа. В результате отбирают плазмиду рТ18 SB, из которой гидролизом выщепляют Sall- BamHl-фрагмент ДНК размером 1083 п.н. содержащий кодирующую последовательность гена короткой формы белка NS1 ВКЭ, оканчивающуюся терминирующим кодоном.

5 мкг плазмидной ДНК puC18SE расщепляют последовательно рестриктазами Sall и EcoRl в условиях, описанных выше, и выделяют Sall-EcoRl-фpaгмент ДНК размером 1250 п.н. содержащий кодирующую последовательность гена полноразмерной формы белка NS1 ВКЭ, оканчивающуюся терминирующим кодоном. Аналогично из плазмидной ДНК pТ18SB выделяют Sall-EcoRl-фpaгмент ДНК размером 1104 п.н. содержащий кодирующую последовательность гена короткой формы белка NS1 ВКЭ.

10 мкг плазмидной ДНК рВR327 гидролизуют последовательно сначала рестриктазой Pstl (20 ед. ) в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, в объеме 200 мкл при 37^oC в течение 1 часа, а затем рестриктазой Cla l (20 ед.) в буфере, содержащем 20 мМ трис-НCl, рН 8,0, 10 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl, в объеме 200 мкл при 37^oС в течение 1 часа и выделяют фрагмент плазмиды pBR327 размером 777 п.н.

Аналогично из 10 мкг плазмидной ДНК pBR327 выделяют PstI-EcoRl-фpaгмент плазмиды pBR327 размером 2521 п.н.

Для введения в 5_'-концевую область генов регуляторных элементов, необходимых для их экспрессии в бактериальных клетках, используют синтетический Clal-Sall- фрагмент ДНК, имеющий структуру: .

1 мкг ДНК, состоящей из эквимолярного количества выделенных Sall-EcoRl-фрагмента плазмиды puC18SE длиной 1250 п.н. Сlal-Pstl- и Pstl-ЕсоRl-фрагментов плазмиды pBR327 и синтетического Clal-Sall-фрагмента ДНК, лигируют ДНК-лигазой фага Т4. Лигазной смесью трансформируют клетки E.coll.

Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина, в течение ночи при 37^oС. Клоны, содержащие искомый фрагмент, отыскивают методом ДНК-ДНК-гибридизации, анализируют при помощи рестриктного анализа, отбирают плазмиду pBR327 NS1, которая содержит ген полноразмерной формы белка NS1 ВКЭ, пригодный для экспрессии в бактериальных клетках и фланкированный сайтами расщепления рестриктаз EcoRl и Сlаl.

1 мкг ДНК, состоящей из эквимолярного количества Sall-ЕсоRl-фрагмента плазмиды pT18SB длиной 1104 п.н. Сlal-Pstl-и Pstl- EcoRl-фрагментов плазмиды pBR327 и синтетического Clal-Ваll-фрагмента ДНК, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в условиях, описанных выше. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coll Δ М15, приготовленные методом обработки CaCl₂.

Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина, в течение ночи при 37^oС. Клоны, содержащие искомый фрагмент, отбирают при помощи ДНК-ДНК-гибридизации и рестриктного анализа. В результате отбирают плазмиду pBR327N, которая содержит ген короткой формы белка NS1 ВКЭ, пригодный для экспрессии в бактериальных клетках и фланкированный сайтами расщепления рестриктаз EcoRl и Clal.

Правильность сборки плазмидных ДНК pBR327 NS1 и pBR327N подтверждают определением их нуклеотидной последовательности в районах, прилегающих EcoRl-сайтами, методом Максама-Гилберта.

5 мкг плазмидной ДНК pBR327 NS1 гидролизуют рестриктазой EcoRl и выделяют EcoRl-фрагмент размером 1298 п.н. содержащий полноразмерный ген NS1 ВКЭ.

5 мкг ДНК векторной плазмиды puR290 гидролизуют рестриктазой EcoRl и выделяют большой EcoRl-фрагмент.

1 мкг ДНК, состоящей из эквимолярного количества EcoRl-фрагмента плазмиды pBR327 NS1 (1298 п.н.) и большого EcoRl- фрагмента векторной плазмиды puR290, обрабатывают ДНК-лигатурой фага Т4. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е-соll DМ15. Трансформанты выращивают на средах, содержащих 50 мг/л ампициллина, в течение ночи при 37^oС.

Клоны, содержащие искомый фрагмент в прямой ориентации относительно промотора plac, отыскивают при помощи ДНК-ДНК-гибридизации и рестриктного анализа. В результате отбирают плазмиду puR290 NS1.

5 мкг плазмидной ДНК pBR327N гидролизуют рестриктазой Clal. Образовавшиеся липкие концы достраивают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I. Обработанную таким образом ДНК расщепляют рестриктазой EcoRl и выделяют Clal-EcoRl-фрагмент с достроенным Clal-концом размером 1125 п.н. содержащий ген короткой формы белка NS1 ВКЭ.

10 мкг плазмидной ДНК pTTQ18 расщепляют последовательно рестриктазами Hind lll и EcoRl в условиях, описанных выше, и выделяют в 20%-ном ПААГ Hind lll- EcoRl-полилинкерный фрагмент размером 52 п.н.

5 мкг плазмидной ДНК puR290 NS1 расщепляют рекстриктазами Sall и Hind lll в условиях, описанных выше, и выделяют большой Sall-Hind lll-фрагмент размером 5274 п.н.

1 мкг суммарной ДНК, состоящей из эквимолярного количества SalI-Bgll(3190)- и Bgll(3190)-Аlul(3521)-фрагментов плазмиды puC18SE (выделение этих фрагментов см.выше), Clal-EcoRl-фpaгмента плазмиды pBR327N с "затупленным" Clal-концом, Hind lll-ЕсоRl-полилинкерного фрагмента плазмиды рТТQ18 и большего Sall-Hind lll- фрагмента плазмиды puR290 NS1, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в описанных условиях. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е соll DМ15.

Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина, в течение ночи при 37^oС. Клоны, содержащие искомый фрагмент идентифицируют методом ДНК-ДНК-гибридизации и положительные по гибридизации клоны анализируют при помощи рестриктного анализа. Отбирают целевую рекомбинантную плазмидную ДНК puR2N, в которой осуществлена дупликация гена короткой формы белка NS1 ВКЭ. Его экспрессия в клетках Е.соll в составе полицистронных мРНК с сопряженной системой трансляции контролируется бактериальным промотором plac.

П р и м е р 2. Экспрессия короткой формы белка NS1 ВКЭ в клетках Е.соll DМ15 (puR2N).

Клетки Е.соll DМ15, трансформированные плазмидмой ДНК puR2N, выращивают при 37^oС в LB-среде в присутствии ампициллина (50 мг/л) до оптической плотности 0,6 о. е. при 650 мм, а затем индуцируют plac-промотор добавлением в среду изопропил-b-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до 1 мМ, продолжают инкубацию, отбирая аликвоты клеточной суспензии для анализа. Лизаты отобранных проб исследуют на появление в клетках белкового продукта с молекулярным весом 42 кДа при помощи диск-электрофореза в 10%-ном ПААГ. Подвижность белков в геле контролируют положением маркеров. В результате в клетках Е.соll D М15 (puR2N) фиксируют эффективный синтез белка с молекулярным весом (42 кДа) в условиях индукции промотора plac. При индукции plac-промотора наблюдают также синтез протеина с молекулярным весом 113 кДа, соответствующего неполному белку b -галактозидазы, который кодируется в векторной части плазмиды puR2N.

Наличие характерной для белка NS1 ВКЭ полипептидной последовательности показывают при помощи иммуноферментного анализа с использованием в качестве NS1-специфичных антител поликлональной асцитной жидкости мышей, иммунизированных суммарным антигеном ВКЭ. В качестве ферментной метки, связывающейся с комплексом АГ-АТ, используют конъюгат белок А-пероксидаза хрена. В результате регистрируют эффективное связывание антител только с полученной короткой формой белка NS1 ВКЭ и минорными продуктами ее частичного протеолиза в клетках Е.соli.

Аналогичный эксперимент проводят с использованием панели моноклональных антител против белка NS1 ВКЭ. В результате регистрируют также эффективное связывание всех моноклональных антител только с короткой формой белка NS1. Это доказывает антигенную специфичность полученного продукта и свидетельствует, что синтезирующийся в бактериальных клетках белок NS1 ВКЭ обладает по крайней мере частью антигенных детерминант вирусного белка. Уровень синтеза короткой формы белка NS1 ВКЭ в клетках Е.соll DМ15(puR2N) составляет 25 мг/1 л культуры.

Таким образом, получена плазмидная ДНК puR2N, обуславливающая синтез короткой формы белка NS1 ВКЭ в трансформированных ею клетках Е.соll.

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и может найти применение в микробиологической промышленности и медицине для разработки высокоэффективных профилактических и диагностических средств борьбы против вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Целью изобретения является конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей короткую форму белка NS1 ВКЭ. Рекомбинантная плазмидная ДНК puR2N, в которой осуществлена дупликация гена короткой формы белка NS1 ВКЭ, кодирует в клетках Е.соll синтез короткой формы белка NS1 ВКЭ. ДНК puR2N сконструирована на основе большого EcoRl-фрагмента векторной плазмиды puR290 размером 5,1 т.п.н., Sall-Alul (3521)-фрагмента плазмиды puC18SE, содержащего кодирующую последовательность гена короткой формы белка NSl ВКЭ, и двух синтетических фрагментов ДНК размером 21 и 9 п.н. соответственно. 2 с.п.ф-лы.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК puR2N, кодирующая короткую форму белка NS1 вируса клещевого энцефалита размером 7431 п.н. содержащая:
-EcoRI-фрагмент плазмиды puR290 размером 5,1 т.п.н.

-Clal-Sall-синтетический фрагмент ДЕК размером 21 п.н. с последовательностью

-Sall-Alul-фрагмент плазмиды puC18SE размером 1074 п.н. с кодирующей последовательностью гена короткой формы белка NS1 BKЭ;
-Clal-Sall-синтетический фрагмент ДНК размером 21 п.н. с последовательностью нуклеотидов

-Sall-Alul-фрагмент плазмиды С18SЕ размером 1074 п.н.

EcoRI-BamHI-синтетический фрагмент ДНК размером 9 п.н. с последовательностью нуклеотидов

-BamHI-EcoRI-фрагмент полилинкера плазмиды pTTQ18 размером 21 п.н.

-EcoRI-Hind III-фрагмент полилинкера плазмиды pTTQ18 размером 52 п.н.

Hind III-EcoRI-фрагмент плазмиды puС18SЕ размером 26 п.н.

один участок расщепления рестриктазы Hind III;
один участок расщепления рестриктазы Pstl, расположенный на расстоянии 7419 п.н. по часовой стрелке от Hind III-сайта;
два участка расщепления рестриктазы BamHI, расположенные на расстоянии 7354 и 7400 п.н. по часовой стрелке от Hind III-сайта;
три участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенные на расстоянии 26,5126 и 7379 п.н. по часовой стрелке от Hind III-сайта;
три участка расщепления рестриктазы Sall, расположенные на расстоянии 5174, 6271, 7413 п.н. по часовой стрелке от Hind III-сайта;
генетические маркеры;
bla-ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, расположенный в участке от 0,5 до 1,4 т.п.н. по часовой стрелке от Hind III-сайта;
промотор plac и неполный ген бета-галактозидазы Е.соli, расположенные в участке от 2,06 до 5,1 т.п.н. вправо от Hind III-сайта;
две копии гена короткой формы белка NS1 ВКЭ, расположенные в участках от 5153 до 6227 п.н. и от 6227 до 7333 п.н. вправо от Hind III-сайта, каждая из которых имеет собственный бактериальный участок связывания с рибосомами и инициирующий кодон.

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК puR2N, заключающийся в том, что плазмидную ДНК puC18SE расщепляют рестриктазами Sall и EcoRi и выделяют Sall-EcoRi-фрагмент размером 1250 п.н. гидролизуют его рестриктазой Bgll и выделяют фрагменты Sall-Bgll размером 743 р.н. и Bgll-EcoRI размером 507 п.н. Bgll-EcoRl-фрагмент расщепляют рестриктазой Alul и выделяют Bgll-Alul-фрагмент, Sall-Bgll и Bgll-Аlul-фрагменты плазмиды puC18SE сшивают ДНК-лигазой фага Т4 с Sall-EcoRI-векторной частью плазмиды pTTQ18, EcoRI-конец которой достраивают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I Е.соll, лигазной смесью трансформируют клетки Е.со11, отбирают клоны, несущие плазмидную ДНК pT18SAR, из которой гидролизом рестриктазами Sall и EcoRI выщепляют Sall-EcoRI-фрагмент размером 1074 п.н. который сшивают с Sall- ВаmНI-векторной частью плазмиды pTTQ18 и синтетическим фрагментом ДНК, имеющим структуру:

лигазной смесью трансформируют клетки Е.соll, отбирают клоны, содержащие плазмидную ДНК pT18SB, из которой выщепляют Sall-EcoRI-фрагмент размером 1104 р.н. полученный фрагмент сшивают с Clal-Pstl- и Pstl-EcoRI-фрагментами плазмидной ДНК pBR327 размером 777 и 2521 п.н. соответственно и синтетическим Clal-Sall-фрагментом ДНК, имеющим структуру:

лигазной смесью трансформируют клетки Е.соll и отбирают клоны, несущие плазмидную ДНК pBR327N, Sall-EcoRI-фрагмент плазмиды puC18SE размером 1250 п.н. сшивают с Clal-Pstl и Pstl-EcoRI-фрагментами плазмиды pBR327 и ClalSali-синтетическим фрагментом, получают плазмидную ДНК pBR327 NS1, из которой выделяют EcoRI-EcoRI-фрагмент размером 1298 р.н. полученный фрагмент реклонируют по сайтам EcoRI в векторную плазмиду puR290 в прямой ориентации относительно промотора plac, получают плазмидную ДНК puR290 NS1, плазмидную ДНК pBR327 N гидролизуют рестриктазой Clal, достраивают липкие концы фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I Е.со11, расщепляют рестриктазой EcoRI, выделяют Clal-EcoRI-фрагмент размером 1125 р.н. с "затупленным" Clal-концом, который сшивают с большим Sall-Hind III-фрагментом плазмиды puR290 NSI, Hind Ill-полилинкерным фрагментом плазмиды pTTQ18 размером 52 п.н. и полученными ранее Sall-Bgll и Bgll-Alul-фрагментами плазмиды puC18SE, лигазной смесью трансформируют клетки E.coll, среди трансформантов отбирают клоны, содержащие целевую плазмидную ДНК puR2N.