Способ определения дефекта антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцитов Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

3.149

ilHCbiBOpoTKH, полученный высаливанием 4 помощью 33%-ного раствора сульфата аммония, растворяют в дистиллирован- Иой воде и диализуют против 0,0175 М фосфатного буфера, рН 6,3. Концентрацию белка определяют на спектрофотометре СФ-16 при длине волны Й80 нмо К 0,2 мл 50%-ной суспензии Эритроцитов барана, отмытых три раза физиологическим раствором, добавляют при комнатной температуре равньй объем -глобулиновой фракции (содер кание белка 3-5. мг/мл). К постоянно перемешиваемой взвеси добавляют ф,1 мл растйора хлористого хрома |о,25-0,01 мг/мл)о; После инкуба- I)ии в течение 5 минут клетки трижды фтмывают забуфереиным физиологичес- |сим раствором (рН 7,3) и из них г от о 1)ят 0,5 %-ную суспензию о Приготовлен ные таким образом теет-эритроциты :фанят при в течение 1 неделио Перед использованием после хранения tecT-эритроциты отмьшают однократно Оредой 199 или физиологическим раст ОрОМо

Вьщеление лимфоцитов проводят Стандартным образом

Кровь больного собирают в пробир- Ки, куда предварительно бьт внесен -епарин (25 ед/мп крови). Затем сровь разводят в соотношенщ 1 :3 Изотоническим буферным раствором, Наслаивают на смесь фикол-гипак плот {ностью 1,077 г/мл и центрифугируют IB течение 30-40 минут при 400й.Соби- рают слой клетрк с интврфазного слоя и 3 раза отмывают средой 199с, 1В суспензии отмытых лимфоцитов опре|деляют количество клеток и доводят до концентрации 2-4x10 клеток на 1 мл„ Далее в 2 конические пробирки вносят по 0,1 мл взвеси лимфоцитов JI затем в первую пробирку добавляют 0,1 мл среды 199, а во вторую 0,1 мл среды 199 с пептидами из сумки Фабрициуса в концентрации 4-200 мкг/мл. Обе пробирки помещают в термостат и инкубируют при 37 С в течение 1 - 8 ч. Затем пробы один раз отмъшают центрифугированием при 200g в течение 5 мин физиологическим раствором и-взвешивают осадки клеток в объеме 0,1 мл физиологического раствора. Определяют в тесте с трипановым ск- НИМ жизнеспособность клеток, которая должна быть не менее 95-97 % В обе пробирки вносят : ритроциты, сенсибилизированные антииммуноглобулинами, объемом 0,1 мл 0,5 %-ной взвеси. В эти же пробирки вносят по 0,1 мп 0,05 %-ного раствора азида натрия для блокады связывания лимфоцитами эритроцитов, обработанных иммуноглобулинами за счет F -рёцепторов, Смесь клеток инкубируют при в течение 15 мин, затем центрифугируют 5 мин при 500 об/мин и инкубируют 8-16 ч при 4 с. Затем осадок ре- суспендируют осторожным встряхиванием и подсчитывают число розетко- образующих клеток (% РОК). Просчитывают не менее 200 лимфоцитов За РОК принимают лимфоциты, присоединившие 3 и более тест-эритроцитов Увеличение числа РОК после инкубации определяют по формуле:

С

де С

А - В А-В

% увеличения числа розетко- образующих клеток после инг йубации с пептидами из сумки Фабрициуса; число РОК во второй пробирке;число РОК в первой пробирке„

Для определения режимов инкубации используют кровь от больных с выраженными иммунодефицитами. Из крови в стандартных условиях способа получают лимфоциты, которые инкубируют в течение 5,20,60,120,240,480, 600 мин с пептидами из сумки Фабрициуса (концентрация 10 мкг/мл). Затем смешивают отмытые лимфоциты с тест-эритроцитами и определяют число РОК.

Зависимость процесса розеткообра- зования лимфоцитов с эритроцитами, нагруженными антииммуноглобулинами, от времени инкубации представлена в табл о К

Контроль - это лимфоциты, инкубированные в среде 199 в течение 60 мин, такое время необходимо для того, чтобы адсорбированные цитофиль- ные иммуноглобулины покинули лимфоциты и остались только истинные мембранные иммуноглобулины, которые синтезированы данной клеткой. При дальнейшей инкубации (более 60 мин) число лимфоцитов не возрастает.

Данные табл.1 показьшают, что наиболее выраженный и достоверный эф5

фект увеличения лимфоцитов с иммуно глобулиновыми рецепторами наблюдают если суспензию лимфоцитов инкубируют с пептидами из сумки Фабрициуса в течение 60-480 мин (1-8 ч). Если инкубация продолжается менее 1 ч или более 8 ч, то увеличение лимфоци тон с иммуноглобулиновыми рецепторами недостоверно.

Зависимость влияния концентрации пептидов из сумки Фабрициуса в инкубационной среде представлена в табл

Лимфоциты получают и готовят тест эритроциты в стандартных условиях способа.

Данные табл.2 показьгеают, что наиболее выраженный эффект на розет- кообразование оказывают пептиды из сумки Фабрициуса в концентрации 2,0-100,0 мкг/мл среды 199 При других концентрациях пептидов наблюдаются недостоверные показатели.

Таким образом, только инкубацией лимфоцитов с пептидами из сумки Фабрициуса в концентрации 2,0 100,0 мкг/мл в течение 1-8 ч обеспечивается наиболее оптимальное влияние на рецепторный аппарат В-лимфо- цитов: иммуноглобулиновые рецепторы

Был проведен сравнительный анализ группы здоровых доноров (25 чело век) и группы больных (21 человек). При осуществлении предлагаемого способа, было установлено, что у здоровых людей после инкубации лимфоцитов с пептидами из сумки Фабрициуса увеличивается количество розеток с эритроцитами, нагруженными антииммуноглобулинами на 12,,3 % (М±м), а у больных - на А4,8±7,5% (м±м)о При сравнении результатов достоверность различий в данных группах, составила P-iOjOl, что свидетельствует о том, что в группе больных по сравнению со здоровыми людьми выявляет-- ся большее количество незрелых форм В-клеток.

Данные по апробации способа на больных с ожогами 2-3 степени (П больных), отморожениями. 2-4 степени (5 больных), гнойным перитонитом (4 больных), абсцессом дугласова пространства (l больной) представлены в табЛоЗ.

Данные табл.3 покаэьтают, что известным способом выявляют нарушения иммунного статуса у 38,1% боль975746

ных (по сравнении с нормальными показателями 20-30%), предатагаемым способом - у 90,5% больных (с учетом того, что у здоровых больных увеличение лимфоцитов с яммуноглобули- новыми рецепторами происходит до 20%).

10 Предлагаемый способ позволил выявить дополнительную группу больных (52,4%) с нарушениями иммунологи- . ческого статуса,-а также установить причину этих нарушений, связанную с

15 тем,ч то нарушается антиген независимая дифференцировка В-лимфоцитово Это позволило в дальнейшем назначить коррегирующее эти сдвиги лечение о

20 Таким образом,применение предпа- гаемого способа позволяет повысить эффективность контроля иммунологического статуса больного в сравнении с известным способом на 52,4%.Приме25 нение предлагаемого способа позволяет оценить состояние дифференциров- ки В-лимфоцитов не по абсолютной величине ПАРР в суспензии лимфоцитов периферической крови, а по характе30 РУ приращения, исключив из рассмотрения фоновую составляющую ПАР

Пример 1о Больной М„,29 лет Диагноз: ожог II-TII степени 24% поверхности тела. Способом-прототипом

35 установлено количество лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами 22%, т.е., в пределах нормы После инкубации с пептидами из сумки Фабрициуса в стандартных условиях способа про40 цент РОК повысился до 38% Увеличение количества лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами произошло на 72,7%, что свидетельствует о нарушении в иммунологическом статусе, а

45 именно о нарушении антигеннезависи- мой дифференцировки В-лимфоцитов.

П р и м е р 2. Больной В о,.39 лет. Диагноз: разлитой гнойный перитонит« Способом прототипом установлено,

50 что количество В-лимфоцитов равно 20%, Тое в пределах нормы После инкубации лимфоцитов с пептидами из сумки Фабрициуса процент РОК повысил- . ся до 34 %„ Увеличение количества

55 лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами произошло на 70%, что сви-; детельствует о большом содержании предшественников В-клеток и о нарушении дифференцировки В-лимфоцитов.В

л|альнейшем была осуществлена коррек- 1|ия этих нарушений.

Формула изобретения

Способ определения дефекта анти- Геннезависимой дифференцировки В-лим- фоцитов путем добавления к лимфоцитам периферической крови больного 1 ест-эр итроцитов, нагруженных анти- ммуноглобулинами, с последующим под

счетом розеткообразующих лимфоцитов, отличающийся тем, что, с целью повьппения точности способа, перед добавлением тест-эритроцитов лимфоциты инкубируют в ч-ечение 1-8 ч в присутствии 2-100 мкг/мл пептидов из сумки Фабрициуса и при значении количества розеткообразующих лимфоцитов свыше 23,8% определяют нарушение антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцитов о

Таблица 1

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и может быть использовано для определения иммунного статуса организма. Целью изобретения является повышение точности за счет выявления предшественников В-лимфацитов. Для этого лимфациты периферической крови обследуемого инкубируют с пептидами из сумки Фабрициуса в концентрации 2-100 мкг/мл в течение 1-8 ч. Затем осуществляют реакция розеткообразования с эритроцитами, нагруженными антииммуноглобулинами. Антииммуноглобулины против иммуноглобулинов человека "пришивают" с помощью хлористого хрома. Оценку нарушения антиген независимой дифференцировки В-лимфоцитов осуществляют по увеличению лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами после инкубации с пептидами из сумки Фабрициуса по сравнению с контрольной пробой, в которой лимфоциты инкубируют в среде 199 без биологически активных соединений из сумки Фабрициуса. Увеличение числа таких лимфоцитов более 28,3% свидетельствует о нарушении иммунологического статуса. Предлагаемым способом выявлено нарушений у 90,5% больных в сравнении с 38,1% по способу-прототипу.

Лимфоциты с поверхностными иммуноглобулинами, %

достоверные величины по отношению к контролю.

Лимфоциты с поверхностными иммуноглобулинами, % о М

м

21,5 22,9 26,7 30,9 . 32,9 30,5 24,7 2,04 2,04 1,08 1,37 2,43 1,69 2,04

достоверные результаты по сравнению с контролем.

Т а

л и ц а 2

Показатели

Лимфоциты после инкубации

в среде 199 (прототип)

РОК с эритроцитами, нагруженными антииммуноглобулинами, % Нарушения иммунологического статуса, %

Увеличение числа РОК после инкубации с пептидами из сумки Фабрициуса,

32,0tl,98

16-153

90,5