Способ определения кейлонов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 A61K37/02 

Изобретение относится к медицине и может быть применено для выявления и тестирования кейлонов и других биологически активных веществ.

Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорение способа определения кейлонов.

В основу способа определения кей- лонов положена впервые обнаруженная способность нормальных (неопухолевых) клеток органов мыши (печень, селе- зенка, тимус, легкое) под Действием соответствующих кейлонсодержащих экстрактов (КСЭ) обеспечивать краситель (метиленовую синь) в анаэробных (бескислородных) условиях.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят клеточную суспензию из печени, тимуса, легкого, селезенки мы- гаей, затем готовят агар и выделяют ингибитор из органов животных (бык)

и органов морских млекопитающих по известному способу. Для выделения rf действующего начала используют фрак- ционированное спиртовое осаждение белковых компонентов водных экстрактов . После этого соединяют клеточную взвесь, КСЭ и агар. Затем проводят учет результатов по степени обесцвечивания столбика агара.

Пример 1. Приготовление клеточной суспензии: забивают мышь и фиксируют на столике. Выделяют отдельно селезенку, печень, легкое тимус, очищают их от жира и соединительной ткани, переносят в чашки Петри с 0,5-0,8 мл среды 199 и каждый орган фрагментируют ножницами до получения однородной клеточной взвеси. К полученной смеси добавляют 2-2,5 мл среды 199 и фильтруют ее через капроновую сетку в центрифужную пробирку. Дважды отмывают средой 199 при цент

оэ

ND N3 -3

рифугиропаиии в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант удаляют, а к осадку добавляют свежей среды 199 и ресуспандируют пастеровской пипеткой. В камере Горяева подсчитывают количество клеток в одном миллиметре клеточной суспензии. Доводят концентрацию t клеток до 250000-300000 в одном миллилитре разведением средой 199.

Приготовление arajja. Расплавляют. , 0,5-1%-ный агар на фосфатном буфере (1/15 М, рН 7) и к нему добавляют 3- 4%-ную глюкозу. После охлаждения агара до 45°С в среду вносят краситель (метиленовую синь) до конечного разведения 1:50000-1:60000.

Выделение ингибитора. Кейлонсодер- жащие экстракты готовят из органов быка и органов моржа. Для этого у животного выделяют селезенку, печень, легкое, тимус, промывают их теплым физиологическим раствором. Затем измельчают ткань в гомогенизаторе, добавляя дистиллированную воду в соотношении 8:1. После замораживания при -20°С и оттаивания суспензию пропускают через марлевый фильтр и измеряют конечный объем, исходя из которого добавляют холодный 96%-ный этиловый спирт до конечной концентрации 70%. После выдерживания смеси при 4 С в те течение 1 ч образовавшийся осадок отделяют 10-минутным центрифугированием при 3000 об/мин. К надосадочной жидкости вновь добавляют 96%-ный этанол, доводя его концентрацию до 81%. Осажденную 81%-ную спиртовую фракцию лио- фильно высушивают. Из выеденных экстрактов делают навески 100, 200, 300 мкг. Каждую навеску растворяют в 0,5 мл физиологического раствора.

Готовят ряд пробирок, наливают в каждую 0,5 мл клеточной взвеси, затем в 1,2,3-ю пробирки вносят КСЭ до концентрации 100, 200, 300 мкг в 0,5 мл соответственно. В каждую пробирку добавляют по 2 мл агара. Конечная концентрация ингибитора составляет соответственно 33,3, 66,6, 100 мкг/мл. В контрольную пробирку вместо КСЭ вносят 0,5 мл физиологи- « ческого раствора. Такой ряд пробирок, используют для каждого набора клеток из различных органов - печени, селезенки, легкого тимуса - и добавляют в пробирки соответствующие кейлонсодер- жащие экстракты из тканей животных. Пробирки помещают в термостат при

173

20

25

22704

, учет результатов проводят через сутки.

В контрольной пробирке, содержащей

5 физиологический раствор, столбик агара остается синим.

В пробирке N 1 с конечной концентрацией ингибитора 33,3 мкг/мл происходит обесцвечивание столбика агара

10 на одну треть. Интенсивность реакции + .

В пробирке № 2 происходит обесцвечивание столбика агара на две трети (конечная концентрация ингибитора

15 66,6 мкг/мл). Интенсивность реакции н-.

В пробирке № 3 с конечной концентрацией ингибитора 100 мкг/мл происходит полное обесцвечивание столбика t агара. Интенсивность реакции +++.

Пример 2. Все операции проводят аналогично примеру 1. Изменяют концентрации агара и глюкозы: 0,5-1%- ный агар обеспечивает необходимую диффузию ингредиентов реакции, агар плотной концентрации (более 1%) препятствует диффузии ингредиентов реакции, агар менее плотной концентрации не дает достаточной плотности состава, не удерживает ингредиенты, переместившиеся в результате диффузии, 3-4%-ная глюкоза используется как поглотитель кислорода, ее концентрация менее 3-4% не обеспечивает поглощения

35 всего находившегося в растворе кислорода и не создает анаэробных условий, концентрация глюкозы более 4% нарушает химический состав среды и препятствует прохождению реакции.

40 Пример 3. Все операции проводят аналогично примеру 1. Изменяют концентрацию метиленовой сини. Концентрация метиленовой сини в разве- дении 1:50000-1:60000 дает возмож45 ность по изменившейся окраске, т.е. обесцвечиванию метиленовой сини, визуально оценивать результаты реакции. Меньшая концентрация метиленовой сини не дает визуально регибрируемые изме50 нения, т.е. просто не видна в пробирке. Концентрация метиленовой сини более 1:50000-1:60000 ведет к неполному. ее обесцвечиванию клетками и нарушению результатов реакции.

30

Данный способ позволяет повысить чувствительность определения кейлонов в кейлонсодержащих экстрактах в 105 17322706

100 раз и ускорить его в 5 раз полью повышения чувствительности спосо сравнению с прототипом. tба и его ускорения, в качестве кле- Формула изобретенияточной системы используют взвесь кле- Способ определения кейлонов, Biym-iток печени или селезенки, дегких, ти- чающий введение кейлоисодержащёго5 муса мьшш, в качестве агара испольэу- субстрата в клеточную систему, после-ют агар, содержащий глюкозу и метипе- дующее внесение полученной смеси вновую синь, при этом регистрацию ре- агар и регистрацию результатов, о т -эультатов проводят по обесцвечиванию личающийся тем, что, с це-агара.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения кейлонов. В основу способа положена способность нормальных (неопухолевых) клеток некоторых органов мыши под действием ингибиторов - кей- лонсодержащих экстрактов (КСЭ) - обесцвечивать метиленовую синь в анаэробных (бескислородных) условиях. Цель - повышение чувствительности и1 ускорение способа. Ингибитор вносят в клеточную систему, представляющую собой взвесь клеток некоторых органов мышей. Клеточную систему соединяют с агаром специального состава, содержащим краситель, при этом регистрацию результатов проводят по изменению окраски агара.