ш
с
Изобретение относится к генетической инженерии и касается способа получения плаэмидной ДНК, кодирующей гормон роста крысы или человека.
Способ заключается в выделении мРНК из гипофиза, удвоении полученной РНК, получение однДНК с помощью обратной транскриптазы, удвоение полученной ДНК, отбор нужной фракции днДИК и ее клонированию в pBR 322.
Пример 1. Культивируемые клетки гипофиза крысы (подклон семейства клеток GH-1), полученные из Американской коллекции типовых культур, используют ся в качестве источника мРНК для синтеза гормона роста крысы. В этих клетках, если рост осуществляется в нормальных условиях, мРНК гормона роста содержится в небольших ко- личествах, от 1 до 3% от общего содержания РНК, имеющей поли - А, Однако, содержание мРНК гормона роста значительно увеличивается по сравнению с содержанием других мРНК клеток в результате стимулирующего действия тироидных гормонов и глюкокортикои- дов. РНК вьщеляют из 5-10 клеток, выращиваемых в суспензии, в которую с целью получения гормона роста за 4 дня до сбора клеток добавляют i iMonb дезоксиметазона и 10 ммоль Ъ-трИ1 од- тирона. Полиаденилированную РНК выделяют из цитоплазменных разделяющих мембран культивируемых клеток извест- ными способами,
Полиаденилированную РНК выделяют при помощи хроматографического анализа всего препарата РНК на олиго(дТ)- целлюлозе.
Обратная транскриптаза, выделенная из вируса, avian myeloblastosis, была получена от докт. Д.Дж.Берда, фирма Лайф Сайенс Инк., Санк-Петербург, Флорида ; ее используют для того, что- бы скопировать полную молекулу поли- аденилированной РНК, полученную из культивируемых клеток в кДНК, Реакции осуществляют в растворе 50 ммоль трис НС1, рН 8,3, 9 ммоль. MgCl. 30 ммоль хлорида натрия, 20 ммоль бета-меркап- тоэтанола, 1 ммоль каждого из трех нерадиоактивных деоксирибонуклео зид трифосфатов, 250 ммоль четвертого де- оксинуклеозид трифосфата, меченого 32Р в альфа-позиции, с удельной радиоактивностью 50-200 Ки/моль 20 мкГ/мл олиго д Т 12-18, полученного от фирмы (оллаборатив Рисерч, Вапьтман, Массачузетс, 100 мг/мл полиаденилированной РНК и 200 ед./мл обратной транскрип- тазы. Смесь инкубируют при А5 С в течение 50 мин. После добавления ЭДТК- Na, 25 ммоль, раствор экстрагируют при помощи насыщенного водой фенола, далее водяной слой подвергают хроматографии на Sephadex G-100, с колонной диаметром 0,3 см и высотой 10 см, в смеси Ю ммоль трис-НС1, рН 9,0, 100 ммоль хлорида натрия, 2 ммоль ЭДТК. Нуклеиновую кислоту, элюирован- ную в пустой объем, осаждают при помощи этанола после добавления ацетата аммония до 0,25 м, рН 6,0. Осадок собирают при помощи центрифугирования, полученную таблетку растворяют в 50 мл свежеприготовленного 0,1 М раствора гидрата окиси натрия и инкубируют при в течение 20 мин с целью гидролиза РНК. Смесь нейтрализуют с добавлением Ш раствора ацетата натрия, рН 4,5, а полученную 32 Р-кДНК осаждают при помощи этанола, а затем вновь растворяют в воде. Отдельные порции кДНК, состоящей из одной нити анализируют на натуральных полиакрил- амидных гелях. Гели сушат, кДНК меченую 32Р, анализируют при помощи авторадиографии с использованием пленки Kodax No-Sereen-2T (фирменная марка, фирма Истиэн Кодак Корпорейшн, Рочестер, Нью-Йорк). После разделе ния при помощи электрофореза на геле обнаруживают слабую полосу поглощения, соответствующую ДНК с примерно 800 п.о
Полученную кДНК, состоящую из одной нити, обрабатывают обратной транс криптазой с целью синтеза комплементарной нити..Реакционная смесь содержит 50 ммоль трис-НС1, рН 8,3, 9 ммоль MgCl, 10 ммоль дитиотрей- тола, 50 ммоль трех немеченых деокси- рибонуклеозид трифосфатов, 1 ммоль меченого 32Р в позиции альфа нукле- озид трифосфата с удельной радиоактивностью 1-10 Хи/ммоль 50 МКГ/МЛ кДНК и 220 ед,/мл обратной транскриптазы. Реакционную смесь инкубируют при 45 С в течение 120 мин. Реакцию прерывают добавлением ЭДТК- Na до 25 ммоль, экстрагируют фенолом и подвергают хроматографическому анализу на Sephadex G-lOO, а затем осаждают этанолом. Порции продукта реак1.1яи с показателем от 500 отсчетов в минуту до 100 отсчетов в минуту анализируют при помощи
электрофореза на геле. При помощи сравнения со стандартными образцами устанявливанзт, что полоса поглощения гетеродисперсоида сосредоточена вокруг 800 нуклеотидов по длине.
Обработка полной кДНК, на которой скопирована структура мРНХ клетки гипофиза крысы, эндонуклеазой Hha I приводит к образованию двух основных фрагментов ДНК, причем один содержит примерно 320 нуклеотидов (фрагмент А), а второй 240 нуклеотидов (фрагмент в). Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов А и В проводят как вьше бьшо описано Махат and Gilbert, что подтверждает следующий факт: эти фрагменты являются в действительности теми частями, на которых содержится генетический код, кодирующий синтез гормона роста крысы.
При расщеплении днкДНК, содержащей 800 п.о. эндонуклеазой Kha Т,среди основных продуктов рассечения обнаруживают два фрагмента, соответствующие по длине фрагментам А и В.
Так как кДНК, контролирующую синтез гормона роста крысы, содержащую приблизительно 800 п.о., подвергают очистке перед обработкой эндонуклеазой Hha I, ДНК необходимо подвергнут обработке с тем, чтобы удалить все несоединенные концы. В реальных условиях обработку с целью удаления таких непарных KOHI;OB проводят перед стадией разделения на электрофорезе в смеси, содержащей 25 мкл 60 ммоль трис-НС1, рН 7,5, 8 ммоль хлорида магния, 10 ммоль бета-меркаптоэтано- ла, 1 ммоль АТФ и 200 ммоль каждого из аАТФ, dUTO, dГTФ и dTTO. Смесь инкубируют с полимеразой I ДНК (1 ед.) выделенной из штамма Е. coli при 0°С в течение 10 мин с тем, чтобы экзонуклёаолитическим способом удалить все выступающие 3 -концы и заполнить все 5 -выступающие концы, По лимераза I ДНК производится фирмой Боехрингер-Маннгейм Биокемикалз, Индианаполис, Индиана.
кДНК, контролирующую синтез гормона роста крысы и содержащую приблизительно 800 п.о., обрабатывают при по
обрабатывают 30 ед. нуклеазы SI, имеющей активность 1200 ед./мл, которая была получена от фирмы Майлс Лабора- ториз, Элкхарт. Индиана, в смеси, содержащей 0,03 ммоль ацетата натрия, рН 4,6, 0,3 ммоль хлорида натрия,
4.5ммоль хлорида цинка, при 22 С в течение 30 мин, а затем инкубируют еще в течение 15 мин при . С целью прекращения ферментной реакции в смесь добавляют трис-основание с конечной концентрацией 0,1 ммоль ЭДТК до 25 смоль и тДНК.
После экстрагирования этанолом ре- акцио шой смеси и хроматографическо- го анализа на Sephadex G-100, 32 р- кДНК, элюированную в пустой объем, осаждают при помоши этанола. В результате такой обработки обеспечивается высокий выход молекул кДНК, концы которой связаны основанием. Линкер Hind III лигируют с кДНК осуществляют при помощи инкубации при 14 С в смеси 66 ммоль трис-НС1, рН 7,6,
6.6ммоль хлорида магния, 1 ммоль АТФ, 10 ммоль дитиотрейтола, 3 ммоль декамера Hind ITT с показателем 10 отсчетов в 1 мин/мол и лигазы ДНК Т4,
приблизительно 500 ед./мл, в течение 1 ч. Чтобы дезактивировать лигазу, реакционную смесь нагревают до 65 С, которую поддерживают в течение 5 мин. Предварительно к ферментам, содержа- 1ЦИМ 150 ед./мл Hsu I или Hind III добавляют КС1 с конечной концентрацией 50 ммоль, бета-меркаптоэтанол с конечной концентрацией 1 ммоль и ЭДТК с конечной концентрацией
0,1 ммоль. Смесь № держивают в течение 2 ч при 37 С. Эндонуклеазы Hind III и Hal III производятся фирмой Нью-Инглэнд Био-Дэбо, Беверли, Массачузест. Продукт реакции анализиpywT при помощи электрофореза на геле в соответствии с примером; при этом обнаруживают пик, соответству- последовательности приблизительно 450 нуклеотидов, наряду с отдельными фрагментами рассеченного дека- мера Hind III. Плазмиду pBR-322, со- держап1ую ген, контролируюпгий устойчивость к ампицилину и единственное место узнавания для фермента Hind ТТГ,
Изобретение относится к области генетической инженерии и касается способа получения плазмидной ДНК, кодирующей гормон роста крысы или человека. Способ заключается в выделении мРНК из гипофиза, удвоении полученной РНК, получении однДНК с помощью обратной транскриптазы, удвоении полученной кДНК, отборе нужной фракции днДНК и ее клонировании в pBR 322, 2 табл.
мощи добавления химически синтезиро- 55 внутри вьшеупомянутого ванного линкера Hind III.гена, рассекают в месте узнавания
Полученн1,Й в результате реакции для Hind III эндонуклеазой Hsu I, за- продукт, молекула которого состоит из тем обрабатывают щелочнггм фосфатом двух нитей, с концентрацией 2-5 мкг/мл типа EAPF фирма Уортингтон Биокемикал
Корпорейшн, Фрихольд, Нью-Джерси.Фермент находится в реакционной смеси с концентрацией 0,1 ед. микрограмм ДНК реакционную смесь инкубир тот в 25 ммол трис-НС1 при рН 8 в течение 30 мин при 65 С, затем, чтобы удалить фос- фатазу, производят экстрагирование в феноле. После обработки фосфатазой плазмиднуго ДНК разрезают Hind III эндонуклеазой и лигир тот концы молекулы} в молярном отношении 3 моль плазмида на I моль кДНК. Смесь инкубируют в смеси 66 ммоль трис-НС1, рН 7,6, 6,6 ммоль хлорида магния, 10 ммоль ДИтиотрейтола и i ммоль АТФ в течение 1 ч при в присутствии 50 ед./мл лигазы ДНК Т4.
Смесь, в которой протекает лигация, добавляют непосредственно в сус- 20 венных гипофизов человека, быстро запензию штамма Е. coli Х-1776. При этом клетки вьфащивают до удельной плотности примерно 210 кл./мл в 50 мл среды, содержащей: триптон 10 г/л; экстракт дрожжей 5 г/л, хлорид натрия 0 г/л, гидрат окиси натрия 2 ммоль; диаминопимеллиловая кислота 100 мкг/мп, тимин 40 мкг/кп при 37 С. Клетки собиразот при помощи обработки на центрифуге в течсмше 5 мин со скоростью 5000 Гт при 5 С, вновь суспендируют в 20 мл холодного раствора хлорида натрия, 1 О ммоль подвергают центрифугированию вновь суспендируют в 20 мл буффера трансформации, содержащем 75 ммоль CEiCl, 140 ммоль хлорида натрия и 10 ммоль трис-ИС1, рН 7,5, затем смесь выдерживают в течение 5 мин на льду. Далее, клетки центрифугируют и вновь, суспендируют в. буффере трансформации 0,5 мл. Трансформацию осуществляют при помосц смещения 100 мкл суспензии клеток с 50 мкя рекомбината ДНК (1 г/мл). Смесь инкубируют при в течение 15 мин, затем в те0°С
чение 4 мин при 29 С и, наконец, в течение 30 мин вновь при О С, Далее, клетки переносят на растительный агар для роста в селективных условиях,
Рекомбинированные колонии отбирают при помощи выращивания на питательной среде, содержащей ампицилин если рост не обнаруживается, то на питательной среде, содержащей тетрациклин с концентрацией 20 г/мп. Было получено 10 таких колоний клеток, каждая из которых содержит плазмиду
с приблизительно 800 п.о., молекула которой разрывается под воздействием фермента Hind TIT.
ДНК гармона роста крысы, содержащую 800 п.о., вьщеляют в препаративных количествах из рекомбинированно- го клона рГРК-1 и ее последователь- ность нуклеотидов анализируют.
Последовательность мРИК, полученная из генетической последовательности, представлена в табл. 1.
Выделение мГНК, гормона роста человека ГРЧ проводят по примеру 1} только в этом случае биологическим источником материала является ткань гипофиза человека. Пять доброкачестмороженных в жидком азоте после хирургического удаления, вес которых составляет от 0,4 до 1,5 г каждый, оттаивают и тонко измельчают в 4М раст25 вора гуанидин тиоционата, содержащем 1М буферный раствор меркаптоэтанола, рН 5,0, при 4°С. Гомогенат наслаивают на 1,2 мл 5,7-молярного раствора хлорида цезия, содержащего 100 ммоль
30 ЭДТК и центрифугируют в течение 18 ч со скоростью 37000 об/мин на ультра- центрифуге Бекман с ротором типа SW 50,1 (фирма Бекман Инструмент Компа- ни, Фуллертон, Калифорния). При этом
35 РНК собирают на дне пробирки. Далее, проводят очистку с использованием колонны на олиго-дТ и осаждения при помощи градиентного раствора сахарозы в соответствии с примером. Примерно
40 10% выделенной таким образом РНК содержит генетический код для синтеза гормона роста, этот факт устанавливается введением радиоактивного предшествующего соединения, содержащего
45 аминокислоты, в гормон, подавляющий рост, который выпадает в осадок в системе клеток, в которых не происходила трансляция, полученных из эмбриона ПУШНИЦЫ.
50
Получение кДНК гормона роста человека проводят в соответствии с примером 1. кДНК гормона роста фракционируют при помощи электрофореза на ге- 55 ле и материал, который перемещают в положение, соответствующее примерно 800 нуклеотидов по длине, выбирают для.размножения. Выбранную фракцию обрабатывают полимераяой I ДНК в соот11Д36887
ветствии с примером 1, затем обрабатывают с целью объединения концов линкером Hind TII. Далее, кДНК рекомби- нируют с плазмидой pBR-322, которую предварительно обрабатывают щелочной фосфатазой в присутствии ДНК лигазы. Е, coli Х-1776 трансформируют реком- бинантной ДНК, а затем штамм, содер- жа1 1ий ДНК гормона роста, извлекают. Штамм, содержащий ДНК гормона роста, выращивают в препаративных количест- вах, из него выделяют ДНК гормона роста, а затем определяют последовательность нуклеотидов. Было установФ
пл ро ин су мР но ку тр кД dA 1& 10 ще Hi ни пл
10
лено, что выделенная ДНК гормона роста содержит нуклеотиды, содержащие информацию для синтеза полной последовательности аминокислот гормона роста человека. Первые 23 аминокисло- 20 работанной Hind III и щелочной фосСпособ получения рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей гормон роста крысы или человека, включающи инкубирование клеток гипофиза в при сутствии 1 ммоль дезоксиметазона и 10 ммоль 1-трийодтирона, отделение мРНК от цитоплазматической мембранной фракции клеток гипофиза, очистку и синтез кДНК с помощью обратной транскриптазы, инкубиробание смеси кДНК с ДНК полимеразой в присутстви dATO, аГТФ, ацТФ и аТТФ при рН 7,5 1& 10 С,,вьщеление фракции кднДНК, имею щей 800 п.о,, добавление линкеров Hind III к вьделенной днДНК, смещива ние днДНК с ДНК, полученной из плазниды pBR 322, предварительно об
фатазой при рН 8,0 и в течение
ты гормона роста имеют вид: H N-ФЕ- Про-Тр-1ле-Про-Леу-Сер-Арг-Леу-Фе- Асп-Аск-Ала-Мет-Леу-Арг-Ала-Хис-Арг- Леу-Хис-Глто-Леу. Остаток последовательности представлен в табл. 2,
работанной Hind III и щелочной фос8Формула изобретения
Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей гормон роста крысы или человека, включающий инкубирование клеток гипофиза в присутствии 1 ммоль дезоксиметазона и 10 ммоль 1-трийодтирона, отделение мРНК от цитоплазматической мембранной фракции клеток гипофиза, очистку и синтез кДНК с помощью обратной транскриптазы, инкубиробание смеси кДНК с ДНК полимеразой в присутствии dATO, аГТФ, ацТФ и аТТФ при рН 7,5 и 10 С,,вьщеление фракции кднДНК, имеющей 800 п.о,, добавление линкеров Hind III к вьделенной днДНК, смещива- ние днДНК с ДНК, полученной из плазниды pBR 322, предварительно об
20 работанной Hind III и щелочной фосфатазой при рН 8,0 и в течение
30 мин с последующим инкубированием
смеси в течение 1 ч при 1А и рН 7,6
в присутствии АТФ и ДНК лигазы и экс тракцией полученной рекомбинантной ДНК.
в tf ж с to м н
