Способ получения изотиурониевых галогенидов Советский патент 1989 года по МПК C07C335/38 A61P35/00 A61P37/04 

Изобретение относится к способу получения новых изотиурониевых гало- генидов общей формулы

:NH,-C-KH-C N-R2 HX

NH

S Ri

где R, - С -С -алкил, замещенный

оксигруппой. С,-С,-алкенил; RJ - водород,

указанные соединения обладают противоопухолевым и иммуностимулирующим действием.

Целью изобретения является разработка способа получения новых изотиурониевых производных, которые по

сравнению с соединениями, близкими по структуре,, имеют более высокую активность.

Пример 1. Получение Ы амино- иминометил-5-аллил-изотиуроний бромида.

К 50 мл безводного этанола добавляют 14,9 г (0,05 моль) карбоната N-аминоиминометил-тиомочевины. К полученной суспензии добавляют 14,5 г (0,12 моль) бромистого аллила. Реакционную смесь медлркно нагревают до кипения при энергичном перемешивании. Реакционную гмесь кипятят с обратным холодилы(ик(1м в течение 30 мин и охлаждяк л комнатной температуры, , I JHчьтруют для

4

СО 00

оо

00 4

314

удале 1ия выпадаю цего в осадок вещества. сЬкпьтрат выпаривают под вакуумом и маслянистый остаток кристап- лпзуют нз этнлацетата. Выпадающие в осадок кристаллы фильтруют и вы- суп1ивают при 40-50 с. Таким образом получают 19,6 г целевого соединения с выходом 82% и т. пл. 123-125 С.

Вычислено, %: С 25,10; Н 4,60; N 23,43; S 13,39; Вг 33,47.

Найдено, %: С 25,07; Н 4,61; N 23,48; S 13,32; Вг 33,50.

Характегшые пики в ИК-спектре: 3290, 3260, 2160, 3105, 1640, 1605, 1550, 1375, 1090, 980, 910, 705, 650„

Пример 2. Получение N-ами- ноиминометил-5-аллил-изотиуроний хлорида.

К 50 мл безводного этанола добавляют 14,9 г (0,05 моль) карбоната N-аминоиминометил-тиомочевины. К полученной таким образом суспензии добавляют 9,18 г (0,12 моль) хло- ристого аллила и реакционную смесь медленно нагревают до кипения при энергичном перемешивании. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч и охлажда- ют до комнатной температуры. Смесь фильтруют для того, чтобы удалить возможное выпадающее в осадок вещество. Фильтрат вьтаривают под вакуг умом. Маслянистый остаток кристалли зуют из этилацетата. Выпадающие в осадок кристаллы отфильтровывают и высушивают при 40-50 С.

Продукт может быть перекристаллизован следующим образом„

К 60 мл смеси этанола и металона в соотношении 5:1 добавляют 10 г N-aминoиминoмeтшl-S-aллил-изoтиypo- ний хлорида Незначителаное количе ство нерастворившихся кристаллов удаляют фильтрованием горячей смеси Фильтрат очищают от примесей с помощью активированного древесного угля, если это необходимо. Прозрачный фильтрат охлаждают до комнатной температуры, в результате чего вьта дают в осадок белые кристаллы. Смес охлаждают до 0-5°С, ее оставляют при этой температуре на 1 ч и фильтруют о Кристаллы промывают с помощью этанола, охлажденного льдом и высушивают при 40-50 С. Получают 8,1 г целевого продукта с выходом 81%„ Т. пл. 123-125 С.

,

Q

15

20

2530 -j

40

. ., 50

55

вычислено, %: С 30,84; Н 5,66; N 28,79; S 16,45; С1 18,25.

Найдено, %: С 30,88; Н 5,61; N 28,78; S 16,49; С1 18-27.

Данные ИК-спектроскопии аналогичны, как и для бромида в примере 1„

Пример 3. Получение N-ами- ноиминометил-S-(2-оксиэтил)-изотиу- роний хлорида.

К 50 мл безводного этанола добавляют 14,9 г (0,05 моль) карбоната N-аминоиминометил-тиомочевины. К сус- 11ё::яии добавляют 9,7 г (0,12 моль) этиленхлоргидрина и реакпионную смесь медленно нагревают до кипения при энергичном перемешивании. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 90.мин и охлаждают до комнатной температуры Смесь фильтруют, чтобы удалить возможно вьтадающее в осадок вещество, и прозрачный фильтрат выпаривают под вакуумом. Маслянистый остаток кристаллизуют из этилацетата. Кристаллы отфильтровывают и высушивают при 40-50 С. Таким образом получают 13,5 г целевого соединения с выходом 68% и т. пл. 134-136°С.

Аналогично получают N-аминоимино- метил-S-(З-оксипропил)-изотиуроний бромид (соединение 3)„ Т„ пл. 132- . Выход 35,5%.

Вычислено, %; С 23,34; Н 5,06; N 21,79; О 6,22; S 12,45; Вг 31,13.

Найдено, %: С 23,35; Н 5,04; N 21,81; S 12,51; Вг 31,20.

Характерные пики в ИК-спектроскопии следующие: 3590, 3300, 3220, 2925, 1680

Биологическая активность соединений указанной общей формулы доказана следующими испытаниями.

Испытание специфических действий.

Иммунологические испытания.

Лимфоциты. Лимфоциты отделены на Фикол-Уромиро градиенте (BHjmm 1968) из крови здоровых доноров и пациентов, страдающих опухолью лимфатических узлов (злокачественной лимфой) и метастазирующими твердыми опухолями соответственно При подборе пациентов, принадлежащих к последней группе, принимается во внимание цито- ксичность клетки зависимого антитела (АДСС) и NK-активность. Фагоциты удалены обработкой порошкообразным железом и магнитом

АДСС, ЛДСС определена следук:га м образом.

Эритроциты цыплят, меченые с JO и покрытые сывороткой кролика против яритроцито цыплят, инкубированы вместе с лимфоцитами п тчение А ч при J7 С. Реакция, вызывающая прекращение активнос1и плавающих иа поверхности центрифугированных клеток, определена в счетчике гамма-излучения; Степень освобождения хрома выражена в виде индекса цито токсичности (ИЦ, %). (см. табл. 1).

NK. NK-активность определена еле дующим образом.

Опухолевые клетки К-562, меченые Сг, инкубируют вместе с эффектор- ными клетками в ТС 199 жидкой питательной среде, содержащей 10% деком племе}1тарной Calf-сывороткИо Реакция, останавливающая радиоактивност плавающих на поверхносли и,ентрифу- гированных клеток (освобождение хрома), подсчитана в счетчике гамма- излучения. Уничтожение меченых клеток (ИУ, %) выражено в виде различия испытуемого освобождения и спонтанного освобождения хрома о

Статистические вычисления проведены посредством испытания с одним образцом. Соединения 1, 2 проявляют зна- чительное иммуностимулирующее дей- ствие Указанные соединения способны значительно увеличивать нормальную и сильно пониженную ИК- и К-кле точную активность, даже выше нормалного уровня. Указанное действие может быть настолько сильным, что цитотоксическая активность, пониженная до 1/10 первоначального значения, может быть восстановлена до первоначального уровня (табл. 2).

В пределе дозы, соответствующей ожидаемой концентрации плазмы человека, соединения увеличивают NK- и К-клеточную активность лимфоцитов человека и повышают цитотоксичность природной клетки посредника (NCMC-) и АДСС-реакцию соответственно со скоростью, зависящей от дозьи Согласно предварительным результатам дополнительных иммунологических испытаний соединения увеличивают бластопреобразование и миграцию.

Миграция лейкоцитов.

Спонтанная миграция лейкоцитов измерена на микрокаплях агарозы. 2 мл капель агарочы (0,2%) помеща5

ют нл пластины для миграции. Добавляют ТС 199 жидкую 11итате.|;ьную сре- ду и плотно закрывают пластины для доступа воздуха. После 2А ч изменяют площадь миграции (мм ) с помощью стереомикроскопа.

Миграция лейкоцитов.

0 Беспорядочная миграция полкморфо- нуклеарных клеток здоровых доноров увеличена с помощью соединений, полученных согласно примерам 1, 2 о Оптимальная доза достигает 1,0 рг/мп.

5 При более высокой дозе (Юр г/мл) действие менее выражено„

В табл. 3 представлено in vitro действие на направленную(беспорядочную) миграцию полиморфонуклеарньпс

0 лейкоцитов человека

Бластопреобразование, индуцируемое митогеноМо

Лимфоциты выращивают в ТС 199 жидкой питательной среде, содержащей 10% декомплементарной calf-сыворотки, антибиотики и 25 мН HEPES (Serva). 200 (н л клеточной суспензии, содержащей 2-10 лимфоцитов, наносят на микропластину, пят: параллельных опытов проводят каждый раз„

К культурам добавляют 2 и соответственно фитогемаг- глютинина (лейкоагглютинин) и г 25 |цг/мл конканавалина А (carbio - chem)j указанные величины относятся к конечной концентрации. Культуры выращивают при 37°С в течение 72 ч. За 8 ч до окончания конца периода выращивания к образцам добавляют 0,5 ИCi3 Н-тимидина и завершают замораживание культур. После расплавления образцы фильтруют на автоматической сборочной машине (Dyuatech), Радиоактивность образцов измерена в сцинтилляционном счетчике. Активность выражена в виде .м. (табл. 4 и 5). В табл. 4 и 5 представлено in vitro действие на блас- Q топреобразование лимфоцитов человека, стимулируемое с помощью фитогемаг- глютинина (РИА) и конканавалина А (СопА).

Статистический анализ„ Важность определена с помощью испытания 2Т2 с одним образцом. Результаты, полученные с продуктом реакции из примера 1, представлены в табл. 1 - 3.

0

0

5

5

Предиарительное быстрое испытание для определения противоопухолевого иммуностимулирующего действия.

Мыши-самцы вида CFLP (средний живой вес 30 г) внутрибрюшинно заражены А млн клеток асцитной лимфом..

При испытании использованы те тки- нотные, у которых на четвертый день образовалась легко наблюдаемая опу- холь, т„е„ асцит. В каждой группе использованы по крайней мере десять животных, и мыши были орально обработаны 1/10 величины .

Спустя 2А ч после оральной обра- ботки оценены результаты посредством окрашенного асцитного мазка (посева) Гиемса на основе цитологического анализа о Как и в обработанной группе, в контрольной группе использовано то же количество животных Оценены повреждения опухолевых клеток, активация организма и возможные токсические действия (табл. 6).

При оценке противоопухолевого действия оценено процентное соотношение уничтоженных и неповрежденных опухолевых клеток„ Результаты вьфажены по следующей шкале: Уничтожение опу- Действие холевых клеток, %

0-30Отсутствует

30-70Среднее

70-100Сильное (ингибирование)

Повышение иммунной системы организма оценено на основе количества и активности нейтрофильных грануло- цитов, лимфоцитов и макрофагов, появляющихся среди асцитных опухолевы клеток и принимающих участие в иммунной системе, Активность иммунной системы проявляется также по скорое ти, при которой указанные клетки в асците образуют плазма-мостиковую связь с опухолевыми клетками Соглано этой оценке, если отсутствует раличие по числу и активности указанных клеток, то можно заявить, что отсутствует повьш1ение над контролем Среднее действие наблюдается, если повышение числа клеток или активности над контролем достигает до 20%. Действие является сильным, если повышение числа клеток и активности иммунной системы составляет более 20% контроля (табл. 7).

0 5

0

0

Токсичность определена путем оценки морфолог ических изменений грану- лоцитов и лимфоцитов, васкулязации плазмы, фрагментации клеточного ядра, образования полисегментов и токсической грануляциИс, Токсичность выражена по следующей шкале: Наблюдаемые результатыТоксичностьОтсутствуют указанные изменения Отсутствует в имеющихся клетках 20%-ное изменение Средняя Изменение превышает 20%Высокая. Испытание противоопухолевого действия. In vitro.

К-562 клетки человеческой эритро- лейкемии и Р-388 клеточные культуры лимфомы мьш1и обработаны с 1- 100|1 г/мл испытуемого материала In vivo.

А. NK-ly-асцитная лимфома. 1 млн клеток асцитной лимфомы Немет-Келнера внутрибрюшинно трансплантированы в 20 мьш1ей-самцов вида OFLP (средний живой вес 30 г) (новая асцитная опухоль мьш1и использована в качестве средства для скрининга). Половина животных служила в качестве контроля, а другая обработана с 1/10 величины LD 50 различных соединений перорально и внутрибрюшинно в первый и пятый последовательные дни соответственно Если 1/10 величины LD д эффективна, была использована более низкая доза. В группе, подвергнутой одной обработке, цитоморфологическое определение асцитного мазка проведено после 24 ч и сделано соотношение поврежденных и уничтоженных клеток соответственно. В группах, обработанных в течение 5 дней, определен процент выживания.

.опухопъ.

10 клеток L jj опухоли трансплантированы внутрибрюшинно в 20 мьш1ей- самок вида ВДГ , весом 20 г. Обработка начата спустя 24 ч после трансплантации опухоли и продолжена в течение 8 дней. Каждая группа состоит из 5 животных; доза 5, 50 и 5ПО мг/кг перорально ежедневно. Контрольная группа также состоит из 5

животных„ Определен процент выживания .

В, Длинная опухоль Люиса.

В каждой группе использованы 6 ж вотных. Доза: 5 и 50 мг/кг. Контрол ная группа также состоит из 6 животных. В испытании использованы мыши-самки вида (вес 20 г).

Опухоль подкожно трансплантирована в мышцу правой ноги. После 10 дней нога ампутирована, оральная обработка начата и продолжалась в течение 9 дней. Животные умерщвлены и метастазы подсчитьгоались под сте- реомикроскопом.

Г. Собаки, принадлежащие к различным видам и имеющие спонтанную опухоль молочной железы (aiictxis СС) обработаны в течение 4 недель с 1-10 мг/кг оральными дозами испытуемых материалов. Осуществлено вырезание для испытания образцов тканей, для гистологического анализа.

Соединение согласно примеру 1 проявляет значительное противоопухолевое действие, так как ингибирует клетки человеческой эритролейкемии К-562 в тканевой культуре При концентрации 4 рг/мл. Кроме того, это соединение ингибирует распространение Р-388 клеток только при концентрации , а когда увеличивают концентрацию до 400f г/мл, активность не повышается.

Указанное соединение значительно уменьшает количество метастазов легких в длинной опухоли Люиса при дозе более низкой, чем 1/10 величины LDj.

Выявлено, что действие может быть усилено до значитольного большей степени путем повторения обработки, нежели увеличением дозы.

Соединение по примеру 1 является активным против NK-ly-асцитной опухоли при концентрации ниже 1/10 величины -Dro - соединение проявляет иммуностимулирующее действие при малых дозах, при более высоких дозах показьшает направленное противоопухолевое действие. Так, соединение проявляет иммуностимулирующее действие при дозах 25 мг/кг и является цитотоксичным при пределе доз 250- 500 мг/кг. Оно высокоактивно против спонтанной опухоли молочной железы у собак. При биопсии, взятой после обработки, проведриной Р течение 3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

4 недель, клеточная инфильтрация инвазивного характера обнаружена в опухолях (ductus СС), состоящих из лимфоцитов и нейтрофильных грануло- цитов, макрофагов и эпизодически эозинофильных гранулоцитов. На опухолевых клетках обнаружены дегенеративные изменения и сильная декомпозиция.

NK-клетки образуют плазма-мости- ковые связи с опухолевыми клетками и это вызьтает вауколярную дегенерацию (вьфождение) плазмы опухолевых клеток и большое прореживание в DNS расположении клеточного ядра. Соотношение клеточное ядро - плазма изменяется, клеточное ядро сильно набухает и базофильность - способность клеток воспринимать только основные красящие вещества плазмы - уменьшается.

Примерно в 1/4 случаях лейкоцит- ная инфильтрация в опухоли является незначительной; с другой стороны, опухолевые клетки набухают и гиали- ниально дегенерируют. В межклеточном пространстве отлагается весьма большое количество гиалиноокрашенного материалао

При оральном приеме соединения примера 1 при ежедневной дозе 30- 120 мг (0,5 - 2 мг/кг) в течение 6-12 мес отмечено значительное улучшение состояния или выздоровление в случае метастазов, опухолей молочной железы, опухолей половой железы женщины и опухолей поджелудочной железы человека.

Испытание противоопухолевого действия в сочетаниях.

Сочетание с известными цитостати- .ческими веществами.

Различные цитостатические вещества, имеющие биологическое алкилиру- юп1ее действие, введены вместе с полученными соединениями мышам вида CFLP, имеющим NK-ly-асцитную опухоль Цитостатические вещества бьши введены орально, внутрибрюштчно или внутривенно при дозе, соответствующей 1/5 или 1/10 величины LD или в наиболее эффектияной дозировке Полученные соединения введенц орально при дозе 1/10 шш 1/20 величины LDju один или несколько раз спустя 48 ч после обработки цитостатичес- ким веществом. Таким образом введены сочетания циклофосфлмида, карномустина, дегранола, дибромдульцита и диброммаиита, и соединение примера 1. По сравнению с контрольной группой, обработанной только извест н.гм цитостатическим веществом, противоопухолевое действие усиливается а иммунодепрессия уменьшается.

Сочетание с известными витаминам

Изотиурониевые галогениды могут быть скомбинированы со средними до- яами витаминов А и Dj и с высокими дозами витамина С. Хорошие результаты получены как при фармакологических испытаниях, так и при клинических случаях на людях„

Сочетание с известными гормонами.

При обработке опухолей, зависимых от гормонов, сочетание, как было доказано, является полезным как при фармакологических испытаниях, так и при клинических случаях на людях.

Использование в хирургии.

Полученные соединения использо- паны при фармакологических испытаниях в случае твердых опухолей до и после хирургической обработки (NK-ly твердая, Йоисда).

Формула изобретения

Способ получения изотиурониевых галогенидов общей формулы

С - NH - С

N - R,-HX,

/I NH

I S-R

где R, - С,-С -алкил , замещенный

оксигруппой, С -С -алкенил;

R2 - водород;

X - галоген,

отличающийся тем, что соединение общей формулы

ИН,-С-Ш1-С-ИНК,-НХ

II II

КПS

где RjH X имеют указанные значения, подвергают взаимодействию с соединением общей формулы

,

30 где RI имеет указанные значения. Таблица

Изобретение касается производных тиомочевины ,в частности, способа получения изотиурониевых галогенидов общей формулы 1: H₂N-C(NH)-NH-C(SR₁)=N-R₂^.HX, где R₁ - C_1-6-алкил, замещенный оксигруппой, C_2-6-алкенил

R₂ - H, X - галоген, обладающий противоопухолевым и иммуностимулирующим действием. Цель изобретения - создание новых более активных соединений указанного класса. Синтез ведут взаимодействием соединений общих формул П и Ш: H₂N-C(NH)-NH-C(S)-NHR₂^.HX (П) и R₁HAL (Ш), где R₁, R₂ и X - указаны выше

HAL - галоген. Новые соединения имеют сильное или среднее противоопухолевое и иммуностимулирующее действие при низкой токсичности (LD₅₀=2380-2860 мг/кг - перорально или 320 мг/кг - внутрибрюшинно), против средней активности и токсичности для известного соединения. 7 табл.

Примечание. Соотнощение эффекторные клетки: меченые

клетки 5:1. Инкубационный период 4 ч. Важные (р 0,05)

Нормальная NK (8)

32,9±2,5

Пониженная NK15,1±2,4

Примечание, Соотношение эффекторные клетки: меченые

клетки 50:1. Инкубационный период 4 ч. Важные (р 0,05)

Таблица 3

Контроль

Площадь миграции, мм , при дозе соединения 1, г/мл

0,1

10,,65 10,51±1,22 12,25±1,58 11,24tl,

римечание, Средние значения от семи здоровых

контрольных доноров: tS,E.M, Не важные Важные (р :0,01) Важные (,05)

Таблица 4

РИА, 2 РНА,10 СопА, 25

2116613774 22233t3688 2315642737 2540412860 2995914051 ,-29969t3557 3382613638 3379015203 1054513414 1056413764 14089t2602 1703813202

Примечание, Здоровые контрольные пациенты нормальной

реактивности; п 6,

43,412,7 -t-32%

25,343,2 +68%

47,6tl,4 +45%

32,213,2 + 113%

1,0

10,0

15

U9838A

МнтогенныйКонтрольАктивность, средние значения с.р.м.

реагент, р г/мл tS.E.M. при дозе, |хг/мл

0,11,0I10,0 ---------J------------1--«.-..- --- -1---..

Соединение

РИА, 2 3034tl293 28771984 4344±1153 .471611287

РИА, 10 5267±1392 5802±1504 632311161 696811669 СопА, 25 8041307 10971354 9351363 10231361

Примечание, Пациенты пониженной реактивности (опухоль

и SIE); п 6.

Таблица 6

Сое-LDfjMr/U

дииенияПероральио Внутрибрюшинно

123801320320130

328601180

Таблица7

Соединения Противо-Иммуности-Токсичесопухоле-мулирующеекое дейвые дей-действиествие ствия

1Сильное Сильное О

3Среднее Среднее О

Известное Среднее

Соединение формулы где R i CH.J, R j - Н

Составитель М„ Меркулова Редактор О. Спесивых Техред Й.Дидык Корректор М„ Максимишинец

Заказ 4463/58Тираж 352Подписное

ВНШИШ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производстненмо-изцательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

I fi Таблица 5