Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в медицине.
Целью изобретения является разработка способа получения рекомбинант- ной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность инсулина, а также повышение эффективности ферментативного соединения k-ДНК с гидролизован- ным вектором переноса при одновремен ном уменьшении числа выбранных реком- бинантов.
Пример 1. В поджелудочную железу крысы под наркозом вводят солевой раствор Хенкса с помощью обрат ного вливания в проток железы. Затем поджелудочную железу удаляют, дезагрегируют в растворе Хенкса при 0°С и обрабатывают коллагеназой и ингибитором трипсина, полученного из соевых бобов. Все стадии осуществляю при 0-4°С, если не оговорено иначе. Две измельченные поджелудочные железы вместе с раствором Хенкса объемом 8 мл помещают в стеклянную пробирку объемом 30 мл. Все стеклянные пробирки предварительно обрабатывают силиконом. Смесь для выращивания содержит 12 мг коллагеназы - фермента, выделенного из Clostridium histolyti- cum, и 1 мг ингибитора трипсина. Выращивание осуществляют при 37°С в течение 25 мин при встряхивании со скоростью 90 тактов в минуту.при постоянном контроле процесса ферменто- лиза После инкубации пробирку центрифугируют со скоростью 200 G в течение 1 минуты. Верхний слой сцеживают, а осадок промывают раствором Хенкса, процедуру отмывки повторяют 5 раз. Осадок после промывки суспендируют в 15 мл фикола с плотностью 1,085, Затем добавляют 8 мл фикола с плотностью 1,080 и 5 мл фикола с плотностью 1,060, Пробирку последовательно центрифугируют 5 мин со скоростью 500 G и 5 мин со скоростью 2000 G, Искомые клетки поднимаются по градиенту плотности и образуют колонию между двумя верхними слоями. Клетки содержат примеси клеток ган- глиона, лимфатических узлов и соединительной ткани, которые должны быть удалены, например, микропипеткой под контролем микроскопа.
Препарат клеток разбавляют раствором Хенкса и центрифугируют. Осадок клеток замораживают в жидком азоте.
Искомые клетки, выделенные из поджелудочной железы 200 крыс, гомогенизируют в растворе, содержащем 4М гуа- нидинтио-ционата и Ш -меркаптоэта- нола; буферный раствор обеспечивает рН 5,0; температура раствора 4°С, Полученный гомогенат наслаивают на 1,2 мл 5,7 М раствора хлорида цезия, содержащего 100 мМ ЭДТА, и затем ценW трифугируют 18 ч со скоростью
37000 об/мин, РНК оседает на дно пробирки,
Полиаденилированную РНК выделяют с помощью хроматографического анализа
всего препарата РНК на олиго(дТ)-целлюлозе ,
Обратную транскриптазу используют для копирования полной молекулы поли- аденилированной РНК, полученной из области Лангерханса крысы, на k-ДНК, Реакцию осуществляют в.растворе, содержащем 50 мМ трис-НС (рН 8,3), 9 мМ MgCe, 30 мМ NaCE, 20 мМ /}-мер- каптоэтанола, 1 мМ каждого из трех нерадиоактивных деоксирибонуклеозид- трифосфатов, 250 мМ четвертого деок- синуклеозидтрифосфата, меченого of-32 р с удельной радиоактивностью 50 - 200 Ки/моль, 20 мкг/мл олиго-дТ -гл 100 мг/мм полиаденилированной РНК и 200 ед/мл обратной транскриптазы. Смесь инкубируют при 45°С в течение 15 мин. После добавления 25 мМ ЭДТА20
25
30
Na раствор зкстрагируют насыщенным
водой фенолом. Водяной слой хромато- графируют на сефадексе G-100 в колонке высотой 10 см и диаметром 0,3 см в смеси 10 мМ трис-НСЕ, рН 9,0, ЮОмМ NaCE., 2 мМ ЭДТА, Нуклеиновую кислоту из элюата осаждают этанолом после добавления ацетата аммония до 0,25 М, рН 6,0, Собирают осадок при помощи центрифугирования. Осадок растворяют в 50 мМ свежеприготовленного 0,1 М раствора NaOH и инкубируют при в течение 20 мин для гидролиза РНК, Смесь нейтрализуют 1М раствором ацетата натрия (рН 4,5) и полученную 32р и-ДНК осаждают этанолом и повторно растворяют в воде. Отдельные порции k-ДНК, состоящей из одной нити, анализируют на натуральных полиакрил- амидных гелях или сушат, и ДНК, меченую 32р, анализируют с помощью ав- торадиографии с использованием пленки Kodak №-sereen-2T, Установлено, что k-ДНК представляет собой гетеродис- персоид, содержит по крайней мере
313
один известный тип k-ДНК, молекула которой содержит около 450 нуклео- тидов.
Пример 2. Полученную в примере 1 k-ДНК, состоящую из одной ни- ти, обрабатывают обратной транскрип- тазой для синтеза комплементарной нити. Реакционная смесь содержит 50 мМ трис-НСЕ (рН 8,3), 9 мМ MgC мМ дитиотрейтола, 50 мМ трех немеченных деоксирибонуклезидтрифосфатов, 1 мМ меченого 32р в порции нуклеозидтри- фосфата с удельной радиоактивностью 1-10 Ки/ммоль, 50 мкг/мл k-ДНК и 220 ед/мл обратной транскриптазы. Ре акционнуто смесь инкубируют при в течение 120 мин. Реакцию останавливают добавлением ЭЦТА- а до 25 мМ, экстрагируют фенолом и подвергают хроматографическому анализу на сефа- дексе G-100, а затем осаждают этанолом. Порции продукта реакции с показателем от 500 до 1000 отсчетов в минуту анализируют с помощью электрофореза на геле. Полоса поглощения ге теродисперсоида сосредоточена вокруг 450 нуклеотидов по длине.
Порции ДНК, полученные по примерам 1 и 2, порознь обрабатывают пищеварительными ферментами с избытком эндонуклеазы ограниченная НаеIII и аналогичным образом анализируют с помощью гелевого электрофореза. Молекулы обоих продуктов рассекают эндо- нуклеазой. Полосы, полученные в ре- зультате рассечения молекулы k-ДНК из двух нитей, имеют ту же длину, что и полосы, полученные при анализе рассеченной молекулы k-ДНК, состоящей из одной нити.
Пример 3. Полученную в примере 2 молекулу из двух нитей с концентрацией 2-5 мкг/мл обрабатывают 30 ед. нуклеазы S1, имеющей активность 1200 ед/мл, в смеси, содержащей 0,03 М ацетата натрия (рН 4,6), 0,ЗМ NaCE, 4,5 М ZnCe, при в течение 30 мин, а затем инкубируют в течение 15 мин при 10°С. Реакцию останавливают добавлением трис-основания до конечной концентрации О,1 М, ЭДТА до 25 мМ и т-РНК, выделенной из Е.со- fi, до 40 мкг/мл. После экстрагирования этанолом реакционной смеси и хро- матографического анализа на сефадексе G-100 32р-k-ДНК, элюированную в пустой объем, осаждают этанолом. Такая обработка обеспечивает высокий выход
994
молекул с ДНК, концы которой связаны основанием. Лигацию декамера Hind III с k-ДНК осуществляют инкубацией при в смеси 66 мМ трис-НСЕ (рН7,6), 6,6 мМ MgCC, , 1мМ ЛТФ, 10 мМ дитиотрейтола, 3 мМ декамера Hind III с показателем 10 отсчетов в мин/мол и лигазы ДНК Т4 приблизительно 500 ед/мл на протяжении одного часа. Для дезактивации лигазы реакционную смесь нагревают до 65°С в течение 5 мин. Предварительно к пищеварительным ферментам, содержащим 1.50 ед/мл HSu I или Hind III, добавляют КСЕ до конечной концентрации 50 мМ, деактивируя лигазу, /i-меркаптоэтанол до конечной концентрации 1 мМ и ЭДТА до конечной концентрации О,1 мМ, смесь выдерживают 2 ч при 37°С. Продукт реакции анализируют электрофорезом на геле. Обнаружен пик, соответствующий последовательности приблизительно 450 нуклеотидов наряду с отдельными фрагментами рассеченного декамера Hind III
Пример 4. Плазмид рМВ-9 ДНК рассекают в месте узнавания для Hind III эндонуклеазой HSu 1, затем обрабатывают щелочной фосфатазой типа BAPF. Фермент присутствует в реакционной смеси в концентрации 0,1 ед/мк ДНК; смесь инкубируют в 25 мМ трис- HCL при рН 8 в течение 30 мин при 65°С, затем для удаления фосфатазы экстрагируют фенолом. После осаждения этанолом фосфатазу, обработанную плазмидой ДНК, добавляют в k-ДНК, содержащую фермент Hind III, соединяющий концы молекулы, в молярном отношении 3 моль плазмиды на моль k-ДНК. Смесь инкубируют в растворе, содержащем 66 мМ трис-HCl (рН 7,6), 6,6 мМ MgCEj, 10 мМ дитиотрейтола и 1 мМ АТФ, в течение 1 ч при в присутствии 50 ед/мл лигазы ДНК Т4.
Смесь, в которой протекает лига- ция, добавляют в суспензию штамма E.cofi х-1776. Предварительную культуру Е.соН выращивают до удельной плотности 2-10 кл/мл в 50 мл среды, содержащей триптон 10 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л, Na.Cf 10 г/л, NaOH 2 мМ, диаминопимелиновую кислоту 100 мкг/мл и тимин 40 мкг/мл, при 37 С. Клетки отделяют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 5000 G при , осадок суспендируют в 20 мл холодного раствора 10 MMNaCl, повторно центрифугируют в. тех же ус513
ловиях, вновь суспендируют в 20 Мл буфера трансформации, содержащего 75 мМ CaCEj, UO мМ NaCE и 10 мМтрис рН 7,5, затем смесь выдерживают 5 мин на льду. Клетки центрифугируют и вновь суспендируют в 0,5 мл буфера трансформации. Трансформацию осуществляют путем смешения 100 мл суспензии клеток с 50 мл рекомбинанта ДНК (1 мкг/мл). Смесь инкубируют при в течение 15 мин, затем 4 мин при 25 С и 30 мин при 0°С. Затем клетки переносят на питательную среду для выращивания в селективных условиях.
Отбор клеток для рекомбинй эованной плазмиды осуществляют в условиях, когда в среде присутствует тетрациклин в концентрации 5 мкг/мл, с целью трансформации мест узнавания фермента Hind in. Вьщеляют рекомбинант paU-1. Препараты неочищенной плазмиды, содержащие 2-5 мкг ДНК, и вьзде- ленной из рекомбинанта pAU-1 обрабатывают избыточным количеством эндо- нуклеазы S1. В препараты добавляют ЭДТА-Ыа до конечной концентрации 10 мМ и 10%-ный раствор (в/о) цукро- зы. Смесь наносят на 8%-ный полиак- риламидный гель. ДНК имеет примерно 410 пар оснрваний по длине.
Пример 5. ДНК, полученную из pAU-1 (пример 4), подвергают очист
Редактор М. Келемеш Техред М.Ходанич
Заказ 1645/58 Тира 500 . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР
по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
0
5
0
996
ке электрофорезом на 6%-ном полиак- риламидном геле. После элюирования из геля ДНК метят путем инкубирования с у-32р-АТФ и ферментом (поли- нуклеотидной киназой), выделенным из штамма Е.СоН. Меченую ДНК рассекают эндонуклеазой Hal Ц и два меченых фрагмента молекулы ДНК, содержащих примерно 265 и 135 пар оснований., отделяют на полиакриламидном геле в условиях примера 1. Выделенные сегменты подвергают специальной реакции рассечения и последовательность анализируют. В последовательности на конце 5 содержится еще одна последо вательность, содержащая 50-120 нукле- отидов по длине, а сегмент поли дА на конце З имеет переменную длину. Соответствующая последовательность аминокислот проинсулина 1 крысы начинается и заканчивается триплетом.
Пример 6. Выделяют последовательность нуклеотидов, содержащую генетический код, контролирующий синтез инсулина человека. Последовательность очищают и вводят в плазмиду (согласно (примеров 1-4) ..Микроорганизм готовят -по примеру 4 и они содержат нуклеотидную последовательность с информацией, контролирующей синтез цепи инсулина А и цепи В человека.
Корректор И. Муска
