Способ детекции нуклеиновых кислот Советский патент 1990 года по МПК G01N33/58 

лот определяют по интенсивности окрашивания образовавшегося продукта. Аналогичным образом определяют гомологичные нуклеиновые кислоты после их предварительной гибридизации с меченой), ферментом нуклеиновой кислотой.

Пример 1. Введение гидразид- ной метки в нуклеиновую кислоту.

А. Включение по положению С-4 цитозина. 10 мкг денатурированной ДНК растворяют в 50 мкл воды и добавляют 50 мкл водного раствора ди- гидразида адипиновон кислоты (концентрация 160 мг/мл) в смеси с бисульфитом натрия (380 мг/мл) или водного раствора карбазида (360 мг/ /мл) с бисульфитом натрия (380 мг/ /мл),Реакционную смесь инкубируют 2 ч при 37°С и проводят очистку с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-25.

Б. Включение с помощью фотореагента. 10 мкг ДНК растворяют в 50 мкл воды и добавляют 10 мкл 0,001 М раствора гидразида А-азидо-2-нитробензой ной кислоты. Смесь облучают видимым светом в течение 30 мин и проводят гель-фильтрацию на сефадексе G-25.

П р и м е р 2. ДНК, содержащую - гидразидные группы и контрольную немеченую ДНК, наносят на нитроцеллю лозный фильтр в количестве 1нг-1пг и 25 нг соответственно. Фильтры прогревают 2 ч при 80°С. Далее выдерживают в буфере А (0,01М ацетат натрия, рН 4,3, 0,1% твин-20) в течение . 20 мин и обрабатывают предварительно окисленной или неокисленной пер- оксидазой в течение 10 мин в буфере А без твин-20 при комнатной температуре. Окисление пероксидазы проводят обработкой периодатом натрия (4 мг/мл) в течение 5 мин, после че5

0

5

люлоэный фипьтр с образцами ДНК, гомологичной меченой, нанесенной в количестве 1-20 пг, и негомологичной ДНК (25 пг) обрабатывают буфером 0 Б (0,6 М NaCl, 0,002 мг/мл поливинил- пироллидон, 0,07 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,5, 10 мкг/мл РНК,50% фор- мамид) в течение 1 ч при 37 °С. Далее проводят гибридизацию в буфере Б, содержащем ДНК, меченую- гидрази- дом (пример IA) (100 нг/мл) при 37°С в течение 16 ч. Далее фильтр отмывают буфером В (0,07 М натрий-фосфат, 0,1 М NaCl, 0,5% додецилсульфат натрия, рН 7,5) при комнатной температуре 3 раза по 10 мин и буфером В, содержащим NaCl в концентрации 0,05 М при 48°С в течение 1 ч. Затем фильтры выдерживают в буфере А, содержащем 0,1 М NaCl, в течение 30 мин и обрабатывают ферментом, как описано выше..Чувствительность определения составляет 20-50 пг при отсутствии сигнала на негомологичной

0 ДНК.

П р и м е р 3. Фильтры с нанесен ной ДНК, содержащей гидразидные группы (0,01 пг - 1 нг) и немеченой ДНК - 50 нг, выдерживают в буфере

5 Г (0,1 М ацетат натрия, рН 5,2,

0,5% твин-20) в течение I ч и обрабатывают предварительно окисленной /5-галактозидачой в течение 10 мин в буфере Г без твин-20 при комнатной температуре. Окисление галактозидазы проводят обработкой периодатом натрия (4 мг/мл) в течение 5 мин в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 6,5; реакцию блокируют добавлением глюкозы. Далее фермент очищают гель-фильтрацией. Фильтры отмывают буфером Д (0,1 М натрий-фосфат, рН 7,5) с добавлением 0,05% твин-20 2 раза по 5 мин и однократно буфе0

5

ром Д (5 мин). Добавляют смесь 5-бро мо -4-хлор-3-индолил-галактозид (0,3 мг/мл) и нитротетраэолевый синий (0,4 мг/мл) в буфере Д, Инкубируют 2-4 ч. Чувствительность определения меченой ДНК составляет 0,1 ,пг при отсутствии сигнала на контрольной пробе (50 нг).

Выбор фермента-гликопротеида при использовании способа определяется особенностями решаемых задач и может быть связан с такими характеристиками ферментов, как стоимость, стабильность, размеры, необходимые и доступные субстраты и т.д., а также необходимый и обеспечиваемый уровень чувствительности.

Предлагаемый способ позволяет использовать в качестве метки нуклеиновой кислоты молекулу меньшую, чем биотин примерно в 8 раз. Поскольку гидразид может быть присоединен к нуклеиновой кислоте теми же способами, что и биотин, это уменьшает загрузку меченой нуклеиновой кислоты и, следовательно, изменение ее свойств, а также существенно удешевляет спосо Например, стоимость эквивалентных количеств реагентов при мечении нук- леиновых кислот по положению С-4 ци- тозина с использованием в качестве метки гидразида уменьшается более чем в 100 раз по сравнению с мечени- ем биотипом (каталог фирмы Sigma, США, 1987, сравниваются дигидразид адипиновой кислоты и гидразид биотина). Эффект достигается и вследствие отказа от необходимости использования комплекса стрептавидин- фермент. Так, стоимость конъюгата стрептавидин-пероксидаза и перокси- дазы при одинаковой активности соотносятся как 20:1 (каталог фирмы Sigma, США, 1987). Присоединение стрептавидина к пероксидазе увеличивает молекулярную массу молекулы- детектора в 2,5 раза. Следовательно, в предлагаемом способе молекула-детектор имеет меньшие размеры, что обеспечивает улучшение возможности

Редактор Н.Тупица

Составитель А. Техред М.Ходан

ее проникновения к меченой нуклеиновой кислоте. Это преимущество имеет наибольшее значение при использовании меченых нуклеиновых кислот для гибридизации insitu.

Чувствительность, обеспечиваемая предлагаемым способом, аналогична чувствительности при использовании в качестве метки биотина и конъюгата стрептавидин-пероксидаза для детекции.

Таким образом, предлагаемый способ уменьшает стоимость нерадиоактивного мечения и детекции нуклеиновых кислот и упрощает его, так как позволяет отказаться от использования молекул-посредников (биотина и авидина) и операций по их использованию. Кроме того, улучшает возможности детекции с помощью ферментов при нерадиоактивном мечении, что обусловлено уменьшением молекулярных масс и размеров метки на нуклеиновой кислоте и соединения-детектора. Формула изобретения

Способ детекции нуклеиновых кислот, включающий введение метки в нуклеиновую кислоту, последующую обработку ее ферментом и определение количества образующегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что, с целью упрощения и удешевления способа, в качестве метки используют гидразид общей формулы

R-CO-NH-NH2, где R-NH -NH-; NHz-NH-CO-(CH4)n;

Юг

а обработку проводят ферментом - гли- копротеидом.

Корректор Т.Малец

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике и может быть использовано в других областях биологии и медицины для нерадиоактивного лечения нуклеиновых кислот. Цель изобретения - упрощение и удешевление способа нерадиоактивного лечения и детекции нуклеиновых кислот. Сущность изобретения состоит в том, что в качестве метки к нуклеиновой кислоте присоединяют гидразид общей формулы R - CO - NH - NH₂, где R : HH₂-NH-

NH₂-NH-CO-(CH₂)_N-

N₃ - @ - и для детекции метки проводят обработку модифицированной нуклеиновой кислоты ферментом-гликопротеидом, предварительно окисленным перииодатом натрия с последующим определением образующегося продукта ферментативной реакции.