СПОСОБ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ Российский патент 1994 года по МПК G01N21/78 

Изобретение относится к аналитической химии аминокислот, а именно способу спектрофотометрического определения пролина или триптофана в растворах в присутствии других α -аминокислот (лейцин, изолейцин, валин, глутаминовая кислота, аланин) с помощью реагента 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана.

Изобретение может быть использовано для анализа продуктов ферментационного процесса биосинтеза пролина или триптофана, в ходе которого образуются указанные выше алифатические аминокислоты.

Известен способ количественного спектрофотометрического определения аминокислот, реакционноспособных по отношению к пара-нитроанилидам (на нерастворимых носителях). Полимер обрабатывают нитроанилидом аминокислоты (лейцина, глицина, аланина). Определяют реакционные по отношению к нитроанилидам функциональные группы (альдегидные, бензохиноновые и т. д. ), фотометрируя при 310 нм [1] .

Однако способ длителен, трудоемок и не позволяет проводить раздельное определение аминокислот в смеси.

Известен способ спектрофотометрического определения аминокислот с помощью цветореагента (1-хиноксалил-2)-3-метил-5(n-карбоксифенил) формазана в присутствии нитрата ртути [2] .

Однако предложенный способ не обеспечивает селективности определений аминокислот в смеси.

Известен способ спектрофотометрического определения триптофана путем расщепления гетероцикла действием азотистой кислоты и получением окрашенных продуктов [3] .

Предложенный способ также не обеспечивает селективность определения аминокислот в смесях.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к настоящему способу является способ количественного спектрофотометрического определения аминокислот с применением нингидринового реагента [4] .

Однако использование указанного реагента не позволяет проводить селективные определения одних аминокислот в присутствии других, поскольку образующиеся продукты реакции для большинства аминокислот имеют полосы поглощения, накладывающиеся друг на друга.

Таким образом, известные способы не позволяют проводить количественные определения отдельных аминокислот в смесях без их предварительного разделения.

Целью изобретения является повышение селективности определения пролина или триптофана в присутствии других аминокислот, образующихся в продуктах ферментации при их биосинтезе, а также упрощение способа.

Цель достигается за счет того, что в способе определения триптофана или пролина в присутствии других аминокислот анализируемую смесь обрабатывают раствором 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана и определяют содержание пролина или триптофана фотометрированием раствора в области 500-550 нм. 7-хлор-4,6-динитробензофуроксан в указанных условиях реагирует со всеми аминокислотами, находящимися в анализируемой смеси. Однако контрастность продуктов реакции (сдвиг максимума поглощения продукта реакции по сравнению с максимумом поглощения реагента) для пролина и триптофана значительно больше, чем для других аминокислот. Этот факт позволяет проводить определение пролина или триптофана в присутствии других аминокислот.

П р и м е р 1. Определение пролина или триптофана в искусственной смеси аминокислот.

Для определения пролина или триптофана в анализируемой смеси аминокислот готовят неводный (ацетонитрил, спирты) раствор реагента - 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана с концентрацией 10^-2 моль/л. В мерную колбу объемом 25 см³ отбирают 1 см³ анализируемого раствора, содержащего 0,01-0,2 мг аминокислот, добавляют 4 см³ раствора реагента (7-хлор-4,6-динитробензофуроксана) и доводят содержимое мерной колбы до метки буферным раствором с pH 6,86. Полученный раствор фотометрируют при длинах волн 500-550 нм относительно раствора сравнения, содержащего раствор реагента той же концентрации. Содержание пролина или триптофана определяют по градуировочному графику или методом добавок. Для построения градуировочного графика готовят растворы, содержащие 0,01-0,2 мг пролина или триптофана в мерной колбе на 25 см³, добавляют 4 см³ реагента и доводят содержимое колбы до метки буферным раствором с pH 6,86. В указанных условиях наблюдается появление оранжевой окраски анализируемого раствора, связанной с образованием продуктов реакции с триптофаном или пролином. В то же время остальные аминокислоты (валин, лейцин, изолейцин, аланин, глутаминовая кислота, глицин) с реагентами образуют продукты реакции, не мешающие определению триптофана или пролина. Результаты, аналогичные определению триптофана, получены для определения пролина.

В таблице представлены результаты определения пролина или триптофана в присутствии указанных выше аминокислот.

П р и м е р 2. Определение триптофана в культуральной жидкости биосинтеза триптофана.

Ферментационный раствор подготовлен в анализу следующим образом:
Биомасса продуцента отделена центрифугированием,
После подкисления соляной кислотой фильтрата культуральной жидкости до pH 1 выпавший осадок отделен повторным центрифугированием.

Фильтрат нейтрализован буферным раствором 7,05 и затем проведено определение содержания триптофана методом добавок настоящим способом.

В результате определения получено содержание триптофана в культуральной жидкости 8,7±0,1 г/л.

Сущность: способ позволяет селективно определить пролин или триптофан в присутствии других аминокислот. Для этого к раствору пробы добавляют избыток раствора 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана в органическом растворителе, нейтрализуют раствор и регистрируют оптическую плотность раствора в области 500 - 550 нм. В этой области спектра поглощают только продукты реакции пролина или триптофана с цветореагентом, что позволяет селективно определять указанные аминокислоты в смеси с другими аминокислотами без предварительного их выделения. 1 табл.

СПОСОБ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ, заключающийся в том, что к анализируемой пробе добавляют раствор цветореагента и фотометрируют полученный раствор, отличающийся тем, что, с целью селективного определения триптофана или пролина в присутствии других аминокислот и упрощения способа, в качестве цветореагента добавляют раствор 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана в органическом растворителе, затем нейтрализуют раствор, а фотометрируют при 500 - 550 нм.