Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к конструированию экспрессионных плазмид для получения интерЛеронов, а именно к способу конструирования экспрессионных плазмид pRHWl 1 и pRFVl2, кодирующих новые интерЛероны.
Способ осуществляют следующим образом.
Человеческую В-лимфомную линию клеток, например Namalma-клетки,
обрабатывают вирусом, например Sen- dai-вирус. Выделяют образовавшуюся из стимулированных Namalwa-клеток мРНК и используют ее в качестве матрицы для синтеза кДНК. Чтобы повысить выход специфических для интерферона последовательностей в процессе клонирования, мРНК-препарат разделяют в сахарах с градиентом плотности соответственно на различной длины индивидуальные мРНК-молекулы.
ы
Предпочтительнее собирать (накапливать) мРНК в области около 12S (примерно 800 - 1000 оснований мРНК). В этой Области седиментирует специ- фическая для сЈ - и |3 -интерферонов мРНК. мРНК ич чтой области градиентов коцентрируется благодаря осаждению и растворению в воде„
Составление библиотеки кДНК осу- ществляют известными методами. мРНК снабжают добавкой олиго-dt. Затем благодаря добавке четырех дезоксинуклеоэид- трифосфатов(ёАТР, dGTP9 dCTP, dTTP) и фермента обратной трфнскрипта ы в соответственно буферированном растворе в течение 1 при 4 5° С синтезиру-, ют кДНК. Благодаря экстракции хлороформом и хроматографии на колонке с гелем, например через сефадекс G50, очищают гибрид кДНК/мРНК. РНК гидро- лизуют благодаря обработке щелочью (0,3 моль NaOH при 50°С, 1 ч), и кДНК после нейтрализации с помощью кислого раствора ацетата натрия осаждают этанолом. После добавки дезоксинуклеозидтрифосфатов и R.coli ДНК-полимеразы-1 в соответствующий раствор осуществляют двухнитевой, (двойной) синтез, причем ДНК служит одновременно как матрица и как затравка благодаря образованию структуры типа шпильки на своем 3 -конце (б ч при 15°С), После экстракции Фенолом, хроматографии на сефадексе G50 и осаж- дения этанолом ДНК в пригодном растворе подвергают обработке специфической эндонуклеазой S Ј,, При этом распадается структура шпильки, а также непревращенная в двойную нить ДНК, После экстракции хлороформом и осаждения этанолом двухнитевую ДНК (ds ДНК) разделяют по величине в сахарах с градиентом плотности. Для следующей стадии клонирования пред почтительно применяют только ds ДНК размером 600 Ьр и более, чтобы повысить вероятность получения клонов,, которые содержат комплектную кодирующую последовательность новых интер- ронов. ds ДНК длиной более 600 Ьр концентрируют из градиентов путем
осаждения этанолом и растворения в воде.
Для того, чтобы увеличить образовавшиеся ds ДНК-молекулы, их нужно сначала внести в соответствующий вектор, а затем в бактерию E.coli. Вектор представляет собой плазмиду pBR
5 0 5 Q
5
322. Эта плазмида состоит из реплико- на и двух селекционных маркеров. Они придают хозяину резистентность против антибиотиков ампициллина и тетрациклина (Ар11, Тс1). Ген для {Ь -лактамазы (Ар )содержит последовательность для распознавания рестрикционной эндо- нуклеазы Pst I. pBR 322 можно разрезать с помощью Pst I. Выступающие
о
3 -концы удлиняются с помощью концево-- го фермента дезоксинуклеотидтрансфе- разы (TdT) при помещении dGTP в соответственно буферированный раствор. Одновременно также на 3-концах удлиняется ds ДНК с помощью фермента TdT при применении dCTP. Гомополимерные концы плазмйды и ds ДНК смешивают в соответствующих концентрационных соотношениях и при пригодных условиях температуры, солевых и буферных условиях.
Е. coli штамма НВ 101 (генотип F-, hsds 20 (r-B, m-B) rec A13, , - proA2, lacVI, galK2, rpsL120 (Smr), xyI-5, mtl-1, supE44, lambda-) обрабатывают путем выращивания в CaCl. Компетентный Е. coli HB 101 смешивают ( с ДНК и после инкубации при 0°С трансформируют полученной плазмидной ДНК путем теплового нагрева при 42 С в течение 2 мин. Затем трансформированные бактерии помещают на содержащие тетрациклинагаровые пластинки (10 мкг на 1 мл). На этом агаре могут расти только Е. coli HB 101, которые восприняли векторную или рекомбинантную векторную молекулу (Tch). Рекомбинант- ные вектор-dc. ДНК-молекулы передают
5 Г
хозяину генотип Ар ТС , так как благодаря введению ds ДНК в В-лактамазу- ген разрушается информация для Ъ -лактамазы. Клоны переносят на агаровые пластинки, которые содержат 50 мкг/мл ампициллина. Растет только примерно 3%, что означает, что 97% клонов содержат вставку dsДНК-молекулы. Из них 28600 клонов переносят индивидуально в лунки (выемки) пластинок для микротитрования, которые содержат питательную среду, 10 мкг/мл тетрациклина и глицерина. После того, как клоны увеличиваются в них, пластинки хранят при -70 С (кДНК-библиотека).
Клоны после размораживания переносят на нитроцеллюлозные фильтры. Эти фильтры расположены на содержащем тетрациклин питательном агаре. После
51
увеличения колоний бактерий ДНК бактерии фиксируют на фильтре.
В качестве образца служит предпочтительно вставка клона pER33, которая содержит ген для IFN-ed-2-Arg. Благо- даря никтрансляции этот кусок ДНК радиоактивно маркируют, причем применяется ДНК-полимераза I, dATP, dGTP, dTTP иоб 2Г-аСТР. Нитроцеллюлозные фильтры при пригодных нестрогих условиях гибридизации предварительно прежде всего обрабатывают без добавки радиоактивного образца и затем гибридизируют примерно в течение 16 ч при добавке радиоактивного образца. После этого фильтры промывают также в нестрогих условиях. Благодаря низкой строгости (точности) гибридизации и промывки охватывают не только со- держащие интерферон-(Ј2-А -клоны, но также другие интерферонсодержащие клоны, последовательности которых могут заметно отклоняться от последовательностей до сих пор известного ин терферона сЈ. После высушивания фильтры экспонируют на рентгеновской пленке. Почернение, которое четко находится над уровнем фона, показывает наличие клона со специфическими ин- терферону последовательностями.
Так какгсигналы радиоактивности имеют различное качество. то положительные клоны, подозреваемые как положительно реагирующие клоны, выращива- ют в маленьком масштабе. Плазмидную ДНК-молекулы изолируют, переваривают с рестрикционной зондонуклеазой Pst I и разделяют по размеру электрофорети- чески на агаровом геле (геле агарозы) ДНК в геле агарозы (агаровом геле) по методу Саутерна переносят на нитро целлюлозный фильтр. ДНК этого фильтра гибридизируют с помощью радиоактивного, содержащего IFN-ген, денатуриро ванного образца. В качестве положительного контроля служит плазмида IF7 (хранится в DS М под номером 2362) содержащая ген для интерферона oi-2- arg. Ауторадиограмма четко показывает что клон F76E9 и клон Р9А2 содержат последовательность, которая гибридизируется при нестрогих условиях с помощью гена интерферона об-2-Arg. Для того, чтобы подробнее охарактеризо- вать ds ДНК-вставку клона Е76Е9 и клона Р9А2, гшазмиды этих клонов приготовляют в большем масштабе. ДНК переваривают различными рестрикционными
0
24
5 $ 0 5 0
. о j 0 е
196
эндонуклеазами, например с Alul, |Sau ЗА, Bg III, Hinf I, Pst I и iHae III. Образовавшиеся фрагменты i разделяют в агаровом (агарозном) геле. Благодаря сравнению с соответствующими маркерами величин, например с фрагментами, которые образуются путем переваривания pBR 322 с рестрикционной эндонуклеазой Hinf I, соответственно НаеШ, определяют размеры фрагментов. Определяют последовательность этих фрагментов. Сделан вывод, что в случае вставки клонов , Е76Е9 и Р9А2 речь идет о до сих пор неизвестных интерфероногенах, а именно о омега-интерферонах.
Информацию об омега-интерферонах используют для того, чтобы переварить кДНК-ставку с рестрикционными эндонуклеазами. Образовавшиеся фрагменты лигируют в ds ДНК-форму (решшкатив- ная форма) Ml 3 mp9 и секвенсируют с помощью дидеокси-метода Sanger. Од- нонитевую ДНК рекомбинантных фагов изолируют. После связывания синтетического олигомера в четырех отдельных приготовлениях осуществляют двух- нитевые синтезы при применении большого фрагмента ДНК-полимеразы 1 из E.coli (фрагмент Кленова). В каждой из четырех частичных реакций добавляют один из четырех дидезоксинуклеозид- трифосфатов (ddATP; ddCTP; ddCTP; ddTTP). Это приводит к статистически распределенным обрывам цепи в тех местах, на которых в матрице ДНК находится дополнительное к соответствующему дидезоксинуклеозидтрифосфату основание. Кроме того, дополнительно используют радиоактивно маркированный dATP. По окончании реакции синтеза продукты денатурируют и однонитевые ДНК-фрагменты разделяют по величине в денатурирующем полиакриламидном геле. После этого гель экспонируют на, рентгеновской пленке. Из ауторадио- граммы можно определить ДНК-последовательность рекомбинантного Ml 3 фага. Последовательность вставки различных рекомбинантных фагов определяют с помощью пригодной компьютерной программы.
Изолированная кДНК клона Е76ЕД для омега (Glu)-интерферона длиной 858 пар оснований имеет 3 -нетранслированную область. Область, которая кодирует зрелый омега (Glu)-интерферон,
доходит от нуклеотида 9 до нуклеотида 524. Изолированная кДНК клона Р9А2 для омега (Glu)-интерферона длиной 877 пар оснований, кодирующая зрелый омега-интерферон, доходит от нуклеотида 8 до нуклеотида 523. з - Нетранслированная область в случае Р9А2 доходит до поли-А-отрезка (участка) .
ч ДНК-последовательность, кодирующая омега-интерферон, полностью содержится в клонах Е76Е9 и Р9А2. Они начинаются на N-терминальном конце аминокислот цистеин-аспарагиновая кислота - лейцин. Оба зрелых омега-интерферона имеют длину 172 аминокислоты, что четко отклоняется от длин обоих известных интерферонов, например 166 (соответственно 165).аминокислот Ф случае об-интерферонов. Оба оме
0
га-интерферона обладают потенциальным участком N-гликозидирования в положении 78 аминокислот (аспарагин-метио- нин-треонин).
Сравнение ДНК клона Е76Е9 и клона Р9А2 показывает различие. Кодирующий аминокислоту 111 триплет в клоне Е76Е9 представляет собой GAG и кодирует глутаминовую кислоту, в то время как этот триплет в клоне Р9А2 представляет собой GGG и кодирует глицин. Оба омега-интерферон-протеина поэтому различаются одной аминокислотой и обозначаются как омега (Glu)-интерферон (Е67Е9) и омега (С1и)-интерфе- рон (Р9А2).
- Сравнение обоих омега-интерферо- нов с до сих пор известным человеческим об-интерфероном дает следующую картину (см.таблицу).
Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к конструированию рекомбинантных плазмидных ДНК для получения интерферонов. Плазмиду P9 A2 или E79 E9 переваривают рестриктазой AVA II, полученную вставку к ДНК переваривают SA и 3A, выделяют фрагмент длиной 189 п.о., плазмиду PER 33 переривают рестриктазами ESOR I и PVU II, фрагмент длиной 389 п.о. далее переваривают энзимом SAU 3A, выделяют фрагмент длиной 108 п.о., который лигируют с фрагментом длиной 189 п.о., полученную ДНК обрабатывают HIND III и лигируют с HIND III линсаризованной плазмидой ER 103, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штамм E.COLI HB 101, полученную при этом плазмиду PRHW 10 переваривают BAM H 1, инкубируют в присутствии фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 и четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, плазмиду обрабатывают энзимом NCO I, выделяют большой фрагмент NCO I - ALUI плазмиды P9 A2 или E79E9, который получают в результате обработки плазмиды AVA II с последующим гидролизом N CO I и ALU I, рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют E.COBI HB 101.
Характеристика Омега
Длина протеина в аминокислотах172Потенциальное место N-гликози- лирования в положении78
Интерферон альфа-А имеет только 165 аминокислот.
Интерферон альфа-Н имеет потенциальное место для N-гликозилиро- вания в положении 75.
Б. coli НВ 101 с плазмидой Е76Е9 и Е„ coli 101 с плазмидой Р9А2 депонированы (3.7.1984) в немецкой коллекции микроорганизмов (I S M Got- tingen) под номером ДЗМ 3003, соответственно DSM 3004.
Для доказательства того, что вновь найденные клоны продуцируют подобную интерферону активность, например культивируют клон Е76Е9, и
EcoRISau3A
gaattcacgct
GATCGCTAAAACATTGTGCAAAMGAGGGTTGACTTTGCCTTCGCGA
ImRNA-Start
ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTTAAAG ATG 116
RBS Hindlll
Альфа
166
лизат бактерий после его роста испытывают в тесте сокращения пятна. Однако гены экспрессируются в
плазмиде экспрессии pER 103, так
как этот вектор содержит все регуляционные элементы, которые приводят к высокой скорости экспрессии клонированных генов. Согласно изобретению
в плазмиде pBR 322 более короткий EcoRI/Bam HI-фрагмент заменен ДНК- последовательностью формулы
59
9 157241910
Cys Aspривают с рестрикционной эндонуклеаТРТ глт г т™ЗОЙ Ava11 fiocjie хроматографии и
1Ы ыи i IJ-N - omega - Сеп - очистки полученной кДНК-вставки ее
Sau3A, переваривают с рестрикционными эндонуклеазами N col и Alul двукратно и после этого изолируют с помощью хроI. Получение необходимых для этой матографии и электроэлюирования. цели отдельных фрагментов ДНК.Этот фрагмент содержит большую часть соФТЭЯГМРНТ я
10 ответствующего омега-интерфероногена.
Для получения фрагмента а плаэми- Так, например, омега (С1у)-интерфёро- ду, которая содержит ген для IFN-оме- ноген клона Р9А2 имеет следующую га, например плазмиду Р9А2, перева- структуру:
5 , Ю15
His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu CNcol CAT GGC СТА CTT AGC
AGG AAC ACC TTG 28
202530
Val Leu Leu His Gin Met Arg Arg lie Ser Pro Phe Leu Cys Leu
GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA АТС ТСС CCT TTC TTG TGT CTC 73
354045
Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Met Val Lys Gly
AAG GAC AGA AGA GAG TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118
505560
Ser Gin Leu Gin Lys Ala His Val Met Ser Val Leu His Glu Met
AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 163
657075
Leu Gin Gin He Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala
CTG CAG CAG АТС TTC AGC CTC TTC dAC АСА GAG CGC TCC TCT GCT 208
808590
Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gin Leu His Thr Gly Leu His
GCC TGG AAC ATG ACC CTC СТА GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 253
95100105
Gin Gin Leu Gin His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gin Val Val Gly
CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 298
ПО115.120
Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala lie Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu
GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 343
125130135
Ar Ar Tyr Phe Gin Gly He Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys
AGG AGG TAG TTC CAG GGA АТС CGT GTC TAG CTG AAA GAG AAG AAA 388
140145150
Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu He Met Lys
TAG AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA АТС ATG AAA 433
155160165
Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu Arg Leu Arg Ser Lys
TCC TTG TTC TTA TCA АСА AAQ ATG CAA GAA AGA CTG AGA ACT AAA 478
170 Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser
GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530
11157241912
TAACACTTGCACATGTG ACTCTGGTCAATTCAAAACACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 589
AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648 AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 707 T1ATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 766
TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct802
Alul
Фрагмент бвставки ее переваривают далее с рест15рикционной эндонуклеазой Sau3A и
Для получения, фрагмента б плазми-желательной длиной 189 Ьр фрагмент
ду Р9А2 переваривают с рестрикцией-изолируют с помощью хроматографии
ной эндонуклеазой Avail. После хро-и электроэлюирования. Он имеет
матографии и очистки полученной кДНК- следующую структуру:
20
51015
Asp Leu Pro Gin Asn His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu
V
Sau3A GAT CTG CCT GAG AAC CAT GGC СТА CTT AGC AGG AAC ACC TTG 42
20 NC°T 2530
Val Leu Leu His Gin Met Arg Arg lie Ser Pro Phe Leu Cys Leu
GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA АТС ТСС CCT TTC TTG TGT CTC 87
354045
Lys Asp Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Met Val Lys Gly
AAG GAC AGA AGA GAG TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 132
505560
Ser Gin Leu Gin Lys Ala His Val Met Ser Val Leu His Glu Met
t ACG CAG TTG CAG AAG GGC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAC ATG 177
Leu Gin Gin He
CTG CAG CASau3Ag ate189
40
Фрагмент с,сомальное место связывания и стартоДля получения фрагмента с плазми-вый (инициирующий) кодон, затем переду pER 33 двукратно переваривают сваривают с ЗаиЗА. Желательный фраг- рестрикционными ферментами EcoRI и -мент длиной 108 Ьр получают путем PvuII. Полученный после Аракциониро- ., электрофореза на агаровом (агароз- вания на агаровом (агарозном) геленом) геле, электроэлюирования и очист- и очистки фрагмент длиной 389 Ьр, на колонке Elutip. Он имеет сле- торый содержит Trp-промотор, рибо-дующую структуру:
EcoRI ЗаиЗА
gaattcacgct GATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTGCCGA 59
ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTTAAAG ATG 116
RBS Hind III
Cys Asp
TGT gate
с ТА123
SauJA
1315724)914
Лигирование фрагментов б и с. резают с помощью Hind III. Этот лиги- Фрагменты бис лигируют Т4-лига- ровэнный фрагмент имеет следующую
зой и после разрушения фермента раз- структуру:
i
Hind IIIо ,. 5 м т
ЗаиЗДNcol
a AGCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA50
ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGCA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT100
CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG150
CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC200
AGATCACACA TCTTTAagct
Sau3A Hind III
Этот необходимый для получения плазмиды pRHWIO ДНК-фрагмент можно также приготовить путем применения двух синтетически полученных олиго- нуклеотидов:
Олигонуклеотид формулы АССТТАААСАТСТСТ-3 оставляют дефосфо- рилированным на своем 51 -конце. Олигонуклеотид формулы 5- GATCACACATCTTTA-3 , киназирует на 5 - конце с помощью Tv-полинуклеотидкиназы и АТР. При гибридизации обоих олиго- . нуклеотидов получают следующий коротки ДНК-фрагмент:
5f- AGCTTAAAGATGTGT 3
3- ATTTCTACACACTAGp 51
Благодаря этому на конце образуется
типичный для Hind III 5-переход и на другом конце - типичный для Sau3A 5-переход.
Фрагмент б дефосфорилируют при при менении фосфотазы из телячьего кишечника. Фрагмент б и вышеописанный фрагмент собирают вместе и связывают друг с другом с помощью Т -лигазы.
Так как лигазе необходим по край- ней мере один содержавши 5 -фосфат конец, можно связать только кусок синтетической ДНК с фрагментом б или два синтетических фрагмента по их Sau ЗА-концам. Так как оба получен- ных в результате фрагмента различаются по своей длине, их можно разделять путем селективного осаждения изопро- панолом. Таким образом, очищенный фрагмент фосфорилируют с помощью Ту- полинуклеотидкиназы и АТР.
П р и м е р 2.
II.,Получение экспрессионных плаз- мид.
0
5 Q
5
0
5 Q е
а.Получение плазмиды pRHWIO. Линеаризируют экспресснонную плазмиду pER 103 с помощью Hind III и затем обрабатывают фосфатазой телячьего кишечника. После изолирова- . ния и очистки таким образом полученную ДНК дефосфорилируют и после этого лигируют с помощью лигированных фрагментов бис (после их переваривания с Hind III). Затем Е. coli НВ 101 трансформируют полученной после лигирования смесью и культивируют на LB-arape плюс 50 мкг/мл ампициллина. Обладающая желательной структурой плазмида получила название pRHWIO, которая после его репликации служила в качестве промежуточного продукта для получения дальнейших плаз- мид.
б.Получение плазмиды pRHW12.
К разрезанной с помощью Bam HI i плазмиде pRHWIO добавляют фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 и 4 дезокси- нуклеозидтрифосфата. Полученную послав инкубации линеаризированную и снабженную тупыми концами плазмиду очищают и затем разрезают с помощью Ncol. Больший фрагмент, который получается с помощью электрофореза на агаровом (агарозном) геле, электроэлюиро- вания и Elutip-очистки по типу элю- ирования, лигируют с помощью фрагмента а. Затем смесь после лигирования трансформируют в Е. coli HB 101 и культивируют на LB-arape плюс 50 мкг/мл ампициллина. Обладающая желательной структурой плазмида получила название pRHW12, 1 л полученной таким образом инкубированной бактериальной культуры (оптическая плотность 0,6 при 600 нм).содержит 1-10 международных единиц интерферона.
151
в. Получение плазмиды pRHWl1„ К разрезанной с помощью Bam HI плазмиде pRHWIO добавляют фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 и 4 дезок- синуклеозидфосфата. Полученная после инкубации линеаризированная,снабженная линейными концами плазмида очищается и затем разрезается с помощью Ncol. Больший фрагмент, который получается с помощью электрофореза в агарозном геле, электроэлюирования и Elutip-очистки (по типу элюирова- ния), лигируется с помощью полученного аналогично из плазмиды Е79Е9 фрагмента а, в котором лишь кодирующий III аминокислоту - (Gly) GGG-ко- дон заменен на GAG-кодон (Glu). Затем полученной после лигирования смесью трансформируют Е. соli HB 101 и культивируют на LB-arape. Обладающая желательной структурой плазмида Получила название pRHWll. pRHWl1 экск ретирует желательный омега-(Gly)-интерферон.
Пример 1. Нахождение специфических к IFN-последовательности клонов.
а.Приготовление кДНК-библиотеки. мРНК из стимулированных вирусом
Sendai-клеток применяют в качестве исходного материала для приготовления кДНК-банка по известным из литературы методам. Образовавшиеся 30000 слонов переносят индивидуально в углубления (лунки) пластин для микротитрования . Используют следующую среду для роста и замораживания колоний: ЬО г тригтона; 5 г дрожжевого экстракта; 5 г NaCl; 0,51 г цитрата натрия Х2 НгО; 7,5 г KZKP04 2 HZ0; 1,8 г КН4Р04; 0,09 г MgS04-7H20; 0,9 г (,; 44 г глицерина; 0,01 г тетрациклин УНС1; вода до 1 л.
Для микротитрования пластины с индивидуальными клонами инкубируют в течение ночи при 37 С и затем хранят при -70°С.
б.Гибридизирующая проба (образец В качестве исходного материала гиридизирующего образца служит реком- бинантная плазмида pBR 33. Эта плазмда содержит кодирующую область для , зрелого интерферона IFN-2 arg плюс 190 оснований 3 -нетрансляцированной области. 20 мкг peR 33 инкубируют в течение 1 ч при 37 °С с 30 ед. Hind III рестрикционной эндонуклеазы в
0
S
0
5
41
0
5
0
5
-О
5
916
200 мкл реакционного буфера (10 мМ трис-HCl, рН 7; 10 мМ MgCl4; 1 мМ дитиотрейтода (ДТТ);50 мм NaCl). Реакцию прекращают добавлением 1/25 объема 0,5 М этилендиаминтетрауксус- ной кислоты (ЭДТА) и прогревают при 70 С в течение 10 мин. После добавления 1/4 объема 5х буфера (80% глицерина; 40 мМ трис-уксусной кислоты, рН 7; 8; 50 мМ ЕДТА, 0,05% додецил-. сульфата натрия (SDS); 0,1% бромфено- лового синего) образовавшиеся фрагменты разделяют по величине в 1%-ном агарозном геле (гель-буфер и электродный буфер (ТВЕ): 10,8 г/л трис-гидр- оксиметиламинометана (трис-основания); 5,5 г/л борной кислоты; 0,93 г/л ЕДТА). После инкубации геля в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) участок геля, который содержит фрагмент ДНК с геном IFN (длиной примерно 800 Ър), вырезают. ДНК электро- элюируют в 1/10х ТВЕ-буфере. Раствор ДНК экстрагируют однократно фенолом и четырехкратно эфиром и ДНК осаждают добавлением 1/10 объема 3 М ацетата натрия (Na AC), рН 5,8, и 2,5 объемами этанола при -20°С. Осадок ДНК промывают однократно 70%-ным этанолом и высушивают в течение 5 мин в вакууме. ДНК растворяют в 50 мкл воды (примерно 50 мкг/мкл). Эту ДНК метят методом перемещения разрыва: 50 мкл реакционной смеси содержит 50 мМ трис-HCl; рН 7,8; 5 мМ MgClj,; 10 мМ меркаптоэтанола; 100 нг ДНК- вставки pER 33, 16 нг DNaSel; 25 мкм dATP; 25 мкм d GTP; 25 мкм dTTP; 20 мкС1 V -Pj-d CTP (более 3000 Ci/ ммоль), а также 3 ед. ДНК-полимеразы 1 (Е. coli). Реакцию проводят при 14°С в течение 40 мин. Реакцию заканчивают добавлением 1 объема раствора, содержащего 50 мМ EDTA; 2% SDS; 10 мМ трис-HCl, рН 7,6, и прогревают при 70°С в течение 10 мин. ДНК отделяют путем хроматографии через сефа- декс G 100 в ТЕ-буфере (10 мМ трис- HCl, рН 8,0; 1 мМ ЕДТА) от невключенной радиоактивности. Радиоактивно меченный образец (проба) имеет удельную активность примерно 4 10 срм/мкг.
в. Скрининг клонов на содержание i вставок гена IFN.
Вмороженные в микротитр-пластины бактериальные культуры оттаивают (а). Кусок нитроцеллюлозного фильтра соот17
ветствующего размера (размер пор 0,45 мкм) помещают на LB-агар (LB- araprlO г/л триптона; 5 г/л дрожжевого экстракта; 5 г/л NaCl; 15 г/л бакто-агара; 20 мг/л тетрациклин- НС1). С помощью приспособленного к микротитропластинкам штампа индивидуальные клоны переносят на нитро- целлюлозный фильтр. Бактерии выра- щивают в течение ночи при 37 С до больших (диаметром примерно 5 мм) колоний. Для разрушения бактерий и денатурирования ДНК нитроцеллюлозные фильтры помещают по очереди на стоп- ку пропитанных следующими растворами фильтров из ватмана ЗММ:1 - на 8 мин в 0,5 М NaOH; 2 - на 2 мин в 1 М трис-HCl, рН 7,4; 3 - на 2 мин в 1 М трис-HCl, рН 7,4, и 4 - на
4мин в 1,5 М NaCl, 0,5 М трис-HCl, рН 7,4. Фильтры высушивают на воздухе и затем выдерживают 2 ч при SO°C. Предварительную обработку фильтров осуществляют в течение 4 ч при 65 С в растворе для гибридизации, состоящем из 6х SSC (lx SSC соответствует 0,15 М NaCl, 0,015 М тринатрийцитра.та, рН 7,0), 5 х раствора Денхардта (1х раствор Денхардта соответствует 0,02% PVP (поливинилпирролидон); 0,02% FicoII (молекулярный вес 40000 0,02% BSA (альбумин бычьей сыворотки и 0,1% SDS (додецилсульфата натрия). На фильтр берут примерно 1-10 срм пробы, приготовленной согласно (б), денатурируют кипячением и добавляют в гибридизационную смесь. Гибридизацию проводят в течение 16 ч при 65 С. Отмывку фильтра осуществляют при 65 С четырехкратной промывкой в течение 1 ч в буфере Зх SSC/01% SDS. Фильтры высушивают на воздухе, покрывают тонкой пленкой и экспонируют на пленке Кодак X-Omats.
П р и м е р 2. Перенос по Саузер- ну для подтверждения наличия IFN-гена в рекомбинантных плазмидах.
Из колоний, дающих положительный сигнал при радиоавтографии, выращи- вают культуры объемом 5 мл в течение ночи при 37°С в LB-среде (.10 г/л три тона; 5 г/л дрожжевого экстракта;
5г/л NaCl; 20 мг/л тетрациклина
х НС1). Плазмидную ДНК выделяют по Birnboim и Doly. 1,5 мл суспензии клеток центрифугируют и суспендируют при 0°С в 100 мкл лизисного раствора, состоящего из 50 мМ глюкозы;
.Q 5 0
5
0 о 5
0
5
5
19 18 10 мМ ЕДТА; 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, и 4 мг/мл лизоцима. Инкубируют 5 мин при комнатной температуре, добавляют 2 объема охлажденного льдом раствора (0,2 М NaOH и 1% SDS), инкубируют еще 5 мин, затем добавляют 150 мкл охлажденного льдом раствора ацетата калия, рН 4,8, и инкубируют в течение 5 мин. Образовавшийся осадок отделяют на центрифуге. Раствор ДНК экстрагируют 1 объемной частью смеси фенола с СНСЦ(1:1), ДНК осаждают добавлением 2 объемов этанола. После осаждения на центрифуге осадок в пробирке промывают однократно 70%-ным этанолом и высушивают в течение 5 мин в вакууме. ДНК растворяют в 50 мкл (ТЕ)-буфера. 10 мкл полученного раствора добавляют в 50 мкл реакционного буфера (10 мМ трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ MgClz; 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ), переваривают вместе с 10 ед. Pstl-рестрикционной эндонуклеазы в течение 1 ч при 37°С. Затем добавляют 1/25 объема 0,5 М ЕДТА; 1/4 объема 5х буфера, прогревают 10 мин при 70 С ДНК разделяют электрофоретически в 1%-ном агарозном геле (ТВЕ-буфер). ДНК Из агарозного геля по методу Сау- зерна переносят на нитроцеллюлозный фильтр. ДНК в геле денатурируют в течение 1 ч растворрм 1,5 М NaCl/ /0,5 М NaOH. Затем в течение часа нейтрализуют раствором 1 М трис х НС1, рН 8 (1,5 М NaCl).ДНК переносят в Юх SSC (1,5 М NaCl; 0,15 М цитрата нат- рия; рН 7,0) на нитроцеллюлозный фильтр. После полного переноса (примерно 16 ч) фильтр быстро споласкивают в 6х SSC-буфере, затем высушивают на воздухе и после этого прогревают в течение 2 ч при 80°С. Затем фильтр обрабатывают при 65 С в течение 4 ч с помощью 6х SSC/5x раствор Денхард- та/0, 1% SDS. Примерно 24О6 срм гибри- дизационной пробы денатурируют нагреванием до 100°С и затем вносят в раствор для гибридизации. Продолжительность гибридизации составляет 16 ч при 65 С.
П р и м е р 3. Обнаружение интер- фероновой активности в клоне Е76Е9.
100 мл культуры клона Е76Е9 выращивают в LB-среде (см. пример 2) при 37 С до оптической плотности А600 - - 0,8. Бактерии отделяют на центрифуге в течение 10 мин при скорости 7000 об/мин, промывают однократно
1915
раствором 50 мМ трис х НС1, рН 8,0, 30 мМ ДОаС1, суспендируют в 1,5 мл промывочного раствора. Инкубируют с 1 мг/мл лиоцима при 0°С в течение получаса, бактериальную суспензию пятикратно замораживают и оттаивают. Остатки разрушенных клеток осаждают путем центрифугирования в течение I ч при 40000 об/мин. Надосадочную Жидкость стерильно отфильтровывают и испытывают на интерфероновую ак- fHBHocTb. В качестве теста применяют бляшку редукционного теста с. V3- клетками и вирус Vesicular Stomati- t}is. Клон продуцируют до 9000 IV (международных единиц) интерферона на 1 л исходной культуры.
П р и м е р 4. Получение экспрес- с ивной плазмиды pRHW12 и экспрессивной плазмиды pRHWl1.
а. Получение плазмиды pRHWIO.
100 мкг плазмиды Р9А2 гидролизуют со 100 ед. рестрикционной эндонукле- азы Avail. После гидролиза фермент йнактивируют путем нагревания при 70°С и полученные фрагменты разделяют в 1,4%-ном агарозном геле с ТВЕ- буфером соответственно размеру. Полосу, которая содержит всю кДНК-встав- ку, электроэлюируют и очищают на Elutip-колонке, Из полученных 20 мкг 6 мкг далее гидролизуют с рестрикционной эндонуклеазой ЗаиЗА (20 ед. в 100 мкл раствора). Фрагменты раздели- ют в 2%-ном агарозном геле в ТВЕ-бу- фере. После окрашивания с помощью этидийбромида (EtBr) электроэлюиругот кусок ДНК длиной 189 Ьр и очищают аналогично описанному,
Для того, чтобы ген интерферона связать с промотором, местом связывания рибосомы и стартовым кодовом, соответствующий кусок ДНК изолируют из экспрессирующей плазмиды pER 33. Дпя этой цели 50 мкг pER 33 двукратно гидролизуют рекстрнкционными ферментами EcoRI и PvuII, полученные фрагменты фракционируют соответственно их размеру в 1,4%-ном агарозиом геле в ТВЕ-буфере. Кусок ДНК длиной 389 Ьр, который содержит Тгр-промо- тор, место связывания рибосомы и ста товый /инициирующий) кодон, электро- эдюируют и очищают с помощью Elutip- колонки. Полученный фрагмент затем гйдролизируют с ЗаиЗА и получают требуемый фрагмент длиной 108 Ьр путем электрофореза в агарозном геле, элек0
4:
Q 5
5 0 5 40
45 50 5
920 роэлюирования и очистки на колонке Elutip с выходом примерно 100 нг.
20 нг фрагмента о лигируют при 14°С в течение 18 ч с 20 нг фрагмента с в объеме 40 мкл при применении
10ед. Т4-лигазы в растворе, который содержит 50 мМ трис-HCl, рН 7,5;
10 мМ MgCl4; 1 мМ DTT и 1 мМ АТР. Затем фермент инактивируют путем нагревания до 70 С и полученную ДНК разрезают Hind.Ill в объеме 50 мкл.
10 мкг экспрессивной плазмиды pER 103 линеаризируют с помощью Hind III в объеме 100 мкл. Инкубируют 2 ч при 37°С, добавляют 1 объем 2-фосфатаз- ного буфера (20 мм трис-HCl, рН 9,2; О,2 мМ ЕДТА) вместе с 1 ед. фосфа- тдзы телячьего кишечника (CIP). После 30 мин при 45°С добавляют следующую единицу CIP и инкубируют еще раз в течение 30 мин. Полученную таким образом ДНК очищают двукратной феноль- ной экстракцией, однократной экстракцией СНС1 }, осаждают добавлением 1/10 объема 0,3 М ацетата натрия (рН 5,5) и 2,5 объемами этанола.
iOO нг линеаризированного pER 103 и лигированных фрагментов S и с (после Hind Ill-гидролиза) вносят в 100 мкл раствора, содержащего лигаз- ный буфер, и лигируют при 14°С в течение 18 ч с помощью Т ДНК-лигазы.
200 мкл компетентной Е. coli НВ 101 смешивают с 20 мкл легирующей смеси и инкубируют в течение 45 мин на льду. Затем поглощение ДНК полностью прекращают тепловым нагревом в течение 2 мин при 42°С. Суспензию клеток инкубируют 10 мин на льду и наносят на LB-arap, содержащий 50 мг/л ампициллина. Из полученных 24 колоний выделяют плазмид- ную ДНК по методу Birnboim и Doly. После гидролиза с различными .рестрик- ционными ферментами плазмида имеет желательную структуру. Она получила название pRHWIO.
б. Получение плазмиды pRHW12.
Примерно 10 мкг плазмиды pRHWIO разрезают Вага HI, затем добавляют фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 и 4 дезоксинуклеозидтрифосфата и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Полученную линеаризированную плазмиду с тупыми концами очищают фенольной экстракцией и осаждением спиртом. После этого разрезают рестрикционной эндонуклеазой Ncol в
21
объеме 1 00 мкл. Больший фрагмент получают путем электрофореза в агарозном геле, электрсэлюирования и очистки на Elutip. Фрагмент о. получают лутем гиролиза 4 мкг Avail-фрагмента, которы содержит Р9А2-кДНК-вставку, с Ncol и Alul, причем получают примерно 2 мкг фрагмента.
В последней стадии лигирования фр мент а и добавленный к нему двукратно гидролизованный BamHI/Ncol pRHWIO лигируют в объеме 10 мкл, причем каждой ДНК используют по 10 иг. Лигирование достроенного Вага HI-сайта рестрикции Alul дает снова Ват HI-сайт рестрикции. I
Полученной после лигирования смесью трансформируют компетентные клетки Е. coli HB 101 аналогично описанному. Из полученных 40 колоний выбирают одну, она получила название pRHW12.
Плазмиду изолируют и EcoR I/Bam HI-вставку секвенируют дидезокси- методом. Плазмида имеет ожидаемую последовательность.
в.Получение плазмиды pRHWl1. Осуществляют аналогично примеру
NcoI-AluI-фрагмент выделяют из клона Е76Е9 аналогично примеру 4б. Затем 10 нг векторной части лигируют с 10 нг кДНК-части в объеме 10 мкл в соответствующих условиях и при при- менении 1 ед. Т4-лигазы. Полученной смесью ДНК трансформируют Е. coli НВ 101. Селекцией полученных 45 колоний на содержащих ампициллин LB-чаш ках выбирают клон, который обозначают pRHWll. Выращивают соответствующий клон, выделяют плазмидную ДНК. Ее структуру подтверждают наличием нескольких специфических мест разреза рестрикционной эндонуклеазой (Alul , EcoRI, HindiII, Ncol, PstI).
г.Экспрессия интерфероновой активности клетками Е. coli KB 101, содержащими плазмиду pRHW12.
о 5
0
5
0
Q
с Q
5
1922
100 мл бактериальной культуры инкубируют до оптической плотности 0,6 при 600 им в минимальной среде М9, которая содержит все аминокислоты за исключением триптофана (20 мкг/мл на аминокислоту); 1 мкг/мл тиамина; 0,2% глюкозы и 20 мкг/мл индол-(3)- актиловой кислоты (IAA), индуктор триптофан-оперона. Затем бактерии осаждают путем центрифугирования (10 мин при 7000 об/мин), промывают однократно буфером 50 мМ трис-НС1, рН 8; 30 мМ NaCl, суспендируют в 1,5 мл этого же буфера. Инкубируют в течение 30 мин с 1 мг/мл лизоцина на льду, бактерии 5 раз замораживают и оттаивают. Обломки клеток удаляют центрифугированием в течение 1 ч при 40000 об/мин. Надосадочную жидкость стерильно фильтруют и испытывают на интерфероновую активность в анализе по методу уменьшения пятна при применении человеческих А549 клеток и Encophalomyocarditis-вируса.
Результат: 1 л приготовленной бактериальной культуры содержит 1-10 международных единиц интерферона.
Формула изобретения
Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК pRHWl1 или pRHW12, кодирующей омега-интерферон, включающий обработку плазмиды Р9А2 или Е79Е9 эндонуклеазой Avail, выделение вставки кДНК, обработку полученного фрагмента эндонуклеазой Sau3A с последующим выделением фрагмента размером 189 п.о., обработку плазмиды энзима- ми EcoRI и PvuII, обработку полученного Фрагмента размером 389 п.о., содержащего trp-промотор, место рибом- ного связывания и стартовый кодон, эндонуклеазой ЗаиЗА, выделение фрагмента размером 108 п.о., лигирование полученного фрагмента с фрагментом размером 189 п.о. с помощью ДНК-ли- газы, обработку полученной плазмидной ДНК эндонуклеазой Hindlll, де- фосфорилирование, лигирование полученных фрагментов, трансформирование рекомбинаитными плазмидными ДНК штамма бактерий Е. coli KB 101, культивирование штамма, выделение плазмиды pRHWIO, обработку плазмиды pRHWIO эндонуклеазой Bam HI, инкубирование в присутствии фрагмента Кленова ДНК- полимеразы 1 и четырех дезоксинукле23,157241924
озидтрифосфатов, обработку эндонукле- которая в HindlII-сайте плазмиды pER азой Ncol с последующим выделением 103 содержит ДНК фрагмент со следую- большего фрагмента плазмиды pRHWIO, щей нуклеотидной последовательностью:
Hindlll SauA Ncol
aAGCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA50
ACACCTTGGT GCTTCTGCAC САААТСАППА GAATCTCCCC TTTCTTGTGT100
CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG150
CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC200
ACATCACACA TCTTTAagctt SauSA Hindlll
лигирование полученного фрагмента с i ботку полученной вставки кДНК энзина- фрагментом NcoI-AlulI плазмиды Р9А2 ми Ncol и Alul со следующей нуклео- или Е79Е9, полученные путем перевари- тидной последовательностью: вания плазмиды эндонуклеазами, обраCAT GGG СТА СТТ AGC AGG AAC ACC TTG 28
Ncol GTG СТТ CTG САС САА АТС AGG АСА АТС ТСС ССТ ТТС TTG TGT СТС 73
AAG GAG AGA AGA GAG TTC AGG ТТС CCC CAG GAG ATG СТА AAA GGG 118 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 163 CTG CAG САС АТС ТТС AGC CTC ТТС САС АСА GAG CGC TCC TCT GCT 208
GCC TGG AAC ATG ACC CTC СТА GAG CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT252
CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA298
GAA GGA GAA TCT GCT GXG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG343
AGG AGG TAG TTC CAG GGA АТС CGT GTC TAG CTG AAA GAG AAG AAA388
TAG AGC GAG TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA АТС ATG AAA433
TCC TTG TTC TTA TCA АСА AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA ACT AAA478
GAT AGA GAG CTG CGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA530
TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCT TATTTCGG.CTTTAATCAC589
AGAATTGACTGAATTAGTTGTCCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA648
AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT707
TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC766
TTTACATTGTATTAACATAACAAAACATCTTCAGct802
Alul iт
где X - нуклеотид С или А,рекомбинантной плазмидной ДНК с посхроматографин, лигирования и трансфер- ледующим выделением целевого продукта, мации штамма бактерий Е. coli НВ 101 so
Составитель Н. Кузенкова Редактор М. Петрова Техред М.ДидыкКорректор Н.Король
Заказ 1524Тираж 498Подписное
РЦИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101
