Способ получения иммобилизованного трипсина Советский патент 1989 года по МПК C12N11/00 C12N11/14 

1

(21)430876А/31-13

(22)01.10,87

(46) 30.10.89. Бкш. Я- 40

(71)Вильнюсский государственный университет им. В. Купсукаса

(72)В.Г. Бендикене, А.А, Раэюнас и Б«А. Юодка

(53)577.15(088.8)

(56)Введение в прикладную энциклопе, дию/Под ред. И.В. Березина

и К. Мартинека, М., МГУ, 1982, с. 112.

Е. van Leemputten and М, Horisbe rger. Immobilization of enzymes on magnette particles. - Biotechnol, Bioeng. Vol. XYI, p. 385-396, 1974.

(54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ТРИПСИНА

(57)Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению иммобилизованного трипсина. Цель изобретения - упрощение процесса и повышение стабильности иммобилизованного трипсина. Способ заключается в обработке ф рромагнетита с диаметром пор 80-100 А -аминопропилтриэтоксн- силаном до достижения концентрации первичных аминогрупп I40-200 мкмоль на 1 г сухого носителя, модифицирование полученного производного глутаровым альдегидом, взятым в 25-30- кратном избытке по отношению к концентрации первичных аминогрупп носителя, связывании трипсина с носителем. Способ позволяет упростить процесс получения иммобилизованного трипсина, а также увелнчить его стабильность.

ё

сл

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению иммобилизованного трипсина. Цель изобретения - упрощение процесса и повышение стабильности иммобилизованного трипсина. Способ заключается в обработке ферромагнетита с диаметром пор 80... 100А J-аминопропилтриэтоксисиланом до достижения концентрации первичных аминогрупп 140...200 мк/моль на 1/г сухого носителя, модифицировании полученного производного глутаровым альдегидом, взятым в 25...30 - кратном избытке по отношению к концентрации первичных аминогрупп носителя, связывании трипсина с носителем. Способ позволяет упростить процесс получения иммобилизованного трипсина, а также увеличить его стабильность.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения иммобилизованных белков,и может найти применение в химической, фармацевтической, пищевой промышленности и в медицине дпя проведения ферментативных реакций.

Цель изобретения - упрощение процесса и повышение стабильности иммобилизованного трипсина.

Способ заключается в обработке ферромагнегита с диаметром пор 80- 100 X аминопропилтриэтоксисиланом (-АПТЭС) до достижения концентрации первичных аминогрупп 140-200 мкмоль на 1 г сухого носителя, модификации полученного производного глутаровым

альдегидом, взятым в 25-30-кратном избытке по отношению к концентрации, первичных аминогрупп носителя, связывании трипсииа и удалении несвя- завшегося белка отмыванием. Использование указанных приемов позволяет иммобилизовать трипсин на носителе с ферромагнетитными свойствами и получить крг1йне стабильный препарат, сохраняющий неизменную активность в течение 24 мес и 50% активности через 36 мес.

Предлагаемый способ проще известного, так как стадия активации носителя сокращена на одну стадию и в процессе активации исключено использование токсических веществ.

ел

OD СО

СО

Пример 1. Получение ферромаг- нетита. Частицы ферромагнетита коллоидных размеров получают осаждением водных растворов смеси солей двух- и трехвалентного железа, выбранных из групп сульфатов и хлоридов, растворами щелочи по известным методикам,

28 г сернокислого закисного желе- за (FeS04 ,0) растворяют в 750 мл воды и 55,5 г ТЦ-хлорного железа ( ) растворяют в 750 мл воды. Полученные растворы смешивают пр комнатной те.мпературе и Э1у смесь вводят в 50 мл (избыток составляет 27% от зквимолярного количества раствора аммиака) 25%-ного раствора аммиака Полученную смесь перемешивают и отстаивают в течение 1,5 ч, жидкость над осадком сливают в количестве 1,15 л, что составляет 70% маточного раствора, быстро промывают двумя порциями воды по 500 мл 300 мл ацетона, порциями по 150 мл смеси ацетон- i Jлvoл (в соотношении 4:1, 3:2, 2:3, i:4) и дважды толуоло по 150 мл и быстро используют для дальнейших опытов. Диаметр пор фер- омагнетита 80-100 А.

Силанизация ферромагнетита. Полученный магнетит высушивают (придерживая его постоянным магнитом) фильтровальной бумагой, взвешивают и переносят в круглодонную трехгор- лую колбу, снабженнуь:) механической мешалкой, термометром и холодильником, К магнетшу приливают раствор у-АЛТЭС в толуоле (соотношение ве- соных количеств магнетита, } -АЛТЭС и толуола 1:1:10) и кипятят при температуре кипения растворителя в течение 10-25 ч (с перерывами)с После охлаждения смеси магнетит придерживают постоянным магнитом, раствор сливают, осадок промывают толуолом (порциями по 100 мл 5-6 раз), затем тщательно этиловым спиртом (по 100 м 3-5 раз) и высушивают при комнатной температуре в чашке Петри,

В силанизированньгх образцах магнетита (в зависимости от продолжения времени реакции с у -АПТЭС) определяю концентрацию первичных аминогрупп в 1 г сухого магнетита,измеряя УФ-по

глощение этанольного раствора салицилового альдегида до реакции с образцами и после нее. Затем рассчитывают концентрацию свободных первичных амис

5 0 5 Q

c 0 5 Q

5

ногрупп в мкмолих на I г сухого магнетита . ,

При продолжении реакции силаниза- ции до 30 ч количество первичных аминогрупп на поверхности носителя не увеличивается. Поэтому прод пение реакции сверх 25 ч нецелесообразно с экономической точки зрения, 15 зависимости от времени обработки v-АПТЭС кон1;ентрация аминогрупп варьирует от 70 до 200 мкмоль на 1 г носителя.

2,3 г силанизированного магнетита с концентрацией первичных аминогрупп 70 мкмоль/г промывают водой, заливают 25-кратным избытком (1,6 мк) (по отнотенню к молю первичных лмино- групп) глутарового альдег-ида f 25- кратный избыток глутарового апьдеги- да на моль первичшлх NH2-rpyi n подобран во избежание кросслинкинга -.)еж- ду д)зумя молекулами ног:ителя м r.fcne- кулы диальдегида ),; Затем прибапляют 5,4 мл воды, перемешивают i ч при комнатной температуре, промывают водой путем декантации, придерживая постоянным Muri-штом, затем двумя порциями по 15-20 мл 0,ОЛ М Са (СН цСОО) .j, К влажному моднфициро- ааниому глутарал ьдес идг м м ai i nnH- рованному MarHGTH v ирлбакляь: г б мл раствора трипсиь а (концентрация Зел- ка 5 ) в 0,002 М :а (di з-;:ооУ . Суспензию 1еремешивают Hc i леля,1ой бане Б течение 2 ч,, Магне ;: ti .;р зм1:1- ваюг начальным б7ФepIIЫ p i :TDOpO;4 до огоутствия 1 npONii-иэных водсчх -Jei - ка, измеряемогс, при /VK-IHP ролны 280 им,

И р и м е р 2, 2,3 г сипапизир - ванного магнетита с кокценграцией первичных аминогрупп 140 мкмоль/г, промывают водой, заливают 4 ил rjry- тарового альдегида, 3 мл воды, перс- г ешнвают 1 ч при комнатной температуре, промывают водой путем декантации, придерживая магнетит постоянным Мгаг- нитом, затем двумя порциями по 15- 20 нл 0,002 М Са(СНзСОО)г. К влажному глутаральдегидом модифицированному магнетиту прибавляют 6 мл раст- всфа трипсина (концентрация белка 5 иг/мл) в 0,002 М Ca(CH}COO). Сус- пензшо перемешивают на ледяной бане в течение 2 ч, Магнетиты промывают начальным буферным раствором до отсутствия в промьшных водах белка, измеряемого при длине волны 280 нм.

51

П р и м е р 3. 2,3 г сштапиэяро- ванного маг)1етигн (пример 2) с концентрацией первичных аминогрупп 180 мкмоль/г, промывают водой, заливают 4,1 MJ1 глутарового альдегида, 2,9 мл воды, перемеш7-1нают 1 ч при комнатной температуре, промывают водой путем декантации, придерживая маг нетит постоянным магнитом, затем двумя порциями по 15-20 мл 0,002 М Са(СНзСОО)-г. К влажному глутараль- дегидом модифицированному магнетиту прибавляют 6 мл раствора трипсина (кошдентрация белка 5 мг/мл) в 0,002 М Са(СН-,СОО)2 . Суспензию перемешивают на ледяной бане в 2 ч, Магтгетиты промывают начальным буферным раствором до отсутствия в пром1-1вных водах белка, измеряемого по длине волны 280 им,

П р и м е р 4, 2,3 силанизирован- но;о магнетита (пример 2) с концентрацией перзичф1х аминогрупп 200 мкмоль/г, пpo ывaют водой, заливают 5,6 мл глутарового альдегида, ),4 мл зоды, перемешивают 1 ч при комнатной температуре, промывают водой путем декантации, придерживая магнетит постоянным магнитом, затем двумя порциями по 15-20 мл 0,002 М Са (СН ;|СОО) 3 . К влажному глутаральде- гидом модифицированному магнетиту прибавляют 5 мл раствора трипсина (концентрация белка 5 мг/мл) и 0,02 Са(СНзСОО)о, Суспензию перемешивают на ледяной бане в течение 2 Чз Магне титы промывают начальным буферным раствором до отсутствия в промывных водах белка, измеряемого при длине волны 280 нм.

В зависимости от концентрации первичных аминогрупп на поверхности силанизированного магнетита (при сохранении идентичных условий иммобилизации для всех исследуемых образцов) резко меняется количество иммобилизованного белка Так, при концентрации 70 мкмоль/г, иммобилизуется лишь 0,45 мг/г, а при концентрации 140, 180 и 200 мкмоль/г - 1,8; 2,5 и 2,8 мг/г белка соответственноо Таким образом, оптимальным количеством первичных МН2 групп для связывания наибольшего количества белка является 140-200 мкмоль на 1 г сухого носителя. Кроме того, верхним пределом концен грации является как раз 200 мкмоль/г, так как при продолже3736

НИИ нремени силанизации больше 25 ч, количество вводимых аминогрупп не меняется. Эффективность иммобилизации при добавлении 25- или 30-кратного избытка глутарового альдегида одинакова.

Эстеразную активность определяют со специфическим субстратом 4-нитро- Q анилиДОМ-N-бензоил-DL-аргинина (BApNA).

Удельная активность трипсина определяется количеством мкмолей п-нитро5 анилина, образовавшегося во время ферментативного гидролиз-а субстрата за 2 мин при 37°С, при рН 8,2 на 1 мг белка.

Полученный препарат иммобилизован0 ного трипсина хранится в течение двух лет без потери активности, а-через три года его активность стяжается на 50%.

Термостабильность полученного пре5 парата вьпие изпесть ого при температуре в течение 1 ч, активность препаратов падает соответственно на 50 и 70%.

Таким образом, использование предQ лагаемого способа позволяет существенно упростить процесс получения целевого продукта за счет ис лючения одной стадии активации носителя и проведения процесса сез использования токсических веществ. Кроме тог о, полученные препарат г иммобилизованного трилс;ина обладают повьпиеннои термостабильностью и высокой стабильностью при хранении.

0

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованного трипсина, включающий обработку

, (Ьерромагнетита -аминопропилтризток- сисиланом, модифицирование полученного производного химическими реагентами, присоединение трипсина и отмывание несвязавшегося белка, о т л иQ ч ающий с я тем, что, с целью упрощения процесса и повьштения стабильности целевого продукта, используют ферромагнетит с диаметром пор 80-100 А, обработку ферромагнетита аминопропилтризтоксисиланом ведут до достижения концентрации первичных аминогрупп 140-200 мкмоль на I г сухого носителя, а модифицирование полученного производного проводят глу5

715183738

таровым альдегидом, взятым в 25- концентрации первичных аминогрупп ио- 30-кратном избытке по отношению к сителя..