Способ определения активности гормонов тимуса Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к биоломш, медицине, химико-фармацевтической промышленности и касается способов определения биологической активности гормонов.

Целью изобретения является повышение точности способа за счет выявления индукторной активности гормонов тимуса.

Цель достигается тем, что определяют индукторную активность гормонов тимуса, для чего используют клетки монослойной культуры гепатоцитов, предварительно стимулированные тими- ческим гормоном. Стимуляцию проводят гормональным фактором тимуса (в дозе 0,1 мг/мл), а индукторную активность

определяют как способность супернатанта гепатоцитов, стимулированных гормоном, увеличивать количество ро- эеткообразующих клеток среди Т и В лимфоцитов периферической крови человека по сравнению с контролем, в качестве которого используют уровень розеткообразования лимфоцитов в присутствии супернатанта гепатоцитов, не стимулированных гормоном. Метод основан на способности гормонов тимуса оказывать не только прямое корре- гирующее влияние на дифференцировку иммунокомпетентных клеток, но и индуцировать продукцию вторичных нммунсре- гуляторных медиаторов клетками различных органов и тканей.

О5 N3 N5

00

ISD

Способ осуществляется следующим образом.

Стерильно извлеченную печень животного через нижнюю полую вену пер- фузируют при 37°С 250 мл 0,02%-ного раствора Версена с содержанием 0,05% коллагеназы и 50 ед/мл пенициллина и стрептомицина, после чего осуществляют дополнительную перфузию 80 мл раст вора Хенкса с 0,005 М содержанием Са + и 0,05% содержанием коллагеназы Далее печень тщательно измельчают, трехкратно отмывают от остатков крови 30-40 мл 0,02%-ного раствора Вер- сена. Отмытую ткань заливают 200 мл среды Игла с 0,05% коллагеназы и инкубируют 15 мин при 37 С с постоянным встряхиванием. После этого клетки трехкратно отмывают при 0°С 80 мл среды-Игла от остатков коллагеназы. Полученную суспензию пропускают при О ( через стерильную колонку 20x2 см, заполненную стекловатой для очистки суспензии от клеток макрофагально-мо- ноцитарного ряда, после чего клетки оставляют оседать. Затем надосадочную жидкость отсасывают, клетки помещают в инкубационную среду: среда Игла СО эмбриональная телячья сыворотка 20 i. пенициллин,стрептомицин по 10и мкг/мп Содержание клеток доводят 3-Ю6 гепа- тоцитов/мл. Жизнеспособность клеток проверяют окрашиванием изотоническим 0,6 %-ным раствором трепанового синего. Клеточную суспензию переносят в чашки Петри с находящимися в них предварительно сенсибилизированными коллагеном предметными стеклами из расчета 4 стекла на чашку. Инкубация в среде 95% 0 и 5% С02 в течение 5-6 ч. За это время клетки адаптируются и образуют монослой на предметных стеклах. Не прикрепившиеся клетки удаляются вместе с культурально i cpe- дой„

Одновременно со сменой среды в каждую культуру добавляется гормональный фактор тимуса в разведении 0,1 мг/мл. После часовой совместной инкубации оценивается способность супернатанта от гепатоцитов, стимулированных гормоном тимуса, влиять на экспрессию рецепторного аппарата лимфоцитов, полученных из периферической крови человека. Для этого содержание лимфоцитов, выделенных на градиенте плотности фиколл-уротраст, доводят до 34О6 кл в 0,9 мл среды 199 с

Q

5

0

10%-ным содержанием эмбриональной телячьей сыворотки, после чего к 0,9 мл суспензии лимфоцитов добавляют по 0,1 мл супернатанта гепатоцитов, сти- мулированньсх гормоном. Каждую пробу супернатанта добавляют в две пробирки с суспензией лимфоцитов: в одну для определения влияния на экспрессию рецепторов Т-клеток, в другую - В-клеток. Одновременно с этим в отдетьную пробирку с 0,9 мл суспензии лимфоцитов для определения прямой биологической активности соединения вносят 0,1 мл гормона тимуса в концентрации 0.1 мг/мл. Далее лимфоциты инкубируются в течение 1 ч, после чего отмываются, помещаются в 0,2 мл среды 199 с 10%-ным содержанием эмбриональной телячьей сыворотки В пробирку для определения Т-лимфоцитов добавляется 0,2 мл отмытых эритроцитов барабана, в пробирку для определения В-лимфоци- тов помещается 0,2 мл суспензии эритроцитов барана, сенсибилизированных гемолитической сывороткой и обработанных комплементом мыши. Клетки инкубируются при 37°С в течение 15 мин, после чего в пробирках для определения на Т-лимфоциты подсчитывается содержание ат 1 явных розеток. Далее суспензия лимфоцитов помещается на 1 ч в ледяную баню. Пробы для определения влияния на В-лимфоциты сразу помещаются на 1 ч в ледяную баню, затем подсчитывается количество общих розет- кообразующих клеток в популяции Т-лимфоцитов и количество розеткообразую- рдих клеток в популяции В-лимфоцитов,

За единицу прямой биологической активности гормона принимается способность препарата в разведении О,1 мг/мл усиливать розеткообразование среди Т-лимфоцитов периферической крови человека на 1%, тогда как еди- ницеи индукторной активности считается способность гормона вдозе 0,1 мг/мл обеспечивать выброс в супернатант гепатоцитов такой дозы соединений, которая вызывает стимуляцию розеткооб- разования в совокупности лимфоцитов периферической крови человека под влиянием супернатанта на 1%. В качестве контроля используются показатели розеткообразователя в присутствии супернатанта гепатоцитов, не стимулированных гормоном тимуса, и в присутствии культуральной среды.

Пример. Стерильно извлеченную крысиную печень перфузируют через нижнюю полую вену при 37°С 250 мл 0,02%-ного раствора Версена с содержанием 0,05% коллагеназы и 50 ед/мл пенициллина и стрептомицина, после чего осуществляют дополнительную перфузию 80 мл раствора Хенкса с 0,05 М содержанием Саг+ и 0,05% содержанием коллагеназы. Далее печень тщательно измельчают, трехкратно отмывают от остатков крови 30-40 мл 0|02%-ного раствора Версена. Отмытую ткань заливают 200 мл среды Игла с 0,05% коллагеназы и инкубируют 15 мин при 37°С при постоянном встряхивании. После этого клетки грехкратьо отмьшаю при 0°С 80 мл среды Игла от остатков

сыворотки,после чего к 0,9 мл суспензии лимфоцитов добавляют по 0,1 мл супернатанта гепатоцитов, стимулированных одним из разведений тималина. Каждую пробу супернатанта добавляют в 2 пробирки с суспензией лимфоцитов: в одну для определения влияния на экспрессию рецепторов Т-клеток, в друГУЮ В-клеток., Одновременно с этим в отдельную пробирку, содержащую 0,9 мл суспензии лимфоцитов, вносят 0,1 мл тималина в концентрации О,1 мг/мл для определения прямой биологической

активности соединения. Лимфоциты инкубируются в течение 1 ч, после чего отмываются, помещаются в 0,2 мл среды 199 с 10%-ным содержанием эмбриональной телячьей сыворотки. В пробирку

Изобретение относится к биологии, медицине, химико-фармацевтической промышленности и касается способов определения биологическом активности iор- монов. Цель;о изобретения является повышение точности способа за счет ныявления индукторной биологической активности гормонов тимуса. Цель достигается том, что определяют индукторную активность гормонов тимуса, для чего используют клетки монослойной культуры гепатоцнтов, предварительно стимулированные тимичегким гормоном. Стимуляцию проводят гормональным фактором тимуса (в дозе 0,1 мг/мп), а инд -кторную активность определяют как способность супернатанта гепатоцитов, стимулированных гормоном, увеличивать количество розеткообраэующих клеток среди Т и В пимфоцитов периферической крови человека по сравнению с контролем, в качестве которого используют уровень розеткообрачованпя лимфоцитов н присутствии супернатанта гепатоцитов, не стимулированных гормоном. S СЛ

коллагеназы. Полученную суспензию про- 20 для определения Т-лимфоцитов добавляется 0,2 мл отмытых эритроцитов барана, в пробирку для определения В-лимпускают при О С через стерильную колонку 20 см х 2 см, заполненную стекловатой для очистки суспензии от клеток макрофагально-моноцитарного ряда, после чего клетки оставляют оседать, затем надосадочную жидкость отсасывают, клетки помещают в инкубационную среду: среда Игла 80, тмбриональнап теляч я сыворотка 20/,, пенициллин, стрептомицин по 100 мм/мл. Содержание клеток доводят гопатоци- тов/мл„ Мизнеспособность клеток проверяют окрашиванием изотоническим 0, раствором трепанового синего. Клеточную суспензию переносят п чашки Петри с находящимися п них предварительно сенсибилизированными коллагеном предметными стеклами in pac u та 4 стекла на чашку. Инкубация п среде 95% О и 5% СО% в течение 5-6 ч, За это время клетки адаптируются и образуют монослои на предметных стеклах. Не прикрепившиеся клетки удаляются вместе с культуральной средой, Одновременно со сменой среды в каждую культуру добавляется полипептидныи фактор тимуса - тималин в разведении 0,1 мг/мл. После часовой совместной инкубации оценивается способность супернатанта от гепатоцитов, стимулированных тималином, влиять на зкспрес- сию рецепторного аппарата лимфоцитов, полученных из периферической крови больных с ожоговой травмой II, III степени. Для этого содержание лимфоцитов, выделенных на градиенте плотности фиколл-уротраст, доводят до 3-10 кл в 0,9 мл среды 199 с 10%- кым содержанием эмбриональной телячьи

фоцптов помещается 0,2 мл суспензии -фитроцитов барана, сенсибилнзирован 5 кых 1смолитическон сывороткой и обработанных комплементом мыши. Клетки инкубируются при 37°Г, н течение 15 мин, после чего в пробах для определения влияния на Т-лимфоцнты под30 считывается содержание активных розеток. Далее суспензия лимфоцитов помотается на 1 ч п ледяную Паню, Пробы для определения штияьня на В-лим- фоциты сразу помещаются н ледяную ба,, нп на 1 ч, затем подсчитывается количество общих розеткообразуютцих клеток в популяции Т-лимфоцитоп и количество розеткообразующих клеток в популяции Н-пимфоцитов. В качестве конт40 роля используют показатели розетко- образования в присутствии супернатанта гепатоцитов, не стимулированных тималином, и в присутствии культуральной среды. t

Предлагаемый способ, в отличие от известного позволяет не только более глубоко анализировать импунорегуля- тор.ую активность тимических гормонов

50 путем одновременной количественной оценки их прямой и индукторной активности, но и дает возможность выявить даже минимальные колебания их уровня среди тималина различных партий. Все

это делает предлагаемый способ более качественным и точным, особенно при определении биологической активности тимических гормонов, использующихся в виде лекарственных препаратов.

45

фоцптов помещается 0,2 мл суспензии -фитроцитов барана, сенсибилнзированкых 1смолитическон сывороткой и обработанных комплементом мыши. Клетки инкубируются при 37°Г, н течение 15 мин, после чего в пробах для определения влияния на Т-лимфоцнты подсчитывается содержание активных розеток. Далее суспензия лимфоцитов помотается на 1 ч п ледяную Паню, Пробы для определения штияьня на В-лим- фоциты сразу помещаются н ледяную банп на 1 ч, затем подсчитывается количество общих розеткообразуютцих клеток в популяции Т-лимфоцитоп и количество розеткообразующих клеток в популяции Н-пимфоцитов. В качестве контроля используют показатели розетко- образования в присутствии супернатанта гепатоцитов, не стимулированных тималином, и в присутствии культуральной среды. t

Предлагаемый способ, в отличие от известного позволяет не только более глубоко анализировать импунорегуля- тор.ую активность тимических гормонов

путем одновременной количественной оценки их прямой и индукторной активности, но и дает возможность выявить даже минимальные колебания их уровня среди тималина различных партий. Все

это делает предлагаемый способ более качественным и точным, особенно при определении биологической активности тимических гормонов, использующихся в виде лекарственных препаратов.

716228208

Формула изобретениятимуса, перед оценкой реакции проводят инкубацию монослойной культуры

гормонов тимуса путем оценки их дей-последующим отделением супернатанта,

ствия на процесс реакции розеткооб-его очисткой от остаточного количестраэования лимфоцитов, отличаю-ва гормона, внесением в суспензию

щ и и с я тем, что, с целью повыше-лимфоцитов периферической крови, инния точности способа за счет выявле-кубированием, а оценку осуществляют

ния индукторной активности гормонов10 по возрастанию числа Е-РОК и ЕАС-РОК.