Способ определения изоэлектрической точки биологической ткани Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к способам определения изоэлектрической точки биологических тканей, и может быть применено в практике клинических, химико-токсикологических, ветеринарных лабораторий, в сельском хозяйстве, а также при изолировании веществ из биологических тканей на заводах химико-фармацевтической промьшшен- ности, при проведении биотехнологических исследований. Способ относится к числу массовых.

Целью изобретения является повышение точности и возможности определения изоэлектрической точки гнилостной ткани.

Цель достигается тем, что расти- Д тельную или животную ткань измельчают 5 мин при 5000 об/мин, берут | точные навески, окрашивают 4-10 М эозина и метиленового синего, отмывают краситель дистиллированной водой, затем помещают ткань в буферный раствор Бриттона-Робинсона на 10 мин соотношении ткань: раствор 1:5, отфильтровывают, измеряют оптическую плотность фильтрата при длинах волн 540 и 590 нм и интервалы изоэлектрической точки определяют графически по минимумам светопогло- щения растворов.

Способ осуществляют следующим образом.

3150

Биологическую ткань измельчают 5 мин при 5000 об/мин на микроизмельчителе ткани РТ-2; берут точную навеску, фиксируют 70%-ным этиловым спиртом, окрапшвают раствором эозина избыток которого отмывают дистиллированной водой до получения бесцветных смывов и раствором метиленового синего, избыток которого также отмы- вают, к отмытой ткани добавляют буферный раствор Бриттона-Робинсона со значениями рН 2 - 9 на 10 мин при соотношении ткань:расТвор, равном 1:5, затем раствор отфильтровывают от осадка, окрашенный фильтрат фото- метрируют при длинах волн 540 й 590 им. Интервал изоэлектрической точки ткани определяется по минимуму светопоглощения растворов при 540 и 590 нм.

Пример 1. Определение изоэлектрической точки свежей ткани печени, 100,0 г печени измельчают на микроизмельчителе ткани РТ-2 5 мин при 5000 об/мин. В 9 пробирок помещают по 1,0 г (точная навеска) ткани печени, добавляют по 5 мл 70%-но- го этанола, тщательно перемешивают, оставляют на 10 мин, после чего спирт сливают, а в каждую пробирку добавляют по 3,0 мл 0,1%-ного водного раствора эозина, перемешивают и оставляют на 10 мин для окрашивания. Избыток красителя отмывают дистилли- рованной водой до получения бесцветных смывов. Затем в пробирку добавляют по 3,0 мл 0,05%-ного раствора метиленового синего, тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин для окрашивания. Избыток красителя отмывают дистиллированной водой до получения бесцветных смывов, В каждую пробирку прибавляют универсальную буферйую смесь Бриттона-Робин- сона со значениями рН 3, 29, 4, 10, 4, 56, 5, 02, 5, 33, 6, 09, 6, 59, 7, 00, 8, 86, перемешивают и оставляют на 10 мин, после чего жидкость сливают с осадка, фильтруют и фото- метрируют на приборе «КФК в кювете

с толщиной рабочего слоя 5 мм при светофильтрах с длинами волн 540 и 590 нм. По результатам измерения строят кривые зависимости оптической плотности окрашенных буферных растворов от вели1ганы рН, Интервал изоэлектрической точки свежей ткани пе

5 0 5 0

5

0

чени определяют по минимумам светопоглощения растворов при 540 и 590 им.

Результаты определения изоэлектрической точки свежей ткани печени при- ведень в табл. 1,

П р и м в р 2, Определение изоэлектрической точки гнилостной ткани печени, 100,0 г гнилостнбй печени (3 мае) измельчают на микроизмельчителе ткани РТ-2 5 мин при 5000 об./мин, В 9 пробирок помещают по 1,0 г (точная навеска) ткани печени, добавляют по 5,0 мл 70%-ного этанола, тщательно перемешивают, оставляют на 10 мин, после чего спирт сливают, а в каждую пробирку добавляют по 3,0 мл 0,1%-ного водного раствора эозина, перемешивают и оставляют на 10 мин для окрашивания. Избыток красителя отмывают дистиллированной водой до получения бесцветных смывов. Затем в пробирку добавляют по 3,0 мл 0,05%-ного водного раствора меткле- нового синего, тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин для окрашивания. Избыток красителя отмывают дистиллированной водой до получения бесцветных смывов, В каждую пробирку прибавляют по 5 мл универсального буферного раствора Бриттона-Робинсона со значениями рН , 29, 4, 10, 4, 56, 5, 02, 5, 33, 6, 09, 6, 59, 7, 00, 8, 36, перемешивают и оставляют на 10 , после че1 о жидкость сливают с осадка, фильтруют через бумажный фильтр и фотометрируют окрашенные растворы на приборе КФК в кювете с толщиной рабочего слоя 5 мм при светофильтрах с длинами волн 540 и 590 нм. По результатам и 1море НИИ строят кривые зависимости оптической плотности окрашенных буферных растворов от величины рН, Интервал изоэлектрической точки гнилостной ткани паче и определяют по минимумам светоп.тлощения растворов при 540 и 590 нм.

Результаты определения изоэлектрической ткани печени-гнилостной приведены в табл, 2.

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов приведена в табл, 3,

Формула изобретения Способ определения изоэлектрической точки биологической ткани путем

приготовления препарата, окрашивания его последовательно эозином и мети- леновым синим, с последующей регистрацией изменения окраски и расчетом величины рН, отличающийся тем, что, с целью повьппения точности и возможности определения изоэлектри- ческой точки гнилостной ткани, ткань предварительно измельчают, окрашивание проводят А-10 М эозина и

метиленового синего в течение ТО мин каждым красителем, затем отмывают краситель водой, добавляют к ткани буферный раствор Бриттона-Робинсона при соотношении ткань:раствор 1:5, вьдерживают смесь 10 мин, отфильтровывают и измеряют оптическую плотность растворов при длинах волн 540 и 590 нм с последующим расчетом величины рН.

Изобретение относится к области биологии и медицины - к способам определения изоэлектрической точки биологических тканей и может быть применено в практике клинических, химико-токсикологических, ветеринарных лабораторий, а также при изолировании веществ из биологических объектов на заводах химико-фармацевтической промышленности. Цель - повышение точности способа. Для этого ткань гомогенизируют, фиксируют 70%-ным этиловым спиртом, окрашивают раствором зозина, избыток которого отмывают до получения бесцветных смывных вод, и раствором метиленового синего, избыток которого также отмывают водой. К отмытой ткани добавляют буферные растворы со значениями рН от 1,00 до 9,00, затем раствор отфильтровывают от осадка, а фильтрат фотометрируют при длинах волн 540 и 590 нм. Изоэлектрическую точку ткани определяют графически и находится она между минимумами светопоглощения окрашенных растворов. 3 табл.

№ I 1 точка2 точка

пп р-1 -г--

рН I Метроло- рН Метрологические гические характе- характеристики ристики

15,02ЗГ 5,146,09 X 6,09

25,33S 0,036,09

33,02Sx 0,016,09

45,02е„5 0,036,09

55,33А +0,58%6,09

Таблица 2

1 точка2 точка пп

рН I Метроло-рН Метрологическиегическиехарякте-характеристикиристики

14,565с 4,19 5,33X 5,14

24,10S 0,21 5,02S 0,17

34,10Sy 0,09 5,02S, 0,08

44,,25 5,,22

54,10А +5,97% 5,33А ±4,28%

Таблица 3

равниваемые j Способ

параметры f- 1

Предлагаемый Известный

Свежая ткань печени

одготовка

робы Измельчение Гистологический срез

зятие пробы Количественно Произвольно ценка ре-Субъективно

ультатов Объективно (визуально

Область изо- электрической точки одного образца, рН Относительная ошибка, %, для точки:

1

2

ьный для

±0,03 0,58 Результаты 0,95 5 измерений совпали Гнилостная ткань печени

Область изо- электрической точки, рН

4,19-5,14

Продолжение табл. 3

5,14-6,09

4,79-6,07

±12,11 +15,65

Пробу взять невозможно, изоэлектричес- кая точка не определяется