Штамм культивируемых межвидовых гибридных клеток мыши MUS мUSсULUS L. и норки МUSтеLа VISoN - продуцент легких цепей моноклонального иммуноглобулина норки Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано для получения моноклональных L-цепей иммуноглобулина американской норки.

1 Цель изобретения - получение штамма культивируемых межвидовых гибридных клеток мышь х норка, продуцирующих моноклональные L-цепи Ig норки.

Штамм НИ-7, ВСКК(П) № 230 Д получают следующим образом.

Клетки мышиной миеломы NSO гибри- , дизуют с иммунными В-лимфоцитами американской норки (Mustela vison).

Для слияния используют двухсуточную культуру клеток NSO и В-лимфоциты норки на третий день после антигенного стимулирования.

Клетки NSO культивируют на среде ДНЕМ или RPMI-1640 с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и 8-азогуанином.

Слияние (гибридизацию) с В-лимфоцитами норки проводят в стандартной среде без сыворотки, с добавлением полиэтиленгликоля (М.В. 1500) при соотношении клеток 1:10 соответственно.

о

Јь

00 00 СЛ

После обработки в течение 3 мин полиэтиленгликолем клетки осаждают центрифугированием при 800 об/мин и суспендируют в среде RPMI-1640 с добавлением 15% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 4 Ю аминоптерина, Ю гипоксанти- на, тимидина и антибиотиков (НАТ-среда). Суспензию клеток (10 кл/мп) разливают по 0,1 мл в лунки 96-луночньк пластиковых планшетов и культивируют при +37°С в атмосфере 6% С02. Первую смену среды производят через 5 сут после гибридизации, в дальнейшем - через 2-3 дня. Через 2 недели после гибридизации НАТ-среду заменяют на НТ-среду (среду без аминоптерина), а еще через

неделю на обычную ростовую среду (без гипоксантина и тимидина).

Рост гибридных клеток контролируют при микроскопировании панелей. Из лунок, в которых площадь растущих колоний гибридных клеток достигает 1/3 и более площади лунки, исследуют культуральную среду на присут ствие Ig норки или его цепей. Детекцию Ig норки и его цепей проводят при помощи иммуноферментного анализа с использованием антисывороток к Ig норки, его легким и тяжелым цепям. В качестве субстрата использован диаминобензидин. Каждый иммунофер- ментньй анализ (EDSA) сопровождается калибровкой Ig норки и контролем- калибровкой мышиного Ig и интактной культуральной среды. При первичном отборе выбирали колонии с более высокой продукцией L-цепей Ig.

При постоянном контроле уровня и специфичности синтеза L-цепей норки проводили клонирование методом лимитирующих разведений, отобранных первичных гибридом. При клонировании использовали слой клеток-кормилок (фидер) из спленоцитов мышей линии BALB/c пи/пи.

Процент позитивных клонов при 5- и 6-м клонировании достигает 89-90. Из них отбирают наиболее активный продуцент L-цепей Ig норки и обозначают как штамм НМ-7.

Штамм обладает следующими признаками.

Морфология клеточной культуры.

Культура представляет собой округлые, слабо прикрепляющиеся к субстра0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ту клетки. Ядра занимают большую часть клетки. Цитоплазма в виде тонкого ободка.

Кариология штамма. Модальный класс хромосом 94-101. Хромосомы представлены в основном телоцентрическими, но 5 пар - субметацентрическими (но- рочьими).

Культуральные свойства.

Клетки штамма пересевают на среде RPMI-1640 с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ пирувата, 2 мМ глютамина и антибиотиками в стандартных дозировках при 36,8-37°С.

Характер роста клеток: стационарная суспензия. Частота пересевов: через 3-4 сут. Посевная доза клеток 1 -10 -10 кл/мп. Кратность рассева: 1:2, 1:3.

Консервация клеток: клетки заморожены в жидком азоте на 25,30 пассажах по 13 ампул каждого пассажа и 5-10 клеток в ампуле.

Криозащитная среда: ростовая среда с 50% сыворотки крупного рогатого скота и 10% глицерина. Выживаемость клеток при замораживании 50-70%.

Сведения о контаминации клеток штамма.

Бактерии, грибы, дрожжи, микоплаз- мы не обнаружены.

Физиолого-биохимическая характеристика .

Клетки растут при 36,8-37°С и оптимуме рН от 6,0 до . При культивировании клетки штамма секретируют в культуральную среду легкие (L) цепи Ig норки, что установлено с помощью иммуноферментного анализа на нитроцеллюлозе с антисыворотками к IgG. норки, к легким и тяжелым - цепям Ig норки.

Уровень продукции L-цепей Ig норки соответствует 3000-4000 нг/мл (или 3-4 мкг). При хранении в течение не менее 14 дней при 4°С количество L-цепей Ig в культуральной жидкости не снижается.

Использование штамма иллюстрирует ся на примере наработки моноклональ- ных L-цепей в течение 40 пассажей без реклонирования гибридомы с изучением уровня продукции L-цепей и сохранности их при хранении при 4 С.

Результаты опытов показывают, что уровень продукции L-цепей в течение 40 пассажей остается стабильным и составляет 3-4 мкг/мл.

516Д18856

Формула изобретенияи норки Mustela vison ВСКК(П) № 230Д

Штамм культивируемых межвидовыхпродуцент легких цепей моноклональгибридньк клеток мыши Mus musculus L. ного иммуноглобулина норки.

Изобретение относится к гибри- домной технологии и может быть использовано для получения моноклональных L-цепей иммуноглобулина американской норки. Цель изобретения - получение штамма культивируемых межвидовых гибридных клеток мышь х норка, продуцирующих моноклональные L-цепи Ig норки. Штамм получают гибридизацией клеток мышиной миеломы NSO с лимфоцитами норки. Ытамм культивируют в среде RPMI-1640 с 10% сыворотки эмбриона коровы со стандартными добавками. Клетки пересевают через 3-4 дня с начальной концентрацией 6-105 - 106/мл. Клетки штамма продуцируют стабильно в течение 40 пассажей 3-4 мкг/мл L-цепей. При хранении культуральной среды при 4°С содержание L-цепей не снижается. L-цепи идентифицируют с помощью специфических антисывороток иммуноферментным методом. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) Р 230D. ел