Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к мембраносвязанной форме Н-антигена человека Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

(21)4452142/30-13

(22)29.06.88

(46) 23.03.90. Бгсл. П

(71)Всесоюзный гематологический научный центр

(72)Ё.И.Дерюгина, Н.И.Дризе, Л.Н.Леменева, Е.Ю.Садовникова, Г.А.Удалов, И.Л.Чертков, М.И.Лапен- ков и А.Е.Носырев

(53)578.085.23(088.8)

(56)Наставление по применению гете- роиммунной анти-Н козьей сыворотки диагностической жидкой для судебно- медицинских целей. МЗ СССР. Утв. 20.06.74.

Патент ГДР № 241852, кл. А 61 К 39/395, С 12 N 5/02, 1987.

(54)ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS. MUSCULUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬ- НЫХ АНТИТЕЛ К МЕМБРАНОСВЯЗАННОЙ ФОРМЕ Н-АНТИГЕНА ЧЕЛОВЕКА

(57)Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus - продуцента высокоактивных и высокоспецифичных моноклональных антител (МОНАТ) для выявления мембраносвязанной формы Н- антигена человека. Штамм получают слиянием мышиной миеломы P3-X63-Ag8653 с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. Депонирован под номером ВСКК(П) fr 253D. Клетки культивируют в среде RPMI 1640 с 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Частота пассирования 2-3 сут: кратность рассева 1:3-1:4. Стабильная продукция МОНАТ наблюдается в течение 2 пассажей на мышах, титр антител в асцитной жидкости в реакции агглютинации в солевой среде с эритроцитами фенотипа 0 составляет 1:256-1:512 тыс., в культурапьной 1:256-1:512. МОНАТ относятся к классу 1 gM, они специфичны для Н-антигена в эритроцитах человека. МОНАТ могут быть использованы в диагностических целях. 2 табл.

Сл СП

1

со оо

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS - продуцента высокоактивных и высокоспецифичных моноклональных антител (МонАТ) для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека. Штамм получают слиянием мышиной миеломы Рз-Х63-Ад8653 с клетками селезенки мышей линии BALB/C, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. Депонирован под номером ВСКК(П) N 253Д. Клетки культивируют в среде PPMJ 1640 с 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Частота пассивирования 2-3 сут

кратность рассева 1:3-1:4. Стабильная продукция МонАТ наблюдается в течение 2 пассажей на мышах, титр антител в асцитной жидкости в реакции агглютинации в солевой среде с эритроцитами фенотипа 0 составляет 1:256-1:512 тыс., в культуральной 1:256-1:512. МонАТ относятся к классу 1дМ, они специфичны для Н-антигена в эритроцитах человека. МонАТ могут быть использованы в диагностических целях. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животного Mus. musculus - продуцента высокоактивных и высокоспецифичных моноклональных антител

(МОНАТ) для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека.

Штамм перевиваемых гибридных клеток мыши Mus. musculus H-86/50 получают р результате слияния мышиной миеломы P3-X63-Ag8.653 с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. При слиянии используют

полиэтиленгликоль мол.мае. 3000, соотношение миеломных клеток и сплено- цитов было 1:3 при общем количестве спленоцитов и клеток миеломы 450-10 и 160-106 соответственно. Селекцию неслившихся миеломных клеток проводят в среде, содержащей аминоптерин (НАТ-среда).

Штамм получен в результате 3-крат- ного клонирования методом лимитирующих разведений при 100% антителооб- разующих клеток в двух последних клонированиях.

Штамм Н-86/50 хранится в коллек- ции перепиваемых клеточных линий позвоночных под номером ВСКК(П) Nn 253D и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Культу- ра состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату клеток с обычной для гибридных антителообразующих клеток морфологией.

Кариологические признаки. Карио- тип соответствует Mus. musculus.Модельное число хромосом 93 с интервало варьирования 87-94. С помощью С окрашивания выявляются большой и малый метацентрики и один большой акроцен- трик.

Культуральные признаки. Среда для культивирования RPMI 1640 или ДМЕМ с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 1% цирувата натрия, 2% HEPES-буфера, 5-10 52-мер каптоэтанола, антибиотики. Характер роста - стационарная суспензия. Метод снятия - резиновым полисменом. Частота пассирования 2-3 сут. Крат- ность рассева 1:3-1:4.

При введении мышам BALB/c предварительно обработанным пристанем (2-5)-10 клеток асцит образуется через 9-14 сут. Стабильная продукция антител наблюдается в течение 2 пассажей на мышах, титр антител в ас- цитной жидкости в реакции агглютинации в солевой среде с эритроцитами Фенотипа 0 составляет 1:256-1:512 ты в культуральной 1:256-1:512.

Характеристика МОНАТ. МОНАТ продуцируемые штаммом Н-86/50, выявляют Н-антиген, связанный с мембраной эритроцитов в реакциях агглютинации на плоскости и солевой среде и реакции абсорбции-элюции с образцами, содержащими эритроциты с Н-антигеном.

МОНАТ Н-86/50 принадлежат к классу 1 gM.

Консервация клеток. Криозащитная среда: 50% среды, 40% сыворотки, 10% ДМСО.

Режим замораживания. Клетки в кри защитной среде помещают на сутки при -70 С, после чего переносят в жидкий азот. Выживаемость клеток при рамораживании составляет 70-85% от жизнеспособных клеток до замораживания.

Сведения о контаминации линии. Батерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружены. Вирусы не тестированы

Пример. Активность МОНАТ Н-86/50 в серологических реакциях.

Образцы индуцированной клетками штамма асцитнои и кондиционированной культуральной жидкостей исследовали по известным в серологии методам.

Титр и авидность антител определяли в реакции агглютинации на плоскости или в солевой среде (титр) в 96-ячеечных микроплатах. Под титром антител в реакции на плоскости или солевой среде подразумевали такое последнее их разведение, при котором крупные агглютинаты на плоскости начинали образовываться не позднее 30 с, а в ячейке наблюдали агрегаты эритроцитов. Под авидностью антител подразумевали сродство изучаемых антител к стандартным эритроцитам человека, оцениваемое в реакции агглютинации на плоскости с эритроцитами фенотипа 0 по времени появления первых агглютинатов (первый параметр времени наступления четкой реакции аггпютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютнна- тов (третий параметр).

Титр и авидность анти-Н антител в реакции агглютинации на плоскости приведены в табл. 1, а титр в реакци агглютинации в солевой среде - в табл. 2-.

Результаты, приведенные в табл.1 и 2, показывают, что МОНАТ Н-86/50 как в культуральной жидкости, так и в реагенте, приготовленном путем разведения асцитнои жидкости в 100 раз 0,3 М раствором хлористого натрия по отношению к эритроцитам фенотипа 0, обладают гораздо более высокими титрами и авидностью по сравнению с гетероиммунными козьими анти-Н антисыворотками.

1:2

7-13-19

1:100 1:32 1-2-3

1:8 4-7-10

Таблица2

Гетероиммун- ная сыворотка201:2-1:3108 1:2-1:4 79 1:4-1:8

П-86/50 ас- цитная жид- кость, разведение I:100 1 2

1:256

I:128-1:256

С помощью моноклонального анти-Н реагента, полученного на основе антител, секретируемых гибридомой Н-86/50, можно надежно выявлять Н- антиген на эритроцитах и, таким образом, устанавливать присутствие кро- ви в объектах, подлежащих судебно- медицинской экспертизе.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus ВСКК(П) № 253D, используемый для получения монокпональных антител к мембраносвя- занной форме Н-антигена человека.