Способ определения биологической активности химических соединений Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 G01N24/00 

, . Г

Изобретение относится к физикд химическим методам выявления потенг циальной биологической активности : химических соединений как структу1Эюмодифицирующих факторов в отношений биологических мембран и может быть использовано при поиске практически ценных биологически активных препаратов, например пестицидов.

Известен способ определения биологической активности химических соединений, в котором в качестве тестобъекта используют либо подопытных животных, либо ткани их различных органов. Измельченные ткани гомог-енйзируют, подвергают воздействию испытуемого химического соединения,

В гомогенатах и субклеточных фракциях определяют свободную и общую активность гликозида. Общую актив ность ферментов исследуют после полного разрушения субклеточных структ/р путем добавления в инкубационную среду тритона Х-100.

По изменению уровней активности этих ферментов определяют биологическую активность испытуемых соединений Г1 .

Однако известный способ предусматривает использов.ать в качестве тестобъекта либо ткани различных орг.анов подопь1тн6го животного, либо организм в целом, что затрудняет однозначную интерпретацию механизма действия исfOпытуемых соединений. Способ дает возможность судить только о функциональных изменениях лизосомальных ферментов и не дает никакой информации о структурной модификас и мембран

5 при воздействии химических соединений.

Кроме того, известный способ трудоемок и предусматривает проведение эксперимента, по крайней мере, в течение суток.

Целью изобретения является ускорение способа, повышение его чувствительности и информативности. Поставленная цель достигается те что согласно способу в качестве тес объекта используют плазматические мембраны эритроцитов животных орган мов, после воздействия на химическими соединениями в него вво дят спиновой зонд в концентрации 0,1-0,5 мМ, добавляют аскорбат натрия в концентрации 10-25 мМ, затем измеряют скорость аскорбат-индуциро ванного восстановления зонда, по из менению которой судят о биологическ активности химических соединений. Скорость восстановления зондов обусловлена скоростью проникновения аскорбат-аниона во внутримембранное пространство, а последняя, в свою очередь, существенным образом зависит от структурного состояния мембраны, которое может изменяться при обработке мембраны биологически активными препаратами. Измеряй, таким образом, скорость восстановления зондов, локализованных в обработанной химическими соединениями мембра не, аскорбатом натрия и сравнивая е с таковой при отсутствии химических соединений (контроль) определяют биологическую активность испытываемых веществ как структуро-модифицирующих факторов в отношении биомемб раи. На чертеже представлены кинематические кривые восстановления зонда. При м е р. Плазматические мембраны эритроцитов, так называемые тени эритроцитов, получают из све жей бычьей крови. Для этого эритроциты отделяют от плазмы центрифугированием в течение 20 мин при lOOOg затем трижды промывают раствором 0,9 -ного хлорида натрия, центрифугируя в течение 15 мин при lOOOg. Далее проводят гемолиз в растворе трис-НС1 (5 мМ, рН 7,8), содержащем 2 мМ ЭДТА, 1 мМ сульфата магния. Смесь центрифугируют 15 мин при 15000g. Супернатант удаляют. Подобную операцию повторяют 3 f раза. Отношение объема эритроцитов к объему гомолизата поддерживают 1:10. Затем ионную силу буфера понижают в 2 раза(триС-НС1 - 2,5 мМ, рН 7,8, 2мМ ЭДТА, 1 мМ сульфата магния) и гемолизат вновь центрифугируют при 15000g в течение 15 мин. Супернатант удаляют (операцию повторяют 2 раза). Последнюю стадию теней от гемоглобина прово-. дят в растворе трис-НС1 (1 мМ, рН 7,8) при ZOOOOg в течение 15 мин (2 раза). Полученную суспензию концентрируют путем центрифугирования при lOOOOOg в течение 30 мин, предварительно суспендируя ее в растворе трис-НС (50 мМ, рН 7,8). Все операции по получению теней осуществляют при - 6°С. ЭПР-измерения проводят на радиоспектрометре РЭ-1306 при 18-20. К 100 мкл полученной суспензии мембран (концентрация белка по Лоури составJrtяeт 12,5 мг/мл) добавляют спиртовый раствор ДДТ так, чтобы концентрация ДДТ в среде измерения составляла 0,5 мМ. Смесь инкубируют 60 мин при комнатной температуре, затфм добавляют спиртовый раствор зонда (2,2, t, -тетраметил-9- гексил-1,2,3 , -тетрагидро-5,6-бензо- -карболин-3-оксил), причем конечная концентрация зонда равна .2,5 х Iff М, а этанола - не более по объему. Смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре, после чего добавляют раствор аскорбата натрия в буфере трис- . -НС1 50 мМ, рН 7,8. Суспензию тщательно перемешивают и через 5 10 мин регистрируют 2 спектра ЭПР с интервалом 3 мин. Определяют соотношение центральных компонент спектров. Оно составляет 0,89. По номограмме (чертеж) , находят, что значение ,017 МИН . Контроль. К 100 мкл полученной суспензии теней (концентрация белка по Яоури составляет 12,5 кг/мл) добавляют спиртоаый раствор зонда (2,2,4,|-тетраметил-9-гексил-1,2,3,Л -тeтpaгидpo-5 6-бeнзo-f-кapбoлин-3-оксил) так, чтобы конечная концентрация этанола в среде измерения не превышала 41 по объему, а зонда составляла 2,5 х . Суспензию инкубируют 30 мин при комнатной температуре . Затем к полученной смеси добавляют раствор аскорбата натрия в буфере трис-ЯС1 (50 мМ, рН ), начальная концентрация которого составляет 17,5 мМ. Смесь тщательно перемешивают и через 5-10 мин регистрируют 2 спектра ЭПР с интервалом 3 мин. Определяют соотношение интенсивностей центральных компонент спектров ЭПР. Оно составляет 0,81. По номограмме (чертеж) определяют kg для этой реакции (,030 мин ) k, по уравнению рассчитыЗная k Сдо 0,58 мМ. вают г - с So-ТП о концентрация испытуемого np где с парата;константа скорости реакции при отсутствии химического соединения;: константа скорости реакции в присутствии химичес кого соединения; концентрация химического соединения, вызывающая уменьшение k/k на 50. В качестве параметров, характеризующих скорость реакции, могут быть выбраны начальная скорость восстановления радикальных центров (определяется как тангенс угла наклона касательной к кинетической кривой восстановления зонда в начальный . момент времени), время полувосстановления радикалов и константа скорости реакции (определяется как тангенс угла наклона полулогарифмических анаморфоз .кинетических кривых). Строят зависимость V/VQ, CTt/n k/ko,гдe Vo, (%)o, kp-M V, начальная скорость восстановления iзондов аскорбатом, время полувос(Становления, константа скорости реакции при отсутствии и в присутствии испытываемого соединения соответст: венно, от концентрации испыт1; ваемого химического соединения. Зная отношение интенсивностей центральных компонент двух спектров ЭПР и v записанных через интервал времени t, можно определить константы скорости реакции k и k ПО номограмме (чертеж). По аналогичной методике было изучено влияние фозалона, пентахлорфеису лята натрия (ПХФ-Na), роннела, лииулона, дилора на структуру эритроцитарной мембраны. В таблице прив едены оцененные значения CCQ для всех исследованных соединений, а также указаны их дозы, вызывающие 50%-ную гибель подопытных животных (ЯДj). , Следует обратить внимание на тот факт, что между величинами Ссл и ЛД50 существует корреляция: чем бопь ше ЛДкп т.е. чем менее токсичным является соединение тем больше CJQ . Это расширяет возможности предлагаэмого способа и позволяет оценивать токсические свойства испытуемых 9 веществ в отношении животных организмов. 85-100 Фозалон Использование в качестве тестобъекта теней эритроцитов животных организмов для определения биологической активности химических соединений имеет следу1рщие преимущества; повышается информативность способа, так Как, с одной стороны, плазматические мембраны эритроцитарных клеток непосредственно взаимодействуют с биологически активными веществами, попадающими в кровь организма из биосферы, а с другой стороны, структурное состояние мембраны является одним из .определяющих факторов функционирования эритроцитов, а значит и организма в целом; тени однородны по составу и относительно легко могут быть получены, можно легко получить инвертированные тени, что дает возможность изучать влияние-химических соединений не только на внешнюю, но и на цитоплазматичёскую поверхность мембраны; тени представляют собой препарат, по существу, не загрязненный компонентами других органелл клетки и ее цитоплазмы. Использование в качестве спиновых зондов нитроксильных радикалов, отличающихся физико-химическими свойствами и локализацией в биомембране, увеличивает чувствительность способа и позволяет получать дополнительную информацию о структурной модификации различных ее областей. Преимущества предлагаемого способа заключаются также в возможности работы с микро