Способ количественного определения реакционноспособных по отношению к пара-нитроанилидам аминокислот функциональных групп на нерастворимых носителях Советский патент 1989 года по МПК B01J20/26 G01N21/33 

Изобретение относится к химии полимеров и аналитической химии, а именно к способу количественного определения реакционноспособных по отношению к пара-нитроанилидам аминокислот функциональных групп на нерастворимых носителях, и может быть использовано в биотехнологии при анализе реакционноспособных полимеров и их производных.

Цель изобретения - повьппение чувствительности и точности анализа и упрощение процессцц.

Реакционноспособными функциональ- ньми группами, определяемыми согласно предлагаемому способу, являются альдегидные группы (-CHD), п-бензохиR(-Ш-/1)

ноновые

диазониевые

( )иодацетильные (CHI-COOCH,), бромциановые (CNBr-), взаимодействующие с п-нитроанилидами аминокислот

(H-iC-CH-CONHв качестве п-Ештроанилидов ами- нокислот используют п-нитроанилиды L-лейцина, глихдана, L-аланина; в качестве нерастворимых носителей используют нерастворимые носители полимерной природы либо неорганические кремнийсодержапще носители.

Пример 1 (сравнительный). Реактив: 1-10- М раствор L-лейцин- п-нитроанилида в 0,1 М фосфатном буфере рН 6,90 (25,1 мг в 100 мл).

Навеску анализируемого носителя 0,100 г (м 0,100 г) контактируют в 5 колбочках с 40 мл раствора реактива 19 ч. После этого носитель со связанным п-нитроанилидом отделяют сепарацией и промьшают на вакуум- фильтре до полного отсутствия п- нитроанилида в промывном растворе. Отсутствие его в промьшном растворе контролируют определением после гидролиза 1 M.NaOH. Промытый носитель со связанным реактивом суспевдиру- ют в 10 МП. воды, переносят в мерные колбы на 100 МП, добавляют 6 мл 1 М NaOH и гидролизу1от 30 мин при в термостатируемой водяной бане Потом охлалсдают до комнатной температуры, нейтрализуют 1 М раствором НС1 до рН 7, доводят колбу до метки фосфатньш буфером, перемешив ают и измеряют оптическую плотность раствора при 405 нм, относительно буферного раствора.

Параллельно проводят контроль на гидролиз полимера Также берут навеску (0,100 г) самого полимера (без связанного п-нитроанилида) и проводят те же операции.

Содержание альдегидных групп рассчитывают по формуле

С i2c,2i):Yilo,

м-Е 1000

где Dg - средняя оптическая плотность (из пяти параллельных определений) гидролизата полимера с альдегидными rpynпами;

D - оптическая плотность гидро- лизата самого полимера (без связанного п-нитроанилида);

0

5

0

5

0

5

0

V - объем мерной колбы для гидролизата, мл;

М - масса навески полимера, г; Е - коэффициент молярного

светопоглощения при 405 нм (,62 103, согласно известному способу).

При М 0,100 г; V 100 мл; Е 9,62 10 М (согласно известному способу); DC - 0,212; D 0,020; ,0 мкмоль/г.

Относительное стандартное отклонение () +3%,

П р и М е р 2. Реактив: М раствор L-лейцин-п-нитроанйлида в 0,1 М фосфатном буфере рН 6,90 (25 мг в 25 мл).

Шесть навесок полимерного носителя по 0,100 г каждую (,100 г) переносят в колбочки для проведения контактирования. К одной добавляют 5 мл О,1 М фосфатного буферного раствора, а к другим по 5 мл раствора реактива Колбочки закрывают пробками, перемешивают и оставляют для контактирования в темном месте на 19 ч. После этого контактные растворы с реактивом и сам реактив доводят до 50-кратного разбавления буферным раствором, измеряют оптическую плотность при 310 нм.

При М 0,100 г; Dg 0,30; DO 1,04; D 0,933; п 50; М 251,3. Содержание альдегидных групп ,6 мкмоль/г.

Молярный коэффициент светопоглощения, выражающий чувствительность, рассчитьшают по формуле

Е -5-.

с- е

где с - молярная концентрация раствора.

с

V

Е 13-103.

Относительное стандартное отклонение (п 5) + 1,5%.

Определение концентрации п-нитроанилида по оптической плотности при 310 нм возможно в условиях их линейной связи, что иллюстрируется данными табл, 1.

Влияние температуры на результаты аиализа функциональных групп альде- гидсилохромов и бензохинонсилохромов приведено в табл 2

Данные по примерам приведены в табл.3, сопоставительные данные, до51509111

называющие преимущества предлагаемого способа - в табл. 4

Формула изобретения

Способ количественного определения реакчионнрспособных по отношению к пара-нитроанилидам аминокислот функциональных групп на нерастворимых носителях путем обработки носителя растврром пара-нитроанилида аминокислоты, последующего спектрофотометри- ческого определения продукта реакции и расчета количества реакционноспособ- ньрс групп, отличающийся

(п Do+Dp)-n.D)vma-10

М-П DO V

мкмоль/г

где п - кратность разбавления растт вора реактива до и после обработки носителя;

Од - оптическая плотность разбавленного раствора реактива;

D-, - оптическая плотность буферного раствора после обработки носителя;

D - оптическая плотность разбавленного раствора реактива после обработки носителя;

V - объем реактива, взятого для

контактирования с носителем, мл;

Продолжение табл.2

Изобретение относится к химии полимеров и аналитической химии и позволяет проводить количественное определение реакционноспособных по отношению к паранитроанилидам аминокислот функциональных групп на полимерных и минеральных носителях с точностью выше 3% по упрощенной методике. Это достигается обработкой носителя п-нитроанилидом аминокислоты в течение 2-20 ч при 10-60°С, спектрофотометрированием при длине волны λ=310 нм и расчетом количества функциональных групп (мкмол/г) по формуле C=(N^.D_O+D_б-N^.D)^.V^.M_O^.10⁶/M^.N^.D_O^.V_O^.*98M, где D_о - оптическая плотность разбавленного раствора реактива

D_б - оптическая плотность буферного раствора, после обработки носителя

D-оптическая плотность разбавленного раствора реактива после обработки носителя

N-кратность разбавления раствора реактива до и после обработки носителя

M_о - масса навески реактива, г

V_о - объем мерной колбы, взятой для приготовления раствора реактива, мл

μ - масса навески анализируемого полимерного носителя, г

V - объем реактива, взятого для контактирования с носителем, мл

М- молекулярная масса п-нитроанилида аминокислоты. 4 табл.

Альдегидная

L-лейцина

Таблица 3

60

0.5

405

20,0

Молярность раствора реактива М

Количество носителя, взятое для анализа, м, г Количество реактива, взятое для инкубации, мл Время инкубации, ч Количество и продолжительность операции после инкубации:

Отделение носителя Разба:вление раствора сепарацией (10 мин) реактива (5 мин)

Промывание носителя на вакуумфильтре (5 мин)

Суспендирование но- Измерение опт. плотноссителя водой и перенос в мерные колбы (5 мин)

Добавление раствора NaOH (2 мин)

Гидролиз при (30 мин)

Охлаждение до комнатной температуры (5 мин)

Нейтрализация кислотой (5 мин)

Разбавление буферны раствором до метки (5 мин)

Измерение опт.плотностей при 5405 нм (5 мин)

.Таблица 4

4-10-3 0,100

5 19

Разбавление раствора после инкубации (5 мин)

тей при 310 нм (5 мин)