Способ иммунодиагностики инфекций Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, преимуществеино к области иммунодиагностики инфекций.

Цель изобретения - ранняя диагностика и повьпиение точности способа.

Способ выполняют следующим образом.

Предварительно подбирают в пару .к специфическому диагностикуму ди- агностикум с неспецифическим антигеном. Выбор неспецифического диагностикума осувлествляют по следующим критериям. Он не должен давать перекрестных реакций со специфическим диагностикумом и при од-

повременном исследовании 10-12 здоровых людей или больных контрольной группы выявлять титры антител, коррелирующие с титрами антител к специфическому антигену с величиной коэффициента корреляции выше 0,5. При возможности выбора неспецифического диагностикума из ряда диагностику- мов предпочтительнее такой, который в паре со специфическим диагностикумом выявляет титры антител с наибольшим коэффициентом корреляции и с соотнощением их средних величин в группе, близким к 1:1.

В группе здоровых людей и контрольных больных общим числом не

р 10

tc

00

менее 20-25 чел. устанавливают соотношение титров антител к специфическому и неспецифическому антигенам с применением тех эритроцитарных диаг- ностикумов,которые предполагается по тоянно использовать в последук1п;их диагностических исследованиях. По результатам определения составляют стандарты соотношения титров антител к специфическому и неспецифическому антигенам. Для этого индивидуальные результаты определения титров антител группируют, объединяя в отдельные группы индивидуальные показатели с одинаковым значением титра антител к неспецифическому . антигену. Для каждой такой группы с одним значением титра антител к неспецифическому антигену вычисляют среднее значение соответствующих индиввдуальных титров антител к специфическому антигену. Эти стандарты постоянно используют в последующих диагностических

зевание стандартов соотношения титров антител позволяет получить диаг ностически значимый результат при величине индекса 4,0 или даже не- , сколько Ш тке этой величины.

Возможно применение и упрощенного- стандарта соотношения титров. Если в контрольной группе средние величины титров антител к специфическому и неспецифическому антигенам различаются не более чем в 4 раза, индекс специфического повышения титра антител рассчитьгеают по формуле, но

вводят в нее величины соотношения титров в контрольной группе, округленные до целых величин. При этом в соотношения величин сред- негрупповых титров в контрольной

группе 1:1 индекс вычисляют простым делением титра специф1-гческнх антител у больного на-титр его антител к неспецифическсму антигену.

Если при диагностическом исследо

Изобретение относится к области медицины, преимущественно к иммунодиагностике инфекций. Цель-ранняя диагностика и повышение точности способа. Диагностическое исследование производят с начала заболевания, дополнительно определяют у больного титр антител к неспецифическому антигену и у здоровых лиц титр антител к специфическому и неспецифическому антигенам с последующим расчетом индекса специфического повышения титра антител по формуле Индекс=(Т_сп/Т_несп.)/(СредствоТ_сп/СредствоТ_несп.), где Т_сп - титр антител к специфическому антигену у больного

Т_несп - титр антител к неспецифическому антигену у больного

Средство Т_сп - средний титр антител к специфическому антигену у здоровых лиц

Средство Т_несп - средний титр антител к неспецифическому антигену у здоровых лиц. При значении индекса больше 4 диагностируют инфекцию.

исследованиях. При проведении диагнос-25 вании используют нестандартные и нетического исследования у больного определяют натуральные титры антител к специфическому и неспецифическому антигенам и вычисл яют индекс специ35

40

фического повышения титра по соотно- зо трех контрольных лиц. Рассчитывают шению титров антител у больного и в соответствуюп1ем стандарте из контрольной группы с такой же величиной титра антител к неспепифическому антигену. Поскольку при этом титры антител к неспециф1тческому антигену одинаковы у больного и в соответствующем стандарте, индекс вычисляют путем простого деления титра специфических антител у больного на средний TFTp антител к специфическому ант)1гену г соответствуюи1ем стандарте. Необходимо иметь достаточно большой набор стандартов соотношения титров антител, соответствующий вариациям индивидуальных значений титров антител к неспецифическому антигену у диагностируемых больных. При отсутствии соответствующего стандарта расчет индекса можно произнодить по стандарту титра антител к неспеаифи- ческому антигену, смежному с тигром этих антител у диагностируемого бот,- ного.При этом титры антител к 4)бо- им антигенам в стандарте увеличяна- ют или уменьшают вдвое для приведения в соответствие величин титрон антител к неспецифическому ку в стандарте и у больисл о. Исиоль

сред;-1ис; титры антител у контрольных лиц, и индекс вычисляют по формуле При разнице средних титров антител у контрольных лиц более чем в 4 раза при расчете индекса у больного с предельно низким зна чением титра антител к неспецифи ческому антигену можно получить зав шенную величину. Поэтому в зоне кра не низких значений титров антител к неспецифическому антигену у диагностируемых больных найденную велич ну индекса следует уменьшить вдвое.

45 Способ можно применять также при исследовании парных сывороток. Дл этого в обеих сыворотках следует до полнительно определить титры антите к неспецифическому антигену и в фор

5Q мулу расчета ввести соотношение тит ров антител к специфическому и несп цифическому антигенам в каждой сыво ротке. Расчет индекса можно произво дить как по соотношению титров анти

gg тел во второй сыворотке к первой,

так и в обратном порядке. При иссле вании парных сывороток диагностически значимой считают величину инд са 4 и выше.

стабильные эритроцитарные диагности- кумь, то одновременно с больным определяют титры антител к специфическо- и неспецифическому антигенам у

35

40

зо трех контрольных лиц. Рассчитывают

сред;-1ис; титры антител у контрольных лиц, и индекс вычисляют по формуле. При разнице средних титров антител у контрольных лиц более чем в 4 раза при расчете индекса у больного с предельно низким значением титра антител к неспецифическому антигену можно получить завышенную величину. Поэтому в зоне крайне низких значений титров антител к неспецифическому антигену у диагностируемых больных найденную величину индекса следует уменьшить вдвое.

зо трех контрольных лиц. Рассчитывают

45 Способ можно применять также при исследовании парных сывороток. Для этого в обеих сыворотках следует дополнительно определить титры антител к неспецифическому антигену и в фор5Q мулу расчета ввести соотношение титров антител к специфическому и неспецифическому антигенам в каждой сыворотке. Расчет индекса можно производить как по соотношению титров антиgg тел во второй сыворотке к первой,

так и в обратном порядке. При исследовании парных сывороток диагностически значимой считают величину индекса 4 и выше.

Пример I. Применяют способ при диагностике дизентерии.

В контрольной группе из 12 взрослых здоровых людей и 16 больных детей с воспалительными заболеваниями не относящимися к острым кишечным ин |фекциям, получена сыворотка крови. Каждая проба сыворотки раститрована макроварианте РПГА с разведения от 1:2 до 1:512 в соответствии с Насталением по применению диагностикумов эритроцитарных из шигелл Зонне, Флек нер.и Ньюкестл. Определены титры антител с диагностикумами из гаигелл Зонне и Флекснер. У здоровых людей средние титры антител к шигеллам Зон не 1:81 (пределы колебаний от 1:16 до 1-256), к шигеллам Флекснера 1:81 (пределы колебаний от 1 :8 до 1-256). У больных детей контрольной группы средний титр антител к шигеллам Зонне 1:92 (пределы колебаний от 1:4 до 1:256) и к шигеллам Флекснера 1:71 (пределы колебаний от 1 :1 6 до J:256). Коэффициент корреляции титров антител к-шигеллам Зонне и лекс вера 0,76.

На основании исследований контролной группы пара эритроцитарных диагностикумов является вполне подходящей для проведения диагностического исследования при дизентерии. Учитыва равенство средних титров антител к обоим антигенам, расчет индекса можно производить простым делением титров антител к обоим антигенам. У контрольных лиц величина индекса не выходит за пределы 4,0.По результатам обследования контрольной группы диагностический титр составляет 1:512. Особенность применения этой нары диагностикумов состоит в том, что здесь заранее не определяется, какой из них считать неспецифическим Установление принадлежности заболевания к одному из двух видов дизентерии производят по превьш1ению величины титра антител к одному нз видов шигелл более чем в 4 раза по отношению к титру, определяемому к другому виду шигелл.

При дизентерии Зонне в первые 3 дня заболевания возможно не специфи

ческое повьштение, а специфическое угашение титра антител с падением титра антител к этому антигену до 0. В этом случае для уточнения вида ди- з ентерии целесообразно провести с

10

15

0

25

О

сывороткой крови больного дополнительное исследование титра антител с диагностикумов, заведомо гетероген- ным по отношению к диагностикумам из шигелл Зонне и Флекснера.

У двух больных, поступивших на 1-и и 2-й день заболевания с подозрением на дизентерию, взята кровь, получена сьшоротка и в ней определены титры антител с эритроцитарными диагностикумами из шигелл Зонне и Флекснера. У одного больного титры составили соответственно О и 1:128 и у другого 1:2 и : 64. Расчет индексов указал на наличие дизентерии у обоих больных. У первого больного была предложена дизентерия Зонне, а у второго - дизентерия Флекснера, что полностью -совпало с полученными позднее данными бактериологического исследования. Заключение о наличии

о

дизентерии Зонне было сделано на основании нулевого титра к этому антигену,что никогла не встречалось у больных заболеваниями недизен те- рийной этиологии. Дополнительное исследование у этого больного титра антител к риккетсиям Провачека подтвердило правильность такого заключения.

При обследовании предлагаемым способом 1I5 больных с бактериологически подтвержденной дизентерией Зонне и Флекснера на 1-А-й дни заболевания получено 30% диагностически значимых результатов, а известным - способом - 0. В период с 5-го по 10-й дни заболевания предлагаемым

0 способом получено 93% положительных диагностических результатов, а при оценке по величине диагностичес- кого титра 1:512 - 40%. С М-го по 23-й дни заболевания предлагаемым

45 способом получено 100% положительных результатов, а при оценке по диагностическому титру - 53%.

При обследовании 15 больных со Q сроками от начала заболевания от двух

36

двух дней до двух месяцев с диагнозом дизентерия Флекснера, поставленным на основании данных эпидисследования, но без бактериологического подтверж- 5 дения, предлагаемый способ дал положительный диагностический результат у всех больных, а диагностический титр антител установлен лишь у двух больных.

П р и м е р 2. Применение способа при диагностике менингококковой инфекции.

Для диагностического исследования использованы жидкие эритроцитарные менингококковые диагностикумы типов А,В и С.Ленинградского НИН эпидемиологии и микробиологии имени Пастера и в качестве неспецифического сухой , JQ антигенный эритроцитарный диагности- кум из шигелл Зонне Ленинградского НИИ вакцин и сывороток.

У 10 здоровых людей-доноров полу- 15 чена сыворотка крови. Сыворотки рас- Титрованы с 1%-ной нормальной кроличьей сывороткой с разведением от 1:2 до 1-:256 с объемом ингредиентов по 0,025 мл. Из каждой сьшоротки при-20 готовлено 4 рнда таких разведений, в лунки каждого ряда внесено по 0,025 мл 1%-ной взвеси каждого из испытьгоаемых диагностикумов. В каждом планшете для титрования определен 25 титр антител только к одному антигену. Планшеты выдержаны в термостате 2 ч. Титр антител к шигеллам Зонне определен по системе четырех крестов, титр противоменингококковых анти- 30 тел - по последнему разведению с реакцией не ниже чем на 2 креста. Средние титры антител составили к менингококкам типаAI :3 ,0 (пределы колебаний от 1:2 до 1:8),к менинго - з коккам типа В 1:2,5 (пределы колебаний от О до 1:4), к менингококкам типа С 1:1,6 (пределы колебаний от О до 1:4),к шигеллам Зонне 1:24 (пре- делы колебаний от 1:4 до 1:64). Тит- 0 ры прот явомепингококков1.1х антител всех ТИТОВ коррелируют с титрами антител к юигеллам Зонне с величиной коэеЬфициента корреляции в пределах 0,8-0,9. Набор диагностикумоп дз подходит для диагностического иссле- до вания. Учитывая большую разницу в величине средних титров протипоменин- гококковых и протииодизентерийных антител, целесообразно проводить on- Q ределение индекса по дшМтеренциропаи- ным стандартам соотношения титров антител у контрольных лиц. С этой целью дополнительно проведено определение титров антител у 10 здоровых детей и 11 больных детей из контрольной группы. По результатам исследона- ния составлены стандарты соотношения титров антител.

Показано, что предельная величина индекса в контрольной группе составляет 3,6, поэтому бесспорное диагностическое значение имеет даже величина индекса 4,0. По результатам исследования контрольной группы принят за диагностический титр противоменин- гококковых антител 1:32.

У больного,. поступившего в инфекционную больницу с подозрением на ме- нингококковую инфекцию, в день поступления произведено определение титров антител.

Исследование.показало, что у больного диагностически значима величина индекса специфического повьш1ения титра к менингококкам типа В .Величина индекса в 4 раза превосходит предельную контрольную величину индекса в стандарте с титром антител к шигеллам Зонне 1:4. В то же время величина титра к этому антигену в 4 раза ниже диагностического титра.

Возможность применения способа при исследовании парных сывороток поясняет следующий пример.

Больной К., 7 мес, поступил в больницу с подозрением на менингококконую инфекцию. В день поступления в больницу у него была взята сьшоротка крови и заморожена в холодильнике. Вторая порция сыворотки была получена через 2 недели. В обеих сыворотках одновременно определены титры антител .

Расчет индекса ясно показывает, что в первой сыворотке относительно второй специфически повышен титр антител к менингококкам типа А. В(гч- растание в 4 раза титров антител к менингококкам В и С ь динамике заболевания носит неспецифический характер, поскольку точно так же изменяется в динамике титр антител к шигеллам Зонне.

При однократном обследовании предлагаемым способом 135 детей с генерализованными и локализованными формами менингококковой инфекций со сроками заболевания от 1 до 5 дней положительный диагностический результат получен в 86,2%, а при оценке i;o диагностическому титру - в 25Z исследований .

При исследовании парных сыворс - ток предлагаемый способ дал положительный диагностический результат у 77,8% больных, а при оценке ИЗВРС-Тшлч

способом по критерию 4-кратного прироста титра результаты исследования были отрицательными.

П р и м е р 3, Применение способа при диагностике герпетической инфекции.

Для проведения диагностического исследования изготовлен самодельный жидкий эритроцитарный диагностикум с использованием формалинизирован- ных и обработанных танином эритроцитов барана. Наличие у препарата специфической активности было прдт- верждено исследованием с противо- герпетической референс-сывороткой,

У 14 здоровых людей доноров получена сьшоротка крови. Из каждой пробы сыворотки сделано 2 ряда разведений, в планшетах для микропроб с использованием в качестве разводящей жидкости 1%-ной нормальной кроличьей сыворотки с объемом ингредиентов по 0,025 мл. В лунки одного ряда добавлено по 0,025 мл 1%-ной взвеси эритроцитарного диагностикума из вируса герпеса, в лунки другого - такой же обьем 1%-ной взвеси диагностикума из шигелл Зомне. Планшеты помещены В термостат на 2 ч. Титры антител к вирусу герпеса опенены по последнему разведению сыворотки с реакцией не ниже чем на 3 креста, титры антител к шигеллам Зонне - по известной системе. Средние титры антител к вирусу герпеса 1:3,8 (пределы колебаний от О до 1:8), к шигеллам Зонне - 1:10,7 (пределы колебаний от 1:2 до 1:32). Величина коэффициента корреляции О,56.Индивидуальные вариации индекса соотношения титров антител в исследованной группе были в пределах 0,. Пара диагностикумов годится для проведения диагностического исследования,однако, учитывая нестандартность диагностикума из вируса герпеса, для диагностического исследования следует применить вариант с одновременным исследованием титров антител у больного и трех доноров.

Применение способа при диагности- ке герпетической инфекции поясняет следующий пример.

Больной К. Поступил в клинику глазных болезней с диагнозом кератит предположительно герпетической природы. В тот же день было проведе- но исследование титров антител у

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

больного и трех здоровых людей-доноров .

Данные исследования указывают на высокий уровень специфической реакции к вирусу простого герпеса и безусловно свидетельств:; ют о наличии герпетической инфекции. Правильность такого заключения подтверждена обнаружением методом флуоресцир пощих антител антигена вируса простого герпеса в соскобе из конъюнктивы.

При обследовании предлагаемым способом 20 больных с различными формами герпетического кератита однократное исследование титров антител при поступлении дало положительный диагностический результат у всех обг следованных. Антиген вируса простого герпеса в соскобе из конъюнктивы обнаружен у половины больных. При исследовании парных сывороток, полученных при поступлении и через 2 недели, предлагаемый способ дал положительный результат у всех больных, а по известному способу с учетом критерия 4-кратного прироста титра антител к вирусу герпеса во второй сьшо- ротке - только у 25% больных.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет диагностировать инфекцию с первого дня заболевания, а по известному способу диагност1гческое исследование начинают не ранее 5-6-го дня заболевания. Особенно существенный выигрьпп во времени получается, при диагностике вирусных инфекций, при которых достоверный результат nojiy- чается только при исследовании парных сывороток, полученных с разницей во времени в 2-3 недели. Предлагаемый способ дает возможность получения достоверного диагностического результата при исследовании однократно полученной сьшоротки, что соответственно сокращает сроки диагностики на 2-3 недели.

Следующее преимущество предлагаемого способа заключается в повышении точности диагностики. Это доказывается сравнительными данньми об уровне титра антител, при котором можно диагностировать инфекцию предлагаемым и известным способами. При дизентерии достоверное значение имеет титр антител 1:512, по предлагаемому способу можно обнаружить достоверное изменение специфических антител с титра 1:16, а в случае специфичес

10

15

кого угашения титра антител даже при нулевом его значении. При менин- гококковой инфекции предлагаемый способ позволяет получить диагностический результат при титре антител в 4-8 раз ниже диагностического титра. Благодаря этому,предлагаемый способ позволяет получить достоверных диагностических результатов в 3- 3,5 раза больше, чем исследование известным способом с определением диагностического титра.

Благодаря повышению TO4HocfH предлагаемый способ позволяет исключить как ложноположительные р езультаты исследования в тех-случаях, когда повышение титра антител до диагностического уровня имеет неспецифический характер. В частности, согласно 20 Наставлению по применению диагности- кумов зритроцитарных из шигелл диагностическим считается титр антител 1:200. Антитела в таком титре обнаруживаются у 14% обследованных из 25 контрольной группы здоровых и больных людей. Применение предлагаемого способа позволяет определить неспе- ци ический характер такого повышенного титра антител и квалифицировать jo результаты исследования как ложно- диагностические .

Предлагаемый способ повышает точность исследования парных сывороток в связи с возможностью контроля спец11фичности динамики титра антител. По суммарным результатам всех исследований парных сывороток при инфекциях предлагаемый способ позволяет установить неспецифический характер 4-кратного повышения титра антител у 2/3 больных. У них выявлено аналогичное и большее повышение титра антител к неспецифргческому антигену. Вместе с тем учет динамики титров однриременно к специфическому и неспецифическому антигенам и вычисление индекса увеличивает число диагностических результатов при исследовании парных сывороток в среднем в. 4 раза в сравнении с их оценкой по критерию 4-кратного прироста титра антител к специфическому антигену.

Повьш1ение точности способа выражается также в возможности одинаково эффективного использования диагности- кухов с разным уровнем их специфической активности. В частности, при сравнении зритроцитарных диагности35

40

45

50

55

0 5 o

5

0

5

0

5

кумов из шигелл Зонне и Флекснера жидких МНИИЭМ им.Габричевского и сухих ЛНИИЭМ им.Пастера установлено, что титры выявляемых ими антител в одних пробах сыворотки отличаются в среднем в 2 раза. Соответственно этому, при обследовании группы больных дизентерией с оценкой по единому официальному для обоих препаратов диагностическому титру антител 1:200 получена разница в числе диагностических результатов в 2 раза. При исследовании предлагаемым способом получены абсолютно одинаковые диагностические результаты . При сравнении зритроцитарных менингококковых диагностикумов МНИИЭН им. Габрического и ЛНИИЭМ им.Пастера в параллельных пробах с одними сыворотками крови установлено, что первый препарат выявляет титры антител в среднем в 1 5 раз выше по величине ,чем второй. Если при исследовании обоими препаратами пользоваться единым диагностическим титром (1:40) - (1:80), то у больных менингококко- вой инфекцией получаются кардинально различные результаты. Исследование по предлагаемому способу дает совпадение диагностических результатов у 90% обследованных .

Предлагаемый способ дает возможность введения нового критерия оценки специфической активности эритро- цитарных антигенных диагностикумов не по величине титра антител, а по диапазону градаций выявляемых ими титров независимр от их абсолютной величины. Критерием достаточной специфической активности препарата является определение у здоровых людей и больных специфической инфекцией титров антител в диапазоне, содержащем не менее 7 последовательных градаций титров антител, чтобы обеспечить достаточный цифровой набор значений диагностического критерия в форме индекса специфического повышения титра антител. Большему числу градаций выявляемых титров антител соответствует более высокая чувствительность препарата. Такой подход дает основание . для упрощения технологии коммерческого производства эритроцитар- ных антигенных диагностикумов для РПГА.

Существенное улучшение диагностики инфекций обеспечивается применением существующих диагностических

препаратов без изменения техники их применения. Это дает возможность нег медленного применения изобретения в здравоохранении без дополнительных средств и затрат на его реализацию. Единственное усовершенствование, которое целесообразно ввести, это выпуск диагностического набора препарата со специфическим антигеном в сече тании с заранее отобранным диагности кумом с неспецифическим антигеном, что вполне возможно на основании использования существующих коммерческих диагностикумов.

Формула изобретения

Способ иммунодиагностики инфекций путем определения титра специфических антител в сыворотке крови па- циента в реакции пассивной гемагглю тинации, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ранней диагностики,в начале заболевания дополнительно определяют титр антител к неспецифическому антигену и титры антител к специфическому и неспецифическому антигенам у здоровых лиц с последующим вычислением индекса по формуле

Т /Т

СП не СП

Ср.Теп/Ср.Т Г

СП/ -Р 1 иеел

титр антител к специфическому антигену у пациента; титр антител к неспецифическому антигену у пациента;

средний титр антител к специфическому антигену у здоровых лиц;

средний титр антител к неспецифическому антигену у здоровых лиц,

чении индекса больше 4 диют наличие инфекции.