РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PVH64, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ КАРТИРОВАНИЯ ГЕНОВ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ШТАММА ЛИВП И ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ВСТРОЙКИ ЧУЖЕРОДНОЙ ИНФОРМАЦИИ В ГЕНОМ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ, И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ Советский патент 1994 года по МПК C12N15/39 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую Hind III-P-фрагмент генома вируса осповакцины штамма ЛИВП, которая может быть использована для картирования генов белков этого вируса, в качестве молекулярного зонда для выявления присутствия генетического материала любых ортопоксвирусов, как донор вирусных генов для получения бактериальных продуктов вирусных белков, а также в качестве вектора для направленной встройки чужеродной генетической информации в геном осповакцины с целью получения живых вакцин на основе этого вируса.

Целью изобретения является клонирование ранее на исследованного Hind III-P фрагмента ДНК вируса осповакцины штамма ЛИВП в составе новой рекомбинантной плазмидной ДНК, которая может быть использована для картирования вирусных генов, как донор генов для получения бактериальных продуцентов вирусных белков, в качестве молекулярного зонда для обнаружения генетического материала любых ортопоксвирусов, а также как вектор для направленной встройки чужеродной ДНК в геном вируса осповакцины.

Сконструирована новая рекомбинантная плазмидная ДНК pVH 64, которая содержит Hind III-P-фрагмент ДНК вируса осповакцины штамма ЛИВП и характеризуется следующими признаками:
- имеет размер 5804 п.н. (мол. м. 3,9 МД);
- содержит векторную плазмидную ДНК pBR 322 размером 4362 п.н. (мол. м. 2,9 МД);
- содержит Hind III-P-фрагмент ДНК вируса осповакцины размером 1442 п. м. (мол. м. 0,96 МД).

В таблице показана последовательность пунктиров Hind III-P-фрагмента ДНК вируса осповакцины в плазмиде pVH 64.

П р и м е р 1. Исходный штамм вируса осповакцины ЛИВП получен из коллекции ВНИИ МБ.

Вирус осповакцины накапливают в алантоисной полости куриных эмбрионов, концентрируют центрифугированием, очищают от примесей седиментацией в линейном градиенте сахарозы и вновь концентрируют центрифугированием (по известной методике).

Для выделения ДНК вирус разрушают обработкой протеиназой К с додецилсульфатом натрия (ДДС-Na) и подвергают депротеинизации.

ДНК вируса гидролизуют рестриктазой Hind III в буфере А (50 мМ трис-HCl₂, рН 7,6; 50 мМ NaCl; 10 мМ MgCl₂; 1 мМ 2-меркаптоэтанол) до отдельных фрагментов и соединяют с помощью ДНК-лигазы с векторной плазмидой pBR 322, линеаризованной той же рестриктазой. Полученной смесью трансформируют клетки E. coli НВ 101 с последующим отбором трансформантов по устойчивости к ампициллину (40 мкг/мл), а рекомбинантов по чувствительности к тетрациклину (10 мкг/мл). Плазмидную ДНК из таких колоний выделяют методом кипячения и гидролизуют рестриктазой Hind III. Путем совместного электрофореза с маркерными фрагментами ДНК в геле из 0,8% агарозы устанавливают наличие и размер встроенного фрагмента. Отбирают клоны, содержащие Hind III-фрагмент ДНК, по молекулярной массе совпадающий с Hind III-P-фрагментом гидролизата ДНК ВОВ.

Для приготовления ³²Р-зонда на основе клонированного фрагмента берут 0,1 мкг Hind III-P-фрагмента ДНК, выделенного методом электроэлюции из плазмиды pVH 64, гидролизованной рестриктазой HInd III, и вводят ³²Р-метку с помощью метода ник-трансляции. Полученный зонд используют для ДНК-ДНК гибридизации по методу Саузерна с Hind III - гидролизатом ДНК ВОВ. Таким образом подтверждают вирусную природу фрагмента.

П р и м е р 2. Использование Hind III-P-фрагмента ДНК ВОВ для картирования генов вирусных белков демонстрируют следующим образом.

Картирование генов вирусных белков осуществляют с помощью бесклеточной трансляции вирусспецифической РНК, гибридизирующейся с рекомбинантной ДНК, иммобилизованной на нитроцеллюлозном фильтре. Для выделения вирусспецифической РНК монослой клеток CV-1 заражают вирусом осповакцины штамма ЛИВП с множественностью 10-30 бое/кл и инкубируют 8 ч без ингибиторов. Клетки снимают со стекла механически, осаждают при 400 g в течение 15 мин, 4^оС, ресуспендируют в буфере В (10 мМ трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ NaCl; 1 мМ MgCl₂), выдерживают 15 мин во льду и разрушают с помощью гомогенизатора "Dounce". Ядра удаляют центрифугированием при 700 g в течение 15 мин, 4^оС. Суспернатант трижды экстрагируют фенолом, насыщенным буфером В. РНК из водной фазы осаждают двукратным объемом спирта в течение ночи при -70^оС. РНК осаждают центрифугированием при 15000 g в течение 10 мин, 4^оС, ресуспендируют в буфере I, добавляют CsCl в количестве 1,2 мг/мл и наслаивают на "подушки" из 2, 5 мл 5,7 М CsCl, 50 мМ ЭДТА, рН 7,0, в пробирки от SW-40 ротора центрифуги L5-75. Центрифугируют 18-20 ч при 170000 g, 17^оС. Осадок РНК растворяют в буфере С (10 мМ трис-HCl, рН 7,5; 1 мМ ЭДТА; 2% N-лаурилсаркозил) и осаждают спиртом. После центрифугирования в течение 10 мин при 15000 g, 4^оС, РНК растворяют в ТЕ-буфере (10 мМ трис-HCl, рН 7,5; 1 мМ ЭДТА) и используют для гибридизации с плазмидными ДНК.

ДНК 20 мкг плазмид pVH 64 и pBR 322 денатурируют и наносят на фильтры по известным методикам.

Фильтры помещают в буфер (20 мМ Mops, рН 6,6; 1 мМ ЭДТА; 0,4 М NaCl; 0,1% ДДС-Na; 80% формамида) и инкубируют при 68^оС в течение 16 ч. Затем буфер сливают, фильтры помещают в 300 мл свежего буфера того же состава, в котором содержится 250 мкг РНК, выделенной как описано выше. По окончании гибридизации фильтры промывают кратковременно трижды в 2 мл буфера I (10 мМ трис-HCl, рН 7,5; 1 мМ ЭДТА; 0,1% ДДС-Na) и трижды в 2 мл буфера II (10 мМ трис HCl, рН 7,5; 1 мМ ЭДТА) по 15 мин при 37^оС, 2 раза в 2 мл буфера III (80% формамида, 20 мМ Mops, рН 6,7; 1 мМ ЭДТА; 0,4 М NaCl) и один раз в буфере IV (80% формамида; 20 мМ Mops, рН 6,7; 0,1 М NaCl).

РНК, связавшуюся с иммобилизованной ДНК, элюируют при 65^оС в течение 5 мин в 0,4 мл буфера следующего состава: 40 мМ Mops, рН 6,4; 90% формамида. Добавляют РНК из печени крыс до 10 мкл/мл, NaCl до 0,15 М и 2 объема спирта. Осаждают РНК при -20^оС в течение ночи и используют для трансляции в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика с ³⁵S-метионином. Продукты трансляции анализируют в 12,5%-ном полиакриламидном геле с 0,1% ДДС-Na в прерывистой буферной системе по Леммли с последующей радиоавтографией.

В результате проведенного анализа можно видеть, что РНК, гибридизующаяся в рекомбинантной плазмиде pVH 64, направляет синтез белка с молекулярной массой в области 36 КД (см. таблицу).

Для более точного картирования гена устанавливают первичную структуру Hind III-P-фрагмента, содержащегося в плазмиде pVH 64, методом Максама-Гилберта. При анализе нуклеотидной последовательности можно обнаружить открытую рамку считывания для белка 36 К, начало которого находится в Hind III-I-фрагменте (60 п. н.), а основная часть - в Hind P-фрагменте. В Hind III-P-фрагменте также обнаруживается открытая рамка считывания для белка 12 К и начало гена, основная часть которого расположена, по-видимому, в Hind III-Q- и Hind III-E-фрагментах.

П р и м е р 3. Использование рекомбинантной плазмиды pVH 64, содержащей Hind III-P-фрагменты ДНК ВОВ, в качестве векторов для направленной встройки чужеродной генетической информации в вирусный геном, демонстрируют следующим образом.

При анализе нуклеотидной последовательности Hind III-P-фрагмента обнаружен один сайт для рестриктазы BamHI, находящийся почти в середине фрагмента в гене белка 36 К. Он может быть использован для встройки чужеродных фрагментов ДНК. Для того чтобы этот сайт стал уникальным в рекомбинантной плазмиде, Hind III-P-фрагмент с помощью стандартных процедур переклонируют по Hind III-сайту в плазмиду pВО, которая представляет собой плазмиду pBR 322, но без сайта BamHI. BamHI-сайт в рВО удаляют путем гидролиза плазмиды pBR 322 рестриктазой BamHI, достраивания выступающих "липких" концов до "тупых" фрагментов Кленова ДНК-полимеразы 1 в присутствии всех четырех dNTP в концентрации 100 мМ и последующей сшивки по тупым концам ДНК-лигазой фага Т4. После встройки в полученный вектор Hind III-P-фрагмента ВОВ рекомбинантную плазмиду обозначают р ВОР.

В качестве селективного маркера при получении рекомбинантного вируса со встройкой в ген белка 36 К используют тимидинкиназу вируса простого герпеса (ТК HSV). В качестве фенотипического маркера используют β -галактозидазу. Для конструирования плазмиды, содержащей гены ТК HSV и β -галактозидазы (lac Z), фланкированные последовательностями Hind III-P-фрагмента, гены двух маркеров встраивают по BamHI-сайту в плазмиду рВОР.

Ранее на основе плазмиды pVar 15 была сконструирована плазмида pVar-ТК, которая содержала последовательность гена ТК HSV под промотором белка 7,5 К ВОВ, встроенную в тимидинкиназный ген вируса осповакцины. Плазмиду pVar-ТК гидролизуют рестриктазами EcoRI и ClaI. Выступающие липкие концы EcoRI достраивают до тупых фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I. Методом электроэлюции на диализную мембрану выделяют фрагмент ДНК 2550 п.н., содержащий ген ТК HSV под промотором белка, 7,5 К и встраивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в плазмиду рВОР, гидролизованную рестриктазами BamHI и Cla I, в которой липкие концы BamHI достроены до тупых. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli HB101 и методом гибридизации in situ ³²Р-зондом на основе ТК HSV отбирают клоны, содержащие ген ТК HSV. С помощью совместного гидролиза ДНК рестриктазами Pst I и Hind III, а также Pvu II и Hind III отбирают клон, содержащий рекомбинантную плазмиду, в которой ген ТК HSV ориентирован по направлению считывания белка 36К. Плазмиду обозначают pVH 64-ТК 16.

Ген β -галактозидазы встраивают в ген белка 36К так, чтобы рамки считывания β -галактозидазы и белка 36К совпадали.

Для проверки совпадения рамок трансляции гена белка 35К и lac Z устанавливают первичную структуру плазмиды, полученной после встройки lac Z hVZ 11 в области встройки по BamHI-сайту. Анализом первичной структуры подтверждают совпадение рамок трансляции этих двух генов.

Для получения рекомбинантной плазмиды, содержащей внутри Hind III-P-фрагмента гены двух маркеров (lac Z и ТК HSV), плазмиду pVZ 11 гидролизуют рестриктазами Hind III и Sal I. Выступающие липкие концы достраивают до тупых фрагментом Кленова и электроэлюируют фрагмент 3712 п.н., содержащий lac Z и начало гена белка 36К. Плазмиду pVH 64-ТК-16 гидролизуют рестриктазой EcoRI и липкие концы достраивают до тупых. В гидролизованную плазмиду pVH 64-ТК-16 встраивают фрагмент 3712 п.н. из плазмиды pVZ 11 с помощью Т4 ДНК-лигазы. Полученной лигазной смесью трансформируют бактерии E. coli IM 109 и высевают на среду, содержащую 40 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл X-gal. Клоны, содержащие встраиваемый фрагмент, отбирают по синей окраске. Плазмидную ДНК из клонов анализируют с помощью совместного гидролиза рестриктазами Hind III и Cla I. В результате анализа отбирают плазмиду pVZ 64-ТК, которая содержит внутри Hind III-P-фрагмента гены ТК HSV и lac Z. Плазмиду pVZ 64-ТК используют для получения рекомбинантного вируса вакцины.

Полученный положительный эффект достигается за счет свойств сконструированной плазмиды pVH 64, содержащей Hind III-P-фрагмент ДНК ВОВ штамма ЛИВП. Предлагаемый способ конструирования предусматривает использование векторной плазмиды pBR 322. Встраивание фрагментов ДНК ВОВ по Hind III-cайту в pBR 322 приводит к потере устойчивости к тетрациклину клеток E. coli НВ 101, трансформированных рекомбинантной плазмидой pVH 64.

Таким образом, на основе pBR 322 сконструирована новая рекомбинантная плазмида pVH 64, содержащая Hind III-P-фрагмент ДНК вируса осповакцины штамма ЛИВП, которая может быть использована для картирования вирусных генов в качестве молекулярного зонда, как донор генов для получения бактериальных продуцентов вирусных белков, а также в качестве вектора для введения чужеродной информации в вирусный геном. Определена нуклеотидная последовательность Hind III-P-фрагмента, что облегчает дальнейшее его использование.

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой рекомбинантную плазмиду pVH 64 размером 5804 п.н., содержащую векторную часть плазмиды pBR 322 и Hind III - p - фрагмент ДНК вируса осповакцины штамма ЛИВП. Клонируемый Hind III - p - фрагмент содержит гены белков 36k и 12k вируса осповакцины штамма ЛИПВ. Векторная плазмида содержит bla - ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину. Полученную плазмиду используют для картирования вирусных генов и в качестве молекулярного зонда для обнаружения гомологичных фрагментов любых ортопоксвирусов. Рекомбинантная плазмида pVH 64 может быть использована - как донор генов для получения бактериальных продуцентов вирусных белков, а также в качестве вектора для введения чужеродной информации в вирусный геном. Определена нуклеотидная последовательность Hind III - p - фрагмента, что облегчает его дальнейшее применение. 2 с.п. ф-лы, 1 табл.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pVH 64, предназначенная для картирования генов вируса осповакцины штамма ЛИВП и для направленной встройки чужеродной генетической информации в геном вируса осповакцины, мол.м. 3,9 МД и размером 5804 п.н., содержащая
плазмидную ДНК вектора pBR 322 размером 4362 п.н.;
Hind 111-P-фрагмент ДНК вируса осповакцины штамма ЛИВП размером 1442 п. н. с генами белков 36K и 12K;
сайты рестрикции: 2EcoRI, 3ClaI, 3Hind III, 2BamHI, 2BspRI, SalI, Pvu III, PstI;
генетический маркер - ген устойчивости к ампициллину. 2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pHV 64, заключающийся в том, что Hind III-фрагмент ДНК вируса осповакцины с помощью ДНК-лигазы встраивают в векторную плазмиду pBR 322, гидролизованную рестриктазой Hind III, полученной смесью трансформируют клетки E.coI i HB 101, обработанные CaCl₂, с последующим отбором трансформантов по их способности расти на среде, содержащей ампициллин, и неспособности размножаться в присутствии тетрациклина, и отбор клонов, содержащих фрагмент вирусной ДНК с мол. м. 0,96 МД в составе рекомбинантной плазмиды, осуществляют с помощью гидролиза плазмидных ДНК рестриктазой Hind III.