Способ определения популяционной принадлежности командорских кальмаров Советский патент 1990 года по МПК A01K61/00 

Изобретение относится к рыбному , хозяйству, а именно к способам опре- ( деления видовой принадлежности кальмаров, и может быть использовано для организации рационального промысла и воспроизводства вида.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят гомогенат зрительных ганглиев кальмаров, растворы субстрата и ингибиторов. Определяют начальную скорость гидролиза субстрата под действием фермента холинэстеразы (ХЭ) водного раствора гомогената оптических ,ганглиев кальмара, определяют скоростьгидролиза субстрата под действием фермента ХЭ ганглиев в присутствии ингибитора обратимого действия, причем вводят его одновременно с субстратом, после чего определяют остаточную активность в интервале концентраций субстрата 2 10-2-2 -1Q-SM, а определение таксономической принадлежности кальмаров проводят, сопоставляя абсолютные значения конкурентной.константы К,-, бесконкурентной константы К ., обобщенной ингибированной константы К,- и типа торможения с ранее полученными показателями, при этом в случае их различия делают вывод о том,

СЛ

00

ел ел

о

00

что исследуемые кальмары относятся к новой популяции, а в случае совпадения значений считают исследуемых кальмаров принадлежащими к известной ранее популяции.

Пример. Готовят водный гомо- генат оптических ганглиев командорского кальмара (3 мг/мл) из разных частей видового ареала: Центральные Курилы, Олюторо-Наваринского и При- былово-Аляскинского. Готовят следующие растворы: раствор тио-субстра- та-ацетилтиохолинйодида (АТХ) CH3C(0)SHCH2CH7N4CH3)3J, в концен рации 2-10-аМ, 2 10 5М; 0,8%-ный раствор 5,5-дитиобис-(2-нитробензой- ная кислота) (ДТНБ).

О

мог сооч

в 0,2 М фосфатном буфере; растворы ингибиторов: в концентрации 2 М и бис(диметил-триметиламмонийметил- 25 силин)этандихлорид

СН3

СН3 I

(CH9iiH cH1SiCH1-CHas.lceсн}сн3

амидный аналог ацетилхолина

СН ,С(0) NHCH7CH 7N (СНЭ )э пиперазиновое производное ацетштхолина

CHj-LH

CH3C(0)N

, (снэЧ

ОНг -СН1 йодметилат лупинина

7

С&ч

OV4

сульфометилат диэтилметилсульфонил

Н5Са 5-СгНу СН3504

СН

Определяют начальную скорость гидролиза тио-субстрата под действи- ем фермента холинэстеразы (ХЭ) водного раствора гомогената оптических ганглиев кальмара при рН 7,5, для чего в термостатируемую кювету (t « 25°С) вносят последовательно: 0,5 мл 0,8%-ный раствор ДНТБ, 0,1 мл 2 АТХ и 0,1 мл 3 мг/мл водного

Q 5

0

5

0

35

40

45

50

гомогената фермента и 1,2 мл дистиллированной воды до общего объема пробы 2 мл.

Аналогичным образом определяют величину начальной скорости гидролизо- на субстрата при других его концентрациях, внося в пробу 0,4 мл АТХ; 0,2 мл 2 10 JATX; 0,125 мл АТХ и 0,1 мл АТХ.

Величины начальной скорости гидролиза субстрата рассчитывают по

формуле V - (1), где Е - изменение экстинции при 412 нм, t - время в секундах.

Рассчитывают обратные величины концентраций субстрата (1/tS) и соответствующих им скоростей реакции (1/V) и строят график зависимости двойных обратных величин: 1/V от (чертеж, прямая 1).

Далее определяют величину начальной скорости гидролиза субстрата под действием ХЭ в присутствии ингибитора, для чего в кювету вносят последовательно: 0,5 мл 0,8%-ного раствора ДТНБ; 0,2 мл 2-10-7АТХ; 0,5 мл раствора ингибитора; О,1 мл 3 мг/мл водного гомогената и 0,7 мл дистиллированной воды дб общего объема пробы 2 мл.

Определяют величину скорости гидролиза субстрата в присутствии ингибитора по формуле (1).

Аналогичным образом в присутствии ингибитора (0,5 мл 2.) определяется величина скорости реакции при концентрации субстрата 0,4 мл 210 АТХ; 0,2 мл 2 АТХ; 0,125 мл 2 10-3АТХ и 0,1 мл .

Расччитывают аналогично обратимые величины концентраций субстрата 1/tS}H величины скорости реакции 1/V и строят график двойных обратимых величин (чертеж, прямая 2).

Далее проводится расчет обобщенной ингибиторной константы.

Расчет константы пров одят графическим способом. Находят точку пересечения кривой 1 с осью абсцисс и осью ординат. Отрезок, отсекаемый на Ьси абсцисс, равен обратному значению константы Михаэлиса (-„-) ,

Km

а отрезок, отсекаемый на оси орди -3

нат.есть

Ъ,

Откладывают отрезок, равный -

Km

на оси абсцисс в сторону положительных величин, находят точки пересечения этой величины с прямыми 1 и 2 и находят значения проекции этих точек на оси ординат. Отрезок, отсекаемый на оси ординат проекцией с кривой 1„ „ 1

1 - равен - , а с кривой 2

равен Обобщенную ингибиторную константу К. рассчитывают по формуле:

Ki

ЯЧ

(2)

и

i/vn 1/V. 1 1

V- v;

- концентрация ингибитора в пробе (подбирается с таким расчетом, чтобы снижение активности фермента составляло около 50%)}

Значение величин скорости гидро- 15 лиза субстрата () без ингибитора (Cl 0) и в присутствии ингибитора ( 11 6,5 104 М) при различных его концентрациях ( tS) приведены в табл.1.

20 Популяционную принадлежность кальмаров на основании табл. 1 проводят следующим образом.

Проводят сравнение величин рК,- для ХЭ кальмаров из трех частей видоК .

обратная величина максимальной скорости гидролиза суб- 25 ВОго ареала, полученные при их вза- страта в отсутствии ингиби- имодействии с ингибитором 1. Из табл. видно, что величина рК. у ХЭ кальвеличина обратного значения мара из Олюторо-Наваринского района максимальной скорости гидро- значительно превышает значение рК, лиза в присутствии ингибито-30 для ХЭ кальмара из других двух районов обитания.

В табл. 2 представлены критерии различия при сравнении ХЭ ткани оптических ганглиев командорского 35 кальмара из трех частей видового ареала. Если значение различия превышает критерий Стьюдента, равный 5,84, то такие различия считаются достоверными. 40

Значение величины 1/V гидролиза субстрата при различных его концентрациях ( без ингибитора (tl 0) и в присутствии ингибитора 45 (С1 6,5-10 М) приведены в табл.2.

Из табл. 2 видно, что значение рК. для ХЭ кальмара из Олюторо-Наваринского района и ингибитора достоверно отличается от значений рК j для 50 ХЭ из двух других районов для этого ингибитора.

Достоверны также различия ХЭ кальмара из Олюторо-Наваринского района от ХЭ из двух других районов по ве- 55 личинам рК; и рК .. В то же время ХЭ кальмара из района Центральных Курил и Прибылово-Аляскинского района не различаются по величине рК5, рК ( и типу торможения. В данном случае

ра;

1/Vp - величина обратного значения скорости гидролиза субстрата при его концентрации, численно равной значению

. , Кы 1/V. - величина обратного значения

скорости гидролиза субстрата при его концентрации, численно равной Кт, в присутствии ингибитора. Проводят расчет конкурентной К и бесконкурентной К1, констант ингибиро- вания при смешанном типе торможения. Расчет констант К . и К, проводят по калибровочному графику по формулам:

(3)

- 1

(4)

5355036

Для удобства сравнения констант рассчитывают отрицательные десятичные логарифмы констант рК, , рК; g и рК ., где рК - -IgK,- и т.д.

По соотношению величин констант рК; и рК определяют тип торможения; конкуретный (К) (), смешанный (С) pKj - рК ; 1, смешанно-конку- Ю рентный (С - К) (р К - рК 1), не- конкуретный (Н) рК. рК . и неконкурентно-бесконкурентный (Н - Б)

рк pKj).

Значение величин скорости гидро- 15 лиза субстрата () без ингибитора (Cl 0) и в присутствии ингибитора ( 11 6,5 104 М) при различных его концентрациях ( tS) приведены в табл.1.

20 Популяционную принадлежность кальмаров на основании табл. 1 проводят следующим образом.

Проводят сравнение величин рК,- для ХЭ кальмаров из трех частей видо25 ВОго ареала, полученные при их вза- имодействии с ингибитором 1. Из табл. 1 видно, что величина рК. у ХЭ кальдостоверные различия наблюдаются только по величине рК (.

Все перечисленные различия (как по величинам констант, так и по типу торможения) позволяют сделать вывод о различиях в свойствах ХЭ командорского кальмара из трех частей видового ареала, что говорит о существовании нескольких популяций этого вида кальмара в северо-западной части Тихого океана. Анализ его популяцион- ной структуры позволяет дать рекомендации по рациональному вылову командорского кальмара, чтобы не допус- тить полного изъятия отдельных его популяций, которые имеют вид внутривидовых группировок.

Данный способ определения таксономии может быть использован и для других видов кальмара, так как использованные характеристики процесса обратимого торможения являются индивидуальными характеристиками каждой исследованной ХЭ и могут быть использованы для установления популя- ционной структуры других видо кальмаров, где это не позволяет установить традиционными методами.

Константы обратимого торможения УГ мин скорости взаимодействия обратимых ингибиторов с холинэстеразой оптических ганглиев командорского кальмара из различных частей ареала приведены в табл. 3

Критерии различия при сравнении холинэстераз ткани оптических ганглиев кольмара трех районов ареала (критерий Стьюдента равен 5,84) представлен в табл. 4. Формула изобретения

Способ определения популяционной принадлежности командорских кальма

ров, характеризующийся тем, что выделяют оптические ганглии кальмаров, готовят из них водный гомогенат, в него одновременно вводят обратимый ингибитор холинэстераэной активности гомогената с субстратом холин- эстераэы и определяют константы ин- гибирования холинэстераэной активности: К, - обобщенная, К. - конкурентная, К. - бесконкурентная, а для определения популяционной принадлежности командорских кальмаров сопоставляют полученные абсолютные значения констант с ранее известными аналогичных констант для других популяций, при этом в случае их различия делают вывод о том, что исследуемые кальмары относятся к новой популяции а в случае совпадения значений считают исследуемых кальмаров принадлежащих к известной ранее популяции.

20

25 -

Таблица 1

S |при 1 0|при б,

Таблица 2

при(д 0 при « 6,5-КГ м

Формула изобретения

1535503J0

Таблица 3

Центральные Курилы Олюторо-Наваринский Прибылово-Аляскинский

Изобретение относится к рыбному хозяйству, а именно к способам определения видовой принадлежности кальмаров, и может быть использовано для организации рационального промысла и воспроизводства вида. Выделяют оптические ганглии кальмаров, готовят из них водный гомогенат, в него одновременно вводят обратимый ингибитор холинэстеразной активности гомогената с субстратом холинэстеразы и определяют константы ингибирования холинэстеразной активности: K_I - обобщенная, K_I - конкурентная, K_I - бесконкурентная. Для определения популяционной принадлежности командорских кальмаров сопоставляют полученные абсолютные значения констант с ранее известными аналогичных констант для других популяций. В случае их различия делают вывод о том, что исследуемые кальмары относятся к новой популяции, а в случае совпадения значений считают исследуемых кальмаров принадлежащими к известной ранее популяции. 1 ил., 4 табл.

.,.р-:.j«

РК; рК. рК,J Т/Т рК, J рК,1рК; JT/T рК, |рК; 1рК; I Т/Т

1 Г 3,9 3,85 2,89С-К 5.19 5,114,43 .С 34,4 3,39 2,26 С-К (CM KCHj-S, -CHtr(CH3), Z«

СИ,

2 CHjCtoiNMci CH cV.r 2,462,331,88С 3,513,372,93 С 2,962,262,86 Н-Б

CHj-CH,

3 сн,с(о|« N(CH,|S3 2,42 1,75 2,31Н-Б 2,181,432,09 Н-Б 3,383,222,88 С

СИ,-СИ,

СН4ОН

Срг

см,

5,25 5,16 4,23 С 3,07 3,07

Hfci-f -C,4,so; 5Сн}3,77 3,73 2,65 С-К 2,98 2,98

Примечание: рК, « -IgK, и т.д.; т/т I24,2429,79 6,52

II15,43 12,49 16,27

III5,472,22 5,0

IV125,31101,98

V51,7237,5

4,694,77

6,98

18,25 17,62 13,03

4,41,041ь,264,7711,87 2,08

34,8634,118,7428,0912,84 9

4,663,59,2979,5584,86

32,0428,58 -7,597,59

5,32 5,09 4,94 Н

2,74 2,74 тип торможения.

Т а б л и Ц а 4

6,98

18,25 17,62 13,03

/Г7