Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к мембраносвязанной и растворимой формам Н антигена человека Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

1

(21)4452025/30-13

(22)29.06.88

(46) 23.03.90. Бюл. № 11

(71)Всесоюзный гематологический научный центр

(72)Е.И.Дерюгина, Н.И.Дризе, Л.Н.Леменева, Е.Ю.Садовникова, Г.А.Удалов, И.Л.Чертков, М.И.Лапенков и А.Е.Носырев

(53)578.085.23(088.8)

(56)Наставление по применению гете- ролммунной анти-Н козьей сыворотки диагностической жидкости для судебно-медицинских целей. МЗ СССР. Утв. 20.06.74.

Патент ГДР № 241852, кл. А 61 К 39/395, С 12 N 5/02, 1987.

(54)ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS. MUSCULUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬ- НЫХ АНТИТЕЛ К МЕМБРАНОСВЯЗАННОЙ И РАСТВОРИМОЙ ФОРМАМ Н-АНТИГЕНА ЧЕЛОВЕКА

(57)Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной и растворимой сЬорм Н-антигена человеИзобретение относится к биотех - нологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной и растворимой форм Н-антигена человека.

Целью изобретения является получение нового штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. mus- culus, используемого для получения моноклональных антител (МОНАТ), при-1

ка. Целью изобретения является получение нового штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. mus- culus, используемого для получения моноклональных антител (МОНАТ), пригодных для выявления мембраносвязанной и растворимой форм Н-антигена человека в реакции ингибирования агглютинации. Штамм получен в результате слияния мышиной миеломы РЗ-Х63- Ag8.653 с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) Nc 254D. Клетки культивируют в среде RPMI 1640 с 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Частота пассивирования 2-3 сут, кратность рассева 1:3- 1:4. Стабильная продукция МОНАТ в асцитной жидкости - 1:256-10 -1:512 10 , в культуральной 1:256-1:512. МОНАТ относятся к классу 1 §М, они специфичны для Н-антигена на мембранах эритроцитов и в слюне лиц-выделителей групповых веществ. МОНАТ могут быть использованы в диагностических целях. 2 табл.

(Л

ел ел

j

со J

годных для выявления мембраносвязанной и растворимой форм Н-антигена человека в реакции ингибирования агглютинации.

Штамм перевиваемых гибридных клеток мыши Mus. musculus Н-86/44 получен в результате слияния мышиной миеломы P3-X63-Ag8.653 с клетками селе- ,зенки мышей линии BALB/c, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. При слиянии использовали полиэтиленгликоль мол.мае. 3000, соотношение мисломных клеток и сплено- цитов было 1:3 при общем количестве спленоцитов и клеток миеломы 450 «10 и 160-10 соответственно. Селекцию неслившихся клеток проводили в среде, содержащей аминоптерин (НАТ- среда).

Штамм получен в результате 4-кратного клонирования методом лимитирующего разведения при 98-100% антитело- продупирующих клонов во всех клонированиях.

Штамм Н-86/44 хранится в коллекции перевиваемых клеточных линий позвоночных по К ВСКК(П) 254D и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Культура состоит из слабо прикрепленных к субстрату клеток с обычной для гибридных антителопродуцирующих клеток морфологией.

Кариологические признаки. Карио- тип соответствует Mus, musculus. Модальное число хромосом 78 с интервалом варьирования 74-80. С помощью С- окрашиаания выявляются две большие метацентрические хромосомы.

Культуральные признаки. Среда для культивирования RPMI 1640 или ДМЕМ с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 1% пирувата натрия, 1-2% HEPES-буфера, 5 2-меркаптоэтанола, антибиотики. Характер роста - стационарная суспензия. Метод снятия - резиновым полисменом. Частота пассирования 2-3 су Кратность рассева 1:3-1:4.

При введении мышам BALB/c предварительно обработанных пристанем 2-5 х МО клеток асцит образуется через 20 сут. Стабильная продукция антител наблюдается в течение 2 пассажей на мышах, титр антител в асцитной жидкоти составляет 1:256-1:512 тыс., в культуральной 1:256-1:512.

Характеристика моноклональных антител МОНАХ, продуцируемые штаммом Н-86/44, выявляют Н-антиген на мембранах эритроцитов и в слюне лиц- выделителей групповых веществ (1 gM)

Консервация клеток. Криозащитная среда: 50% среды, 40% сыворотки, 10% диметилсульфоксида.

Режим замораживания. Клетки в криозащитной среде помещают на сутки при -70 С, после чего переносят в

5

0

5

0

5

0

жидкий азот. Выживаемость клеток при размораживании СОСТ.ШЛЯРТ 70-85% от жизнеспособных клеток до замораживания .

Сведения о контаминации линии. Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружены. Вирусы не тестированы.

Пример. Активность МОИAT 11-86/44 в серологических реакциях.

Образцы индуцированной клетками штамма культуральной и асцитной жидкости исследовали по известным методам.

Результаты исследования активности (титра и авидности) МОНАТ Н-86/44 в реакциях прямой агглютинации эритроцитов.

Титр и авидность антител определяют в реакции агглютинации на плоскости и в солевой среде в 96-луночных микроплатах. Под титром антител в реакции на плоскости подразумевают такое их последнее разведение, при котором агглютинаты начинали образовываться не позднее 30 с, а в реакции агглютинации в солевой среде - такое последнее разведение, при котором в ячейке наблюдали агрегаты эритроцитов. Под авидностью антител подразуевают сродство изучаемых антител к стандартным эритроцитам человека, оцениваемое в реакции агглютинации на плоскости по времени появления первых агглютинатов (первый параметр), времени наступления четкой реакции агглютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютинатов (третий параметр).

Таблица 1

0

5

Гетероиммун- ная анти-Н антисыворотка, с.20 МОНАТ Н-86/ /44 культу- ральная жидкость

МОНАТ Н-86/ /44 асцитная жидкость

1:2 7-13-18

3-8-11

1:100 1:64 0-1-2

20

108

79

1:2-1:3 1:2-1:4 1:4-1:8

5517376

Результаты, приведенные в табл.1 и 2, показывают, что МОНАТ Н-86/44 как в культурапьной жидкости, так и в реагенте, приготовленном путем разведения асцитной жидкости в 100 раз 0,3 М раствором хлористого натрия, по отношению к эритроцитам фенотипа О обладают гораздо более высокими Ю титрами и пучшей авидностью по сравнению с гетероиммунными козьими - анти-Н сыворотками.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной и растворимой форм Н-антигена человека. Целью изобретения является получение нового штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS, используемого для получения моноклональных антител (монАТ), пригодных для выявления мембраносвязанной и растворимой форм Н антигена человека в реакции ингибирования агглютинации. Штамм получен в результате слияния мышиной миеломы РЗ-Х63-Ад8. 653 с клетками селезенки мышей линии BALB/C,иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 254Д. Клетки культивируют в среде RPMI 1640 с 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Частота пассивирования 2-3 сут, кратность рассева 1:3-1:4. Стабильная продукция монАТ в асцитной жидкости - 1:256.10³-1:512.10³, в культуральной - 1:256-1:512. МонАТ относятся к классу 1дМ, они специфичны для Н-антигена на мембранах эритроцитов и в слюне лиц-выделителей групповых веществ. МонАТ могут быть использованы в диагностических целях.

1-256-1:512 1: 128

1:2048 1:256

Фор. мула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus ВСКК(П) fr 254D, используемый для получения моноклональных антител к мембраносвя- занной и растворимой формам Н-антиге- на человека.