Способ получения фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего проинсулин человека Советский патент 1989 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области генэтической инженерии и касается получения фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего проинсулин человека с помощью рекомбинантной ДНК-технологии.

Фрагмент ДНК, кодирующий проинсулин, получают путем клонирования гена млекопитающего. После клонирования в плазмиде pBR322 выделяют его с помощью эндонуклеаз Hhal и Alul и модифируют присоединяя химически синтезированную иуклеотидную последовательность 3 -TTTGTGAAGGAAGACCTGTGCGG CTCAGAGCTGGAAG-5 , кодирующую 14 аминокислот проинсулина.

Пример 1. РНК получают из человеческой инсулиномы после центрифугирования в 5,7 М CsCl, содержащем 100 мМ ЭДТУ, и используют без дальнейшего фракционирования в качестве шаблона дпя синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы и SI- нуклеазы. Приблизительно 40 нг двух- нитевой кДНК получают из 130 мкг иефракдаонированной РНК.

Нефракционированную кДНК обрабатывают концевой трансферазой в присутствии дЦТф для получения олиго-С- хвостов на 3 -концах молекул кДНК. Плазмиду pBR322 расщепляют эндону- клеазой ограничения Pst I и обрабаliik Р

4 ел

сн

тывают концсвсй трансферазой в присутствии dGTP для получения олиго- dG-xBOCTOB на 3 -концах линейной плазмидной ДНК.

Сшивают полученные фрагменты и получают кольцевую плазмиду.

1 1тамм E.coli XI776 трансформируют с использованием плазмидных ДНК-со- держащих вставок. Получают 525 резистентных к тетрациклину трансформантов , Их реплицируют высевом и клас сифицируют на инсулиновые последовательности с помощью гибридизации колоний (in situ)i Ранее клонированную кДНК препроинсулина крыс используют в качестве пробы для гибридизации, после метки кДНК крыс - с помощью Nick-трансляции с применением ДНК-по- лимеразы 1с Поскольку аминокислотные последовательности инсулинов крыс и человека довольно сходны (инсулин, 92% гомлогия; проинсулин, 83% гомло- гия), предполагают, что клонированная кДНК крыс будет испытывать кросс-гибридизацию с последовательностями человеческого инсулина в нежестких условиях. Авторадиографией выявляют, что две из 525 колоний гибридизиро- ваны с пробой клонированного препро- инсулина-1 крыс о Обе колонии чувствительны к ампициллину. Выделенные из колоний плазмиды приблизительно на 250 пар оснований (Ьр) и на 500 Ьр длиннее, чем сам pBR 322. Более длинную плазмиду обозначают как рсН1-1.

Нуклеотидную, последовательность вставленного кДНК фрагмента рсН1-1 определяют методом Махаш and Gilbert

Прим е р 2о кДНК вставка рсН1-1 содержит полную кодирующую последовательность для человеческого препроннсулина о

ДНК синтетического проиисулина

обрабатывают Alu-1-эндонуклеазой для получения двух фрагментов размером A3 Ьр и 56 Ьр. Аналогично кДНК-встав- ку рсН1-1, предпочтительно полученную с помощью обработки Hh а I, расщепляют частичным гидролизом, катализируемым Alu-1-эндонуклеазой с образованием фрагментов по 75, 90, 110, 135, 165, 200, 245, 275, 375 и 455 Ьр соответственно их фракционируют методом гельэлектрофореза с получением фрагмента 375 Ьр, который получается в.результате разрыва в одном местоположении в кодоне для аминокислоты N 14 о

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Фрагменты распрплення синтетического гена и фрат мент 375 Ьр соединяют с помощью тупоконечной лигатуры. Точное соединение синтетического фрагмента размером 43 Ьр с 375 Ьр кДНК-фрагмента максимизируют при условии, что 375 Ьр кДНК присутствует в молярном избытке. Возможности для неточного соединения также минимизируют тем, что синтетические фрагменты имеют однонитевые выступающие концы, которые не являются комплементарными концами 375 Ьр кДНК-фраг- мента.

Объединенный фрагмент, содержащий синтетическую последовательность для метионина (1-13 аминокислот), и встречающаяся в природе последовательность кодирования для аминокислот 14-86 проинсулина составляет последовательность кодирования для проинсулина.

Проинсулин-кодирующую последовательность конструируют избирательным разрывом у внутреннего положения в проинсулин-кодирующей области с последующим пришиванием химически синтезированной последовательности, кодирующей ту часть проинсулин-кодиру- ющего участка, который удален предшествующим расщеплением. Плазмиду рсН1-1 используют в качестве источника проинсулин-кодирующего участка, который избирательно исключают обработкой Hhal-эндонуклеазойо

Любой фрагмент после выделения обрабатывают щелочной фосфатазой для удаления 5 -концевых фосфатных групп, затем расщепляют эндонуклеазой Alu I, имеющей уникальную точку расщепления в области 13-14 аминокислот в проин- сулин-кодирующей последовательности. Местоположение ограничения предпочтительно располагают вблизи одного из концов проинсулин-кодирующей последовательности. Hhal-фрагмент - рсН1-1 частично разрывают Alul-эндонуклеазой с получением двух фрагментов длиной приблизительно 76 Ьр и 375 Ьр соот-. ветственно. Alul-фрагменты фракционируют методом гельэлектрофореза и выделяют фрагмент 375 Ьр

Нуклеотидную последовательность, кодирующую первые 13 аминокислот проинсулина с 5 -концевым С (на плюс-нити), для заверщения кодона на аланин в положении 14 синтезируют фосфотри5I

эфирным методом о Плюс-нить синтетической ДИК HN: ет последовательность: 3 -TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTG GTGGAAG-5 .соответствующую природной последовательности,

Результирующей последовательностью является последовательность,

сшитая тупым концом с приблизительно 375 Ьр фрагментом Hhal-фрагментом рсН1-1. Поскольку последний имеет 5 -фосфат только на присоединяемом конце, два фрагмента соединяют в правильном порядке. Синтетический фрагмент правильным образом соединяют с большим фрагментом в приблизительно 50% реакции.

-24

-...20

1, Способ получения фрагмента н 15 клеиновой кислоты, кодирующего про сулин человека со следующей нуклео тидной последовательностью: -10

met ala еи trp met org teu leu pro leu leu ofa leu leu ola let/ CCTTCTCCCATD CCC CTC TCC АТС CCC CTC CTC CCC CTC CTC CCC CTC CTC CCC CTC

Пример 3. Клонированные вставки, кодирующие на препроинсулин (пример 1) или проинсулин (пример 2), вставляют в вектор переноса экспрессии. Когда вставка происходит при правильной ориентации.относительно начала трансляции у местоположения вставки, она находится в фазе относительно фрейма считывания.

Формула изобретения

1, Способ получения фрагмента ну- клеиновой кислоты, кодирующего проинсулин человека со следующей нуклео- тидной последовательностью: -10

Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего проинсулин человека с помощью рекомбинантной ДНК-технологии. Фрагмент ДНК, кодирующий проинсулин, получают путем клонирования гена млекопитающего. После клонирования в плазмиде PBR 322 его выделяют с помощью эндонуклеаз HHA 1 и ALU 1 или эндонуклеаз HHA 1 и модифицируют, присоединяя химически синтезированную нуклеотидную последовательность 3Ъ-TTTGTGAACCAACACCTGTCGGCT CACACCTGGAAG-5Ъ, кодирующую 14 аминокислот проинсулина.

.trp gttf

TCC CCA

1 /0

pro охр pro ofa ofo afo pfie vol oia gfn h/5 teu cy ser his feu vat

CCT CAC CCA CCC CCA CCC TTT CUC AAC CAA CAC CTC /CC CCC tCA CAC CT& CT& СДА

Qlo teu gr

CCT CTC111 N r

Alu f 20JO

ti/r feu vof ci/5 gig glu orggfy p/ie phe tj/r thr pro lys thrarg org gig alo

TAC СТА CTt TCC CCC CAA CCACCC TTC TTC TAC АСА CCC AAC ACCCCC CCC CAC CCA

glu asp CAC CAC

0 so

leu gin wl gig gin val glu leu gig g/y gfc/ pro gfi/ olo gig str feu gfn pro

CTt CAG &TC C&C CAC CfC CAC CTG GtC CCC C&C CCT CCT CCA CCC A6C CTC GAG CCC

eu ofo

TT& GCC

Aluf

60 70

leu glu gfv ser leu gin tyj arg gtg lie ко glu gin tgi cys thr ser lie cyi

CTC GAD CCC TCCCTD CAG AAG CCT CCC ATT GTC GAA САД TCC TGT ACC AGO АТС TCC

ser leu.

TCC сто

60Об

tyr gfn leu g/uasn tyr cyj 05П

TAC CAC CTG CAGAAC TAC TGC AAC TAG ACGCACCCCCCACCCACCCCCCCA CCCCCCCCCTCCTCCA

AiH

w/ ffj

CCCACA&ACATDGAATAAACCCCTTCAACCACC

ЦМ I

заключающийся в том, что клетки островков Лангерганса центрн})угируют в растворе, содержащем 5,7 М CsCl и 100 ЭДТУ, отделяют РНК препро- инсулина, синтезируют кДНК, полученную кДНК встраивают в PstI сайт плаз- миды pBR 322 с помощью dA-олиго- dT- метода, трансформируют рекомбинант- ной плазмидной ДНК штаммы бактерий Escherichia coli и отбирают клоны, гибридизующиеся с клонированной кДНК препроинсулина крыс, содержащей радиоактивную метку, выделяют из них плазмиду рсН1-1 со вставкой кДНК пре- проинсулина, обрабатывают рсН1-1 эн- донуклеазой Hha I с последующим частичным ги ;ролизом Alul зндонуклеазой.

5в

выделяют фрагмент длиной 375 Ьр и лигируют ДНК-лигазой Т с фрагментом длиной 43 Ьр химически синтезированной нуклеотидной последовательности 3 -TTTGTGAACCAACACC TGTGCGGCTCACACCT GGTGG AAG-5 , кодирующей 1-14 аминокислоты проинсулина, оканчивающейся г.айтом Alu lo

По1,отличаю- что плазмиду рсН1-1

2„ Способ по щ и и с я тем, обрабатывают зндонуклеазой Hhal, выделяют фрагмент длиной 375 Ьр, который тупоконечно лигируют с нуклеотидной последовательностью З -TTTGT GAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAG-5 .