Способ иммобилизации протеалитического комплекса-трипсина, химитрипсина и карбоксипентидазы (панкреатина) Советский патент 1979 года по МПК A61K38/46 C12N11/16 

3 Цель цосгигаегся за счет того, что связывание панкреатина с активированны Носителем- осуществляют при рН 8 (до стигаемом введением 0,05 N едкого натра) в среде дистиллированной воды и в присутствии казеина, причем казеин фермент носитель берут в весовых отношениях 11«12:2,3-2,5:100. Описываемый способ иммобилизации панкреатина обеспечивает получение целе Roro пропукта с высокой активностью (15-20 ед/гсухого носителя) и увеличение выхода связанного активного белка (13 мг/г сухого носителя). При добавле нии казеина в реакционную среду происходит блокировка активных центров ферментов, входящих в состав комплекса. В результате этого связывание катализато™ ра с активированным глутаровым альде,гидом носителем осуществляется только через аминогруппы аминокислот, не входящих в состав активных центров фермен тов. Добавление казеина и осуществление процесса в среде дистиллированной воды при рН 8 предотвращает инактивацию ферментов.. Описывается предлагаемый способ им мобилизации протеолитического комплекс трипсина, химотрипсина и карбоксйпентидазы (панкреатина) с высокой удельной активностью целевого пршукта и высоки выходом количества, связанного с носителем активного белка путем.ковалент-ного связывания ферментов с аминосиланизированным неорганическим Носителем (оилохромом), предварительно активированным глутаровым альдегидом при рН 8,О в среде дистиллированной воды в присутствии казеина, причем казеинфермент-носитель берут в весовых отношениях 11-12:2,3-2,5:1ОО. Способ осуществляют: -силохром обогащают аминогруппами с помощью Тр-аминопропилтри.этоксисилана;-аминосиланизированный силохром активируют глутаровым альдегидом; активированный носитель в присутс вии казеина в дистиллированной воде пр водят в контакт с очищенным панкре- .атИном в весовых отношениях : 11-12 казеина: 2,3-2,5 ч.фермента: 10О ч,но сителя. П р и м е р. К 0,1 кг сухого амино сиданизированного силохрома (марки -CX-l или C-8Q) прибавляют 1 л 2,5%-.н раствора глутарового альдегйна, пе ремешивают в течение 30 мин, с помо7Ощью вакуума поры носителя освобождают от воздуха и оставляют на 30-6О мин при комнатной температуре и нopмaльнo атмосферном давлении. Фильтруют и 3 раза промывают дистиллированной водой. Сушат при .температуре + 80°С в течение 45 ч. К 0,4 кг влажного (0,1 кг сухого) активированного носителя добавляют 0,6 л 2%-ного раствора казеина в дистиллированной воде, содержащего 2,5 г очищенного панкреатина с активностью 2000 ед/на 1 г, перемещивают в течение ЗО мин., с помощью вакуума освобождают поры носителя от воздуха и оставляют на 30 мин при комнатной температуре и нормальном атмосферном даапении (рН средь 1 8,0). Фильтруют и 3 раза промывают дистиллированной водой. Выход 0,4 кг влажного иммобилизованного панкреатина с активностью 15 20 ед/на 1 г-сухого носителя и содержанием активного белка 13 мг/г сухого носителя. Активность препаратов иммобилизованного препарата панкреатина определяют по следующей метбдикв В сосуд (термостатируемый при ) наливают 30 мл 2%-ного раствора казеина по Гаммерстену на дистиллированной воде (рН - 8) и помещают 0,5 г влажного иммобилизованного панкреатина. Инкубируют в течение ЗО мин при непрерывном перемешивании. Пробы (2.мл) при работающей мешалке берут через каждые 5 мин. Нерасщепленный белок осаждают с 2 мл 5%-ного раствора трихлоруксусная кислота. Контроль - 2 мл 2%-ного раствора казеина осаждают 2 мл 5%-ной трихлоруксусной кислоты. Оптическую ПЛОТНОСТЬ определяют на спектрофотометре СФ-16, Л 280 нм. Активность иммобилизованного панкреатина определяют по формуле: СП Н 1,3 время инкубации 0,ОО82 ПЕ на 1 г сухого носителя, где СП - изменени е оптической плотности в пробе в течение времени инкубации: Н - объем пробы; 1,3 - тирозиновый эквивалент; О,ОО82- вес иммобилизованного п.чнкре- атина в 2 мл к.-:эзе11нп (содержание сухого препарчтл в 0,5 г влажного - 0,125 г).

Формул гэ изобретения

Способ иммобилизации протеолитиче- ского комплекса - трипсина, химотрипсина и карбоксипептидазы (панкреатина) путем ковалентного связывания с аминосиланизированным неорганическим носителем - силохромом, активированным глутаровым альдегидом, отличающийся тем, что, с целью повышения активности нерастворимого комплекса ферментов, увеличения выхода количества связанного с носителем активного белка, и упрощения процесса связьшание проводят при рН 8 в среде дистиллированной воды и в присутствии казеина, причем казeин-фepмeнт-нocиteль берут в весовых отношениях 11-12; 2,3-2,5:100.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Иммобилизованные ферменты под ред. Березина И. В.,. Мартинека К, и Антонова В. К., изд-во МГУ, 1976.

, 2. Крен М. И., Эрин А. Э,, Кивисилла А, К., Лукатввиченс Н. Ю., Кестнер А. И. Гидролиз некоторых белков иммобилизованными прртеазами, XI Мендеплевский съезд по общей и прикладной химии, рефераты докладов и сообщений, Биохимия № 6, М., 1975, с. 65 (прототип).