Изобретение относится к биотехно- логиии, а именно к получению клеток- продуцентов различных белков.
Цель изобретения - получение штамма межвидовых гибридом мышь-норка, обладакщего более высокой продукцией и синтезирующего более стабильньй при зфанении Ig норки.
Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур под 231,
Пример 1. Морфология клеточной культуры.
Культура гибридных клеток представляет собой округлые, слабо прикрепляющиеся к субстрату, несколько варьирующие по величине, с ядрами,
занимакщими большую часть клетки. Цитоплазма в виде тонког о ободка, Иногда ядро смещено.
Кариология штамма. Модальный класс хромосом штамма 82-85. Среды хромосом клеток как телоцентрические (мышиные), так и метацентрические (но- рочьи),
Культуральная характеристика.
Среда культивирования: среда ДЕМЕ или RPMI-16AO с 10% эмбриональной коровьей сыворотки, 2 m М глютамина 80 мкг/мл гентамицина.
Характер роста клеток: стационарная суспензия. Частота пересевов: через 3-4 сут. Посевная доза клеток:
ю
31
. Кратность рассева: 1:2 1:3.
Консервация клеток: клетки заморожены на 8, 16 30 пассажах. Общее количество ампул: 15 по 5-10 клеток в ампуле.
Криозащитная среда: ростовая среда с 50% эмбриональной коровьей сыворотки и 10% глицерина. Выживаемост при размораживании 65-68%.
Сведения о контаминации клеток штамма.
Бактерии, грибы, дрожжи, микоплаз мы не обнаружены. Обнаружены С-час- тицы. .
Физиолого-биохимическая характеристика.
Клетки растут при +36,5-37 с и оптимуме рН от 6,0 до 7,1. При куль- тивировании 1шетки штамма секретирую в культуральную среду Ig норки.
Образцы культуральной ж1-щкости штамма Д-34-А4 исследуют иммунофер- ментным методом на нитроцеллюлозе. В качестве индикатора используют диаминобензидин. Каждьй иммунофер- ментный анализ сопровождают калибровкой норочьего Ig и контролем - калибровкой мышиного Ig. Уровень про дукиди Ig норки соответствует 1000- 500 нг/мл.
При хранении при +4 С в течение 8 сут содержание Ig норки в образцах культуральной среды остается стабильным (не снижается) .
Пример 2. Штамм 4-34-А4 представляет собой соматический межвидовой гибрид клеток реципиентов и клеток-доноров,
В качестве клеток-реципиентов используют двухсуточную культуру клеток миеломы мьшп NSO в количестве 10. В качестве клеток-доноров используют спленоциты норки, предварительно иммунизированной суммарным Ig норки. В гибридизацию брали В-лимфоциты (10 ) селезенки норки н третий день после последней инъекции антигена (Ig норки).
Культуру клеток мышиной, миеломы NSO, используемую для гибридизации, дефицитных по гипоксантингуа1шн-фос- форибозилтрансферазе (ГГФРТ), культивируют на среде ДМЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, глютамина, В-азагуанина и анти- йютиков.
Гибридизацию В-лимфоцитов норки и клеток миеломы мыши NSO при соотношении 10:1 соответственно проводят в стандартной среде ДЕМЕ без сыворотки, с добавлением полиэтиленгликоля (М.в. 1500). После обработки в течение 3 мин полиэтиленгликолем клетки осаждают центрифугированием при 800 об/мин и суспендируют в среде ДЕМЕ с добавлением 15% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2 ьМ глютамина, 19 i пирувате натрия, 4-10 аминоптерина, 10 гипок- сантина, 16-10 М тимидина и анти- Й1ОТИКОВ. Суспензию (10 клеток в мл среды) разливают по О,1 мл в 96- луночные пластиковые плато и культивируют при +37 С в атмосфере 6%-ного
0
5
0
5
0
5
0
СО. Первую смену среды производят через 5 дней после гибридизации, в дальнейшем - 2 раза в неделю. Через две недели гибридные клетки переводят на среду аминоптерина, а в последующем (еще через неделю) на среду и без гипоксантина и тимидина.
Панели с гибридными клетками регулярно микроскопируют, Культуральную жидкость из тех лунок панели, в которых площади pacTymjix колоний гибридных клеток составляют около 1/3 и более от всей площади лунки, исследуют иммуноферментным методом по схеме сэндвич на синтез Ig корки. Отбирают колонии с большим уровнем синтеза норки.
При постоянном контроле уровня и специфичности синтеза норки проводят клонирование методом лимитирующих разведений. Первое клонирование проводят из расчета. 50 клеток на лунку, второе - 10 клеток на лунку, третье - 0,5 клеток на лунку. При клонировании используют слой клёток-кормилок на спленоцитов мышей линии BALBc nu/nu. Отобранные после третьего клонирования клоны гибридом также исследуют на продукцию Ig норки. При культивировании клонов in vitro их периодически, под контролем синтеза реклонируют методом лимитирующих разведений.
По данным о количестве продуцируемого норки, его стабильности, по культуральной характеристике отбирают клон. Клетки клона характеризовались хорошими ростовыми качествами. Клетки клона синтезировали Ig норки в ко 15217
личестве 1500-2000 нг/мп культураль- ной среды.
Клетки клона размножают и при дальнейших пассажах получают штамм 4.-34- А4. Его характеристика приведена в табл. 1 и 2.
Результаты исследований образцов культуральной среды клеток штамма А-34-А4 на разных пассажах приведены
в табл. 1.
Та блица I
5
10
72
Продолжение табл. 2
10
Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к получению клеток-продуцентов различных белков. Целью изобретения является получение штамма межвидовых гибридом мышь-норка, обладающего более высокой продукцией и синтезирующего более стабильный при хранении JGG норки. Методом соматической гибридизации клеток мышиной миеломы N50 со спленоцитами норки, иммунизированной суммарным иммуноглобулином норки, получены соответствующие гибридомы. Методом клонирования получена стабильная культура гибридных клеток мышь-норка, синтезирующая иммуноглобулин класса JGG в количестве 500-1500 нг/мл. Указанная культура лепонирована в коллекции Института цитологии, где ей присвоен номер ВСКК (п) N231Д. 2 табл.
Исследуют стабильность продуцируемого клетками штамма Ig норки при хранении в холодильнике (4 С).
Результаты представлены в табл.2...
Таблица 2
Количество Ig норки в образцах культуральной среды при хранении
ЮОО 1000 1000 1000 800 800 800 800 500 500 500 500
5
0
5
0
5
0
5
Из данных табл.2 видно, что Ig, продуцируемьй в культуральную среду клетками штамма 4-34-А4 при хранении, оставался стабильным в течение срока наблюдения - 8 дней. В образцах культуральной среды штамма-прототипа Ig через 3 сут хранения, как правило, не обнаруживается.
По сравнению с известным (прото- типным) штаммом гибридных клеток 84-Д2, синтезируюзим Ig норки в количестве 50-100 нг/мл, предлагаемый штамм гибридом 4-34-А4 синтезирует Ig норки в 10 раз больше (500- 1000 мг/мл) (табл.1). Ig норки, синтезируемый клетками штамма 84-Д2 при хранении в холодильнике (+4°С) через 2-3 сут не обнаруживается в образцах культуральной среды.
Уровень Ig в образцах культуральной среды клеток штамма 4-34-А4 при хранении в тех же условиях в течение 8 дней не снижается, т.е. наблюдается большая стабильность продукта (табл.2).
Полученный положительный эффект изобретения достигается за счет свойств сконструированной гибридной клетки.
Формула изобретения
Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus miisculus Mus- tela vison ВСКК(П) № 231 Д,продуцент моноклональных иммуноглобулинов класса IgG норки.
| Галахарь Н.Л | |||
| и др | |||
| Особенности получения межвидовых гибридом мьшь- норка - Материалы Всесоюзной конференции по генетике соматических- клеток в культуре | |||
| Пневматический водоподъемный аппарат-двигатель | 1917 |
|
SU1986A1 |
