Способ стерилизации ферментных препаратов, используемых для получения протопластов Советский патент 1991 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в области культуры тканей и клеток генетики и селекции для получения качественных протопластов растений

В биотехнологии для получения качественных протопластов растений большое значение имеет сохранение высокой стерильности и активности ферментны препаратов, растворяющих клеточные оболочки растений Основное требование, предъявляемое к стерильности, состоит в том, чтобы все выделенные протопласты, культивируемые на искусственной питательной среде, были не заражены инфекционной микрофлорой и имели шаровидную форму с равномерным распределением хлоропл стов

Цель изобретения - ускорение стерилизации при снижении трудоемкости.

Способ состоит в том что при стерилизации ферментных препаратов на них воз60 л

действуют ионизирующим излучением Со в дозах от 1,0 до 2,0 м Р при мощности 12,0-18,0 Р/с

В данном диапазоне мощности гамма- облучения при заданной экспозиционной С/1 дозе облучения эффект в пределах погреш- Г ности измерения не меняется

Способ осуществляется следующим об- Ј разом

По 1 г сухого фермента, например Pectinase помещают в пенициллиновые пузырьки и облучают ионизирующим излу- чением Со на установке РХМ у 20 в дозах ч| 1,9 2 0 мР при мощности 12 0-18,0 Р/мин. СА) После облучения фермент из пенициллине- (J вы/ пузырьков растворяют в 0 5 М растворе sQ сахарозы которую также предварительно fv стерилизуют автоклаеированием при 1,0 атм в течение 20-25 мин Для гидролизации клеточных оболочек в суспензию растительных клеток наливают стерильный ферментный раствор и инкубируют в термостате при 26- 28° С 6 - 16 ч. Осаждение протопластов осуществляют с помощью центрифуги

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1, Изучают влияние облучения Со в дозах 0,25 Р, 0 50 Р, 1.0 Р: 2,0 и

3,0 мР при мощности 18,0 Р/с на степень стерилизации ферментного препарата Pectlnase, взятого в 1%-ной концентрации, и влияние стирилизации этого фермента на качественный и количественный выход изолированных протопластов из клеток каллусной ткани земляники сорта Рубиновый кулон.

Опыт ставят в трехкратной повторно- сти.

Ферментные растворы, облученные указанными дозами, предварительно ставили в термостат на 5-6 сут при 28° С для выявления степени стерильности. В качестве контроля служил ферментный препарат Pectlnase, растворенный в 0,5 М растворе сахарозы, стерилизацию которого проводили фильтрованием через мембранные фильтры - Mllllpore.

Действие ионизирующего излучения на стерилизацию ферментного препарата (мощность дозы 12,0-18,0 Р/с) приведено в табл.1.

Как показывают исследования, доза облучения ферментного препарата 0,25 и 0,50 мР не приводит к желаемому результату, так как раствор на 5-6-й день покрывается плесенью. Ферментные растворы, облученные дозами 1,0; 2,0 Р и 3,0 мР, являются стерильными и их используют в дальнейших исследованиях по выделению изолированных протопластов земляники.

Наиболее оптимальной дозой облучения, которая лучше всего стерилизует ферментный препарат и сохраняет его активность, является доза 1,0 мР (см. табл. 1).

Плотность жизнеспособных протопластов, выделенных при использовании ферментного раствора, облученного дозой 1,0 мР, составляет 1,5 106 п/мл.

Ферментные растворы, полученные от облучения фермента дозой 2,0 мР, приводят к снижению числа жизнеспособных протопластов и гибели значительной части протоп- ластов, выделенных из клеток каллусной и листовой ткани земляники.

Ферментные растворы, полученные от облучения фермента дозой 3,0 мР, полностью теряют свою активность и не пригодны для растворения клеточных оболочек.

Пример 2. Осуществляют аналогично примеру 1, только действие простерилизо- ванных ферментных препаратов исследуют на тканях сливы. Результаты представлены в табл. 1.

Примеры 3-5. Аналогично примерам 1-2 исследуют действие препаратов на получение протопластов из тканей других плодовых культур. Результаты представлены в табл. 2.

Предлагаемый способ стерилизации фьрментных препаратов позволяет не применять импортные мембранные фильтры для получения растительных протопластов, что сущетвенно ускоряет рабочий процесс и сокращает затраты труда и денежных средств.

Формула изобретения Способ стерилизации ферментных препаратов, используемых для получения протопластов, включающий воздействие на них фактором, обеспечивающим высокий уровень стерильности при сохранении их ак- тивности, отличающийся тем, что, с целью ускорения стерилизации при снижении трудоемкости, на ферментные препараты воздействуют ионизирующим излучением Со в дозе 1,0-2,0 мР при времени инкуба- ции 16 ч.

Действие ионизирующего излучения на стерилизацию

ферментного препарата Мощность дозы 12,0 р/ик - 18,0 р/сек

Таблица t

Изобретение относится к биотехнологии и касается стерилизации ферментных препаратов, используемых для получения растительных протопластов. Целью изобретения является ускорение стерилизации при снижении трудоемкости. Способ состоит в том, что ферментные препараты стерилизуют ионизирующим излучением ⁶°Со в дозе 1,0 - 2,0 мР. 2 табл.

каллусной ткани ки Рубиновый кулон

листовой ткани слиа Ренклод колхозный

Контроль Millipore

0,25

0,5

1,0

2,0

3,0

Контроль Millipore

0,25

0,5

1,0

2,0

3,0

Примечание Фермент - Pectinase, 1%-ный раствор; осмотический стабилизатор - сахароза, 5,0 М; время инку- ,бации 16 ч.

ЦеллоВиа- Сахароза 16 за, 1,OZ 5,0 М

Cellule- Сахароза 16 ва, 1,ОХ 5,0 И

ектофое- Д-Маннит 16 тидин, 0,4 М 2,02

1,2-10

Нестерильный Нестерильный 1,5-Ю6

О,МО гальны 0,1 -10

Летальный исход

Нестерильный Нестерильный

О, МО-5

О,2-Ю5 Летальный исход

Таблиц

Нестерильный

4,040 6,0-10 Летальный исход

Нестерильный и..,.

Нестерильный

3,4-10 2,4-10 Летальный исход